文摘

客观的。探讨肝细胞癌(HCC)诊断基因生物标记和识别在这个病理免疫细胞的渗透特性。方法。五个基因表达数据集通过基因表达综合门户(GEO)。批处理效果移除后,差异表达基因(度)进行了209年至146年肝癌和控制组织和功能相关性分析。两个机器学习算法用于开发诊断签名。歧视性的能力是衡量AUC的基因签名。的表达水平和诊断价值鉴定生物标记在HCC进一步验证三个独立的外部军团。采用CIBERSORT算法探索肝癌的免疫渗透。这些诊断签名之间进行了相关分析和免疫细胞。结果。375度被确定。GPC3、ACSM3 SPINK1,体内COL15A1、TP53I3 RRAGD, CLDN10被确定为肝癌的早期诊断签名,都是在外部的群组研究中进行验证。AUC的相应结果提出优秀的歧视性的这些功能基因的能力。免疫细胞浸润与这些生物标志物相关分析表明,多种免疫细胞可能参与肝细胞癌的发展。结论。ACSM3,这项研究表明GPC3 SPINK1,体内COL15A1, TP53I3 RRAGD, CLDN10潜在生物标志物与肝细胞癌的免疫渗透。结合这些基因可用于肝细胞癌的早期检测和评估免疫细胞的渗透。还需要进一步的研究来探索他们的角色潜在的肝细胞癌的发生。

1。介绍

肝细胞癌(HCC)是一个高度积极的恶性实体肿瘤和仍然是全世界癌症死亡的主要原因(1]。肝癌的发展是密切相关的感染乙型肝炎病毒(HBV)和丙型肝炎病毒(HCV) (2]。有多种治疗策略不同肝细胞癌的临床特征。移植肝切除术,切除,免疫治疗,动脉化疗,化疗已经表示屈服生存利益(3,4]。其中,手术切除只能在早期HCC患者进行。然而,它的死亡率仍然很高,很大程度上是由于早期肿瘤症状通常无症状和有限的治疗晚期肝癌(个人5]。高发病率和死亡率使肝癌的早期筛查和诊断更加重要。最优治疗治疗早期HCC个体策略包括手术切除和肝移植,和个人完成这些治疗方法通常显示一个有利的结果,五年总生存期(OS)率在60%和80%之间(6]。从临床的角度来看,提高肝癌早期筛查提供治疗治疗的病人更多的机会。因此,开发一个稳定和精确模型的诊断早期肝癌患者将提供一个相当大的对临床结果的影响。目前,超声的应用以及血清α胎蛋白(法新社)是一种常见的非侵入性的方法对肝癌的监督。然而,早期HCC诊断的敏感性和特异性不满意(7]。因此,可靠和健壮的识别诊断生物标记物是紧急治疗肝细胞癌。

随着测序技术的发展以及生物信息学算法,大量的分子特征和基因生物标记已经开发提高诊断和预后预测肝癌患者(8- - - - - -10]。最近,免疫治疗提供了有前途的结果(11]。肿瘤浸润免疫细胞(TIICs)参与的预后和治疗多种癌症类型,包括肝细胞癌(12- - - - - -14]。然而,诊断与免疫细胞浸润相关基因生物标记肝癌仍有限。因此,它仍然是一个伟大的需要确定小说基因生物标记对肝癌的诊断,尤其是早期肝癌,在临床实践中。机器学习(ML)属于人工智能的一个子集,被广泛用于解决预测问题在人类疾病提供了机器学习能力的数据没有给出具体的指令(15,16]。

因此,在这项研究中,我们下载多个大规模数据集被诊断为肝癌的GEO门户和合并成一批后发现队列效果移除。执行差异表达基因(度)分析后,ML算法,包括支持向量machine-recursive特性消除(SVM-RFE)和套索,是应用于屏幕候选人之间的基因诊断HCC和控制。共享基因确定的两种方法在三个外部验证组和验证用于构造早期HCC筛查诊断评分使用逻辑回归方法。然后,假定大量的免疫细胞亚型通过CIBERSORT算法计算。此外,之间的关联基因标记和免疫细胞浸润探索肝癌为未来的研究提供一个参考。

2。材料和方法

2.1。肝细胞癌的数据集

我们搜索和下载五肝癌基因芯片表达谱数据集(GSE121248, GSE45267, GSE65372、GSE51401 GSE14520-GPL571)从GEO门户(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo度分析),这是一个公共功能基因组学数据存储库。多个人群的特点,利用研究提出了在表中1。GSE14520-GPL3921队列包含225肝癌样本和220控制;基因表达数据用于外部验证诊断得分。374肝癌组织和控制基因表达矩阵组织收集的癌症基因组图谱(TCGA)是用于另一个外部验证。产生强大的诊断性能,日本项目从国际癌症基因组协会(ICGC-LIRI-JP)收集RNA-Seq 243肝癌病人和202个对照组的数据作为第三个外部验证队列。接下来,探针的ID在每个队列是注释,根据平台转化为基因符号注释文档,和探测器匹配任何基因符号被排除在外。如果多个探测器匹配相同的基因标志,平均价值是使用价值。的基因表达文件五个数据集(GSE121248, GSE45267, GSE65372、GSE51401 GSE14520-GPL571)被合并成一个发现队列进行后续分析。批处理不同数据集之间影响修正的R包“上海广电”包含“战斗”功能(17]。

2.2。度识别

五个数据集相结合,和批处理效果被使用的“战斗”算法消除。然后,这些数据集是合并成一个发现队列。有209例肝细胞癌患者和146名正常个体群。本研究分析了差异表达基因(度)的“limma”R包通过表达式的比较矩阵的肝癌和控制样品。火山的阴谋策划的度,与阈值的调整 和 统计学意义。

2.3。功能相关性分析

基因本体论(去)进行浓缩和可视化使用“ClusterProfiler”R包。疾病本体(做)浓缩通过实施“ClusterProfiler”和剂量包(18,19]。基因集富集分析(GSEA)寻求执行最重要的监管途径和功能方面之间的肝细胞癌与正常样本20.]。“c2.cp.kegg.v7.0.symbols。格林尼治时间”作为参考基因集。意义的分界点是视为尤其是丰富如果 以及错误发现 。

2.4。识别和验证候选生物标志物

构建一个基于基因诊断评分使用发现队列,两个机器学习算法选择执行疾病状态的预测。LASSO-based算法,这是一个回归分析算法,用于数据降维。套索协变量选择运行,导致预测精度以及通过正则化可解释性。套索实施“glmnet”R包调查变量显著相关肝细胞癌的歧视和控制(21]。支持向量机是一种监督机器学习分类算法,通过预测疾病分类通常利用一个人属于一个特定类的程度(22]。确定最高的组基因歧视的权力,SVM-RFE被用来选择合适的特征基因。两毫升交叉基因识别的程序被用作候选生物标志物,和这些基因的表达值额外确认三个独立的外部数据集。

2.5。特征基因选择和生物诊断得分建设

生物标记物被用于验证模型建设。基于基因诊断得分是通过逻辑回归模型分析发现队列使用以下公式: 。诊断的预测意义的分数是衡量使用接收机操作曲线(ROC)分析。诊断得分在三个外部战友都使用相同的计算公式,分别。ROC曲线生成的基础上,从肝细胞癌和正常组织基因表达的价值发现队列和三个验证军团。AUC采用测量诊断效率区分肝癌与正常样本和验证组进一步验证。此外,诊断的有效性得分确定早期HCC的个体(I期)从控制的另外量化三个验证通过auc军团。

2.6。分析免疫细胞浸润

浸润免疫细胞来源于基因表达矩阵在肝癌发现队列被CIBERSORT计算算法(https://cibersortx.stanford.edu/)。来推断免疫细胞浸润的相对丰度,一套参考22排序类型的免疫细胞亚型(LM22) 1000排列改编23]。R包“corrplot”是用于分析的相关性分析和可视化22种免疫细胞浸润。“vioplot”包在R适应情节小提琴情节和可视化差异之间的免疫细胞浸润肝细胞癌和正常组织。

2.7。调查选择的生物标志物和浸润免疫细胞之间的联系

我们使用CIBERSORT R语言分析的差异渗透22免疫细胞在肝细胞癌和正常组织之间。斯皮尔曼等级相关分析适应获得之间的关系每个诊断基因和免疫细胞浸润和可视化与“ggplot2”包。

2.8。统计分析

套索回归分析是使用“glmnet”R包,实现和支持向量机算法进行了使用“e1071”R包。ROC曲线分析量化诊断的诊断效能得分。所有统计分析使用R软件(版本3.6.1),和一个 被认为具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。预测基因在肝细胞癌的筛查

度进行正常的个人和146 - 209年间HCC患者发现队列后消除了批处理效果(图1(一))。最初,375度被收购,其中包括130年显著调节基因和245年大幅下调基因(图1 (b))。

3.2。功能性浓缩度的分析

去和KEGG分析结果表明,度明显富集在细胞衰老,细胞周期,微管蛋白绑定,有丝分裂纺锤体,有丝分裂核分裂(图2(一个))。此外,功能性浓缩证明度通常是丰富的疾病与非小细胞肺癌、肝硬化,肾癌,胆管腺癌、肾癌、乳腺癌(图2 (b))。GSEA结果显示,改变基因富集在几个常见的途径主要是参与DNA复制、错配修复,蛋白酶体,嘧啶代谢,progesterone-mediated卵母细胞成熟(图2 (c))。这些发现表明,细胞周期和癌症相关的通路在肝细胞癌的发病机制起着关键的作用。

3.3。开发和确认的几种诊断基因Biomarker-Based诊断得分

我们执行两种不同的生物信息学算法筛选肝癌的潜在生物标志物。通过使用套索回归算法,度会缩小到29个变量作为肝癌诊断生物标记(图3(一个))。通过使用SVM-RFE算法,我们确定的一个子集40度(图中基因3 (b))。8重叠功能基因(GPC3、ACSM3 SPINK1,体内COL15A1, TP53I3, RRAGD, CLDN10,和GPR88)终于确认(图3 (c))。此外,为了产生精确和可靠的基因表达的结果,GSE14520-GPL3921数据集,ICGC, TCGA-HILC人群适应检查的表达式值8基因。最后,GPC3的表达式值、ACSM3 SPINK1,体内COL15A1, TP53I3, RRAGD, CLDN10肝癌样本尤其是低于个人控制队列(数字4(一)- - - - - -4 (c);所有 ),GPR88的表达式值在肝癌样本不是大大高于个人GSE14520-GPL3921对照组的数据集和ICGC ( )。因此,七个选定的生物标志物适应构造一个诊断得分通过逻辑回归的过程。后得到的系数通过多元逻辑回归算法,建立了诊断得分。 。因此,分别在四个军团获得诊断的分数。

3.4。诊断HCC的诊断分数的有效性

我们进一步量化歧视能力的ROC曲线下面积(AUC)。作为显示在图5(一个),七个基因分离肝细胞癌的诊断功能的正常组织提供了一个良好的诊断性能,与所有 。考虑诊断的歧视性的能力得分,ROC曲线进行了分析。AUC是0.980 ( ),展示高预测HCC的诊断得分基因签名的效果。seven-gene诊断的可靠性评分三个验证进一步证实军团预测诊断HCC患者的AUC GSE14520验证队列(图0.9625 (b)),AUC ICGC队列(图0.9635 (c)),AUC TCGA-HILC队列(图0.9425 (d)),这表明所确定的基因生物标记物有高和诊断能力强。

此外,我们进一步计算的诊断作用HCC早期诊断得分基因签名(I期)。详细的阶段信息是可用在三个验证军团。令人惊讶的是,早期肝癌的诊断评分显示高辨别力GSE14520验证队列(HCC-stage我与non-HCC, ,图6(一)我与non-HCC), ICGC队列(HCC-stage, ,图6 (b))和TCGA-HILC队列(HCC-stage我与non-HCC, ,图6 (c))。这些结果说明所选择的基因生物标记物提供了一个高诊断肝癌的早期诊断。

3.5。对免疫细胞的渗透

我们研究了免疫细胞在肝癌病例的构成和健康对照组使用CIBERSORT算法。丰富的22个免疫细胞在肝细胞癌和控制样品使用酒吧图(图所示7(一))。CD8的比例⁺T细胞( ),休息CD4记忆⁺T细胞( ),γδT细胞( ),休息NK细胞( ),单核细胞( ),M2巨噬细胞( ),和中性粒细胞( )在肝细胞癌显著低于健康对照组(图7 (b))。然而,调节性T细胞的比例( ),激活NK细胞( ),M0巨噬细胞( ),休息树突状细胞( ),并激活肥大细胞在肝细胞癌明显高于健康对照组(图7 (b))。

3.6。七个基因和免疫细胞浸润之间的联系

展示图8,CLDN10与天真的CD4呈正相关⁺T细胞( , ),CD8⁺T细胞( , ),中性粒细胞( , ),和γδT细胞( , )并与M0负相关巨噬细胞( , ),激活肥大细胞( , ),调节性T细胞( , ),和激活NK细胞( , )。GPC3呈正相关,调节性T细胞( , ),激活CD4记忆⁺T细胞( , ),激活NK细胞( , ),和M0巨噬细胞( , )与静止NK细胞呈负相关( , ),M2巨噬细胞( , ),单核细胞( , ),γδT细胞( , ),和中性粒细胞( , )。与CD8 ACSM3呈正相关⁺T细胞( , ),休息CD4记忆⁺T细胞( , ),M1巨噬细胞( , ),休息NK细胞( , ),γ和δT细胞( , )和天真的CD4负相关⁺T细胞( , ),浆细胞( , ),激活NK细胞( , ),调节性T细胞( , ),和M0巨噬细胞( , )。SPINK1呈正相关,M0体内巨噬细胞( , ),激活NK细胞( , ),和调节性T细胞( , )与单核细胞呈负相关( , ),休息NK细胞( , ),CD8⁺T细胞( , ),γ和δT细胞( , )。COL15A1呈正相关,调节性T细胞( , ),休息树突状细胞( , ),激活NK细胞( , ),和M0巨噬细胞( , )与γδT细胞呈负相关( , ),休息NK细胞( , ),中性粒细胞( , ),和CD8⁺T细胞( , )。TP53I3呈正相关,M1巨噬细胞( , ),休息树突状细胞( , ),调节性T细胞( , ),激活NK细胞( , ),和M0巨噬细胞( , )与γδT细胞呈负相关( , ),休息NK细胞( , ),CD8⁺T细胞( , ),休息CD4记忆⁺T细胞( , ),中性粒细胞( , ),和激活树突状细胞( , )。RRAGD呈正相关,M0巨噬细胞( , ),激活NK细胞( , ),调节性T细胞( , ),浆细胞( , ),和激活肥大细胞( , )与中性粒细胞(呈负相关 , ),休息NK细胞( , ),休息CD4记忆⁺T细胞( , ),CD8⁺T细胞( , ),γ和δT细胞( , )。

4所示。讨论

近年来,许多报道努力证明肝细胞癌的发病机理和pathomechanism。尽管如此巨大的发展对外科手术治疗和药物治疗,肝癌的结果仍不满意。没有强大的诊断方法在早期往往导致可怜的肝癌的进展。因此,发展稳定的预后标志物,揭示肝癌的生物进程将是至关重要的预防和治疗。

在目前的研究中,我们构造了一个综合生物信息学分析来确定诊断基因参与HCC患者免疫细胞浸润。七个潜在的几种诊断基因生物标记(GPC3、ACSM3 SPINK1,体内COL15A1, TP53I3, RRAGD,和CLDN10)被确定为肝癌使用两个机器学习算法。此外,这些候选生物标志物是密切相关的多种免疫细胞。这些功能基因和免疫细胞可能提供新的有前途的肝癌的早期诊断和免疫治疗策略。度被观察到丰富的疾病主要与癌症相关的通路。去和KEGG分析结果表明,度明显富集在细胞周期中,微管蛋白绑定,有丝分裂纺锤体,和有丝分裂核分裂,与肝细胞癌肿瘤疾病高度相关,表明细胞周期施加巨大影响在肝癌的发展和体内平衡。对细胞周期过程是恶性肿瘤的一个特点,并针对CDKs抑制细胞增殖已获批准,成为有用的抗癌疗法(24][25]。异常细胞周期常常伴随HCC致癌作用机制。基于这些发现,我们的研究结果可能对肝癌的治疗目前的潜在目标。

肝细胞癌是一种高度异构恶性实体肿瘤。免疫系统的细胞是不可或缺的监管机构对肿瘤微环境(时间)内稳态。时间由基质以及免疫细胞相互作用或渗透特定癌症(26]。在身上,免疫细胞是肿瘤恶化的关键因素。与此同时,免疫疗法是一种很有前途的tumor-killing方法。免疫细胞的渗透程度可以反映肝细胞免疫治疗的反应,以及不同的预测。然而,尽管免疫疗法对肝细胞癌的发展,结果都不令人满意。免疫细胞浸润和分布是高度异构的和复杂的,和寻找驱动因素免疫渗透或关键生物标记揭示这种异构性是至关重要的。在肝细胞癌中,时间是免疫抑制,导致免疫耐受和逃税通过多个进程,促进癌症扩散,入侵和转移(26]。目前,越来越多的调查表明CD8 +的效应,调节性T细胞CD4细胞⁺细胞,树突状细胞可能影响免疫抑制剂(检查站的有效性27,28]。在现在的研究中,通过使用CIBERSOTR算法,一个伟大的多样性渗透的免疫细胞被发现参与HCC的过程。详细,调节性T细胞,激活NK细胞,M0巨噬细胞,树突状细胞,激活肥大细胞在肝细胞癌组下降。这证据是与我们的结果一般协议多种免疫细胞与这些生物标记,表明大量的免疫细胞是参与肝细胞癌。因此,潜在的基因标志物的相关免疫细胞浸润肝细胞将有助于其诊断和治疗。

GPC3、ACSM3 SPINK1,体内COL15A1、TP53I3 RRAGD,和CLDN10被确定为潜在的新几种诊断生物标记物具有较高的诊断价值,可作为理想的生物标记对肝癌的诊断,以及肝细胞癌的早期阶段。近年来,机器学习已经应用于生物医学的各个领域。与大多数传统的统计方法相比,机器学习的优点是,它可以识别潜在的规则通过大规模数据的学习。机器学习算法已经应用于识别癌症基因和肿瘤预后特征分类(29日]。机器学习是人工智能的一个重要学科,利用程序识别模式在现有数据,和火车本身对其他数据进行预测(30.]。Glypican-3 (GPC3)属于glypican家族的一员,被利用作为一个潜在的诊断生物标记在肝细胞癌(HCC拥有优惠的表达式31日]。GPC3肝癌样本中高度表达比在肝脏良性病变,可能扮演重要的角色在HCC诊断比甲胎蛋白(AFP) (32]。ACSM3肝癌中表达下调,个人很少表达ACSM3悲惨的预后。高表达的ACSM3削弱了肝癌细胞的迁移和入侵在体外和在活的有机体内以及表达下调WNK1和AKT的磷酸化33]。SPINK1高度表达,有助于体内癌症进展在多种癌症,包括肝细胞癌。已经证明,SPINK1增加体内增殖和促进肝癌细胞系的迁移和入侵能力(34]。CLDN10在肝癌细胞中高度表达,越来越多的证据表明,CLDN10功能参与肝细胞入侵和可能是肝癌治疗的目标35]。此外,击倒的CLDN10 siRNA降低肝癌细胞迁移(36]。COL15A1动脉粥样硬化是一种新型的基因参与了血管平滑肌细胞表型,这是由表观遗传状态通过细胞和位于动脉粥样硬化组织(37]。然而,COL15A1在肝细胞癌的诊断和预后作用仍然是未知的。TP53I3, p53诱导基因,是一个oxidoreductase-like蛋白质转录激活的肿瘤抑制TP53、参与TP53-mediated凋亡以及DNA损伤反应(38]。正如我们所知,TP53突变是一个常见的改变在多种癌症,包括肝细胞癌。TP53基因的突变可以产生遗传不稳定和导致癌症恶化[39]。RRAGD编码一个小破布鸟苷三磷酸酶,nutrient-sensing通路的一个重要组成部分,激活mTOR信号(40]。mTOR信号通路之间的关系和肝癌的发病机制已被广泛证实之前(41,42]。

深入评估模型的诊断性能,这个签名是充分验证和评估在多个不同的外部验证数据集,揭示的鲁棒性和可靠性诊断得分。尽管使用生物信息学和机器学习算法在我们的研究和发现的关键基因在肝细胞癌患者的诊断价值,在本研究的几个限制依然存在。首先,从生物信息学分析结果得出结论rt - pcr在临床组织需要额外的验证。除此之外,大部分的基因需要识别在体外和在活的有机体内在肝癌验证实验,进一步证明所提供的一个设计良好的研究是必需的。

5。结论

ACSM3,总之,我们确定了GPC3 SPINK1,体内COL15A1, TP53I3, RRAGD,和CLDN10诊断的几种生物标志物与潜在的临床效用,这可能有能力准确地早期诊断肝癌,使早些时候访问干预,改善临床结果。此外,多种免疫细胞可能参与肝细胞癌的发生和发展,可以作为潜在的目标为未来的HCC患者免疫疗法,值得进一步调查。

数据可用性

多个公开群组数据被用于本研究。本研究中使用的数据从开放地理数据下载数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/;加入数字:GSE14520、GSE45267 GSE51401 GSE65372, TCGA GSE121248),数据门户(https://portal.gdc.cancer.gov/),ICGC数据门户(https://dcc.icgc.org/)。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。