胃肠病学研究和实践

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特殊的问题

药物发现和探索针对肝脏功能障碍的机制

把这个特殊的问题

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体积2022年| 文章的ID4745042| https://doi.org/10.1155/2022/4745042

探索黄芪mongholicus Bunge的机制对非酒精性脂肪肝病基于网络药理学和实验验证

丽丽傅 ,^1、2、3 Zhongming吴 ,² 宿州农村楚 ,^1、2、3 Wenbin陈 ,⁴ 凌高 ,^{2、3、4、5、6所示} Shuminμ ,⁷ 和Jiajun赵 ^{1、2、3、5、6}

学术编辑器: Enfa赵

收到了 09年2月2022年

接受 2022年3月08

发表 05年4月2022年

文摘

客观的。黄芪mongholicus Bunge(豆科)(AMB),一个中国传统医学(中医),已被广泛用于治疗肝脏疾病在诊所。然而,AMB的疗效和机制治疗非酒精性脂肪肝病(NAFLD)尚不清楚。本研究的目的是系统地调查AMB的活性成分和机制对非酒精性脂肪肝基于网络药理学、分子对接和实验验证。方法。首先,生物活性成分和相关目标的AMB筛选中药系统药理学(TCMSP)数据库,并从GeneCards获得NAFLD-related目标数据库。然后,AMB-NAFLD目标蛋白质交互网络是由数据库的字符串。去KEGG数据库通路富集分析使用大卫。组件可以使用Cytoscape目标可视化软件。最后,分子对接和实验用来验证网络药理学的结果预测。结果。网络药理学预测,槲皮素可能AMB的主要活性成分,TNF和MAPK信号通路可能AMB对非酒精性脂肪肝的主要目标。分子对接的验证结果表明,槲皮素,AMB的主要活性成分,与TNF亲和力最高。此外,槲皮素发挥了独特的作用,减轻非酒精性脂肪肝通过体外实验。槲皮素调节AMPK的磷酸化水平,抑制p-MAPK和TNF的表达α。此外,我们进一步发现槲皮素可以增加ACC磷酸化和CPT1α表达PA-induced HepG2细胞。结论。我们的研究结果表明,槲皮素,AMB的主要活性成分,会产生一个anti-NAFLD效应调控AMPK / MAPK / TNF -α和AMPK / ACC / CPT1α信号通路抑制炎症和缓解脂质积累。

1。介绍

非酒精性脂肪肝病(NAFLD)是指过多的脂质沉积在肝细胞已成为全球慢性肝病的主要原因,成人患病率为25% (1,2]。非酒精性脂肪肝有广泛的肝脏病理特征,从简单的非酒精性脂肪肝炎肝脂质积累(纳什),甚至发展为肝硬化和肝细胞癌。由于这个进步的功能,甚至非酒精性脂肪肝患者简单的脂肪变性可能最终导致全因死亡率的增加(3]。多个平行的打击已经广泛用于解释非酒精性脂肪肝的发病机制,包括炎症、胰岛素抵抗、氧化应激(4]。非酒精性脂肪肝已成为全球公共卫生问题不容忽视。不过,目前没有通过药物来治疗非酒精性脂肪肝。注意健康的饮食和有规律的锻炼是主要的非酒精性脂肪肝的治疗方法,但是很少有追随者成功(5]。因此,发展与临床治疗潜力的天然产物具有重要意义,近年来受到社会广泛的关注。

黄芪mongholicus Bunge(豆科)(ABM)是一种使用最广泛的中药(中药)在诊所和广泛分布在东北、北部,西北中国在蒙古和韩国(6]。AMB的根源(豆科)是药用和已被用于许多年中医治疗慢性疲劳、虚弱、贫血、食欲不振、子宫出血、子宫脱垂(7]。现代药理证实,该草本拥有各种各样的活动,包括调节免疫(8,抗炎9),抗氧化剂(10),和降糖药9)活动。到目前为止,据报道,已经有超过100种化合物分离和识别在AMB,如皂甙、黄酮、多糖、氨基酸和微量元素与各种生物活性(11]。先前的研究表明,AMB拥有王亚南效果。例如,黄琦圣对改善血糖有显著影响,在高脂大鼠脂质代谢和肝脂肪变性(12]。尽管有广泛的研究努力,AMB的主要活性成分及其anti-NAFLD机制迄今为止还不清楚。

由于多组分和多目标的特点,传统的实验方法不能系统地解释中药的药理机制。因此,我们采用网络药理学分析基于生物信息学和系统生物学进行研究[13]。网络药理学系统地揭示了复杂的药物和疾病之间的关系通过构建生物网络和可视化网络分析潜在的活性成分,关键目标,信号通路,和疾病14]。这是一个强大的工具来提高药物疗效和加速药物的研究和开发。网络药理学的整体和系统的特性是一致的与中医的整体观念和辨证论治的原则。分子对接是一种计算方法,用于研究分子之间的相互作用(15]。绑定模式的目的是预测小分子药物和大分子蛋白质。也常用来验证网络药理学的预测的准确性。

在这项研究中,我们第一次预测反弹道导弹的生物活性化合物和机制改善非酒精性脂肪肝基于网络药理学。然后,利用分子对接技术和实验验证上述结果的可靠性和准确性。据我们所知,这个研究第一次揭示AMB的效果和机制对非酒精性脂肪肝基于网络药理学、分子对接和实验验证。本研究提供一个理论依据进行AMB治疗非酒精性脂肪肝。工作流图所示1。

2。材料和方法

2.1。筛选活性成分和AMB的目标

AMB的相关化学成分从中药获得系统药理学数据库(TCMSP,http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)。然后, %, 被定义为重要ADME-related药代动力学参数识别有效成分在AMB [16]。OB是指到达血液循环的药物口服后(17]。DL代表组件之间的相似性和已知的药物,可以优化药物动力学(18]。随后,上述compound-related蛋白质筛选目标在TCMSP搜索。

2.2。预测NAFLD-Related目标

从GeneCards NAFLD-related目标获得的信息数据库(https://www.genecards.org/),一个功能全面的数据库,其中包含基因组学、蛋白质组学、转录组(19]。“非酒精性脂肪肝病”被选为一个关键字搜索疾病后续研究的目标。维恩图是基于交叉AMB和非酒精性脂肪肝的目标。

2.3。蛋白质相互作用网络建设(PPI)

PPI网络构建了基于字符串的数据库(https://string-db.org/)。它的功能是在视觉上呈现出直接或间接蛋白质间的相互作用。首先,常见component-disease目标是进入数据库的字符串和选择范围内的“智人”。PPI信息出口在制表符分隔值(TSV)格式有信心得分0.4。然后,TSV格式的结果导入到Cytoscape(版本3.7.2章;https://www.cytoscape.org/)软件可视化蛋白质相互作用。

2.4。网络建设

Cytoscape 3.7.2章软件可以用来生成一个可视网络反映活性化合物之间的相互作用,潜在目标,途径(20.]。网络是由点和线组成的。节点代表活性成分,目标,或通路,线表示它们之间的相互作用(14]。

2.5。去和KEGG浓缩途径分析

基因本体论(去)知识库和京都基因和基因组的百科全书(KEGG)通路富集分析常见的AMB-NAFLD目标进行使用大卫数据库(https://david.ncifcrf.gov/,版本。6.8)。分析被用于基因功能分类分析,包括生物过程(BP)、分子功能(MF)和细胞组件(CC)。一个值< 0.05用于进一步分析。

2.6。分子对接的验证

验证绑定相似成分的目标,用七弦琴AutoDock 1.5.6进行分子对接。(21]。首先,槲皮素,AMB的主要成分,是作为配体。PPI网络的主要目标包括AKT1、白细胞介素6、TNF, TP53, PTGS2, CXCL8, MAPK8, MMP9,和CASP3用作蛋白受体。一方面,为小分子化合物组件(AMB)化合物,他们的二维结构(SDF格式)从PubChem下载数据库(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)。然后,自卫队格式转化为PDB格式通过最小化能量使用ChemBio3D软件。最后,他们在PDBQT预处理和保存格式对接配体在AutoDock工具软件。另一方面,对蛋白质受体,获得他们的x射线晶体结构的蛋白质数据库(PDB) (https://www1.rcsb.org/),包括AKT1 (PDB ID: 1 unq)、白细胞介素6 (PDB ID: 6 mg1)、肿瘤坏死因子(PDB ID: 6 q00), TP53 (PDB ID: 4 cz5),小君(PDB ID: 6 osn), PTGS2 (PDB ID: 1 pxx), CXCL8 (PDB ID: 4新,MAPK8 (PDB ID: 2 xrw), MMP9 (PDB ID: 6 esm),和CASP3 (PDB ID: 2 dko)。后来,溶剂和有机蛋白质受体被使用PyMOL软件并通过AutoDock pdbqt格式转换工具(22]。最后,确定网格框的位置,并使用七弦琴AutoDock分子对接结果可视化。配体和蛋白质之间的绑定活动被七弦琴评估分数;比得分越低,亲和力越高。对接结果被PyMOL可视化软件。

2.7。化学药品和试剂

槲皮素(C15H10O7, CAS No。117-39-5,猫没有。A0083)从成都必须购买生物技术有限公司(中国成都)。槲皮素的纯度> 98%,保持在4°C受光照和冷藏。棕榈酸(PA)溶解在乙醇和混合脂肪无酸的牛血清白蛋白(BSA)股票的解决方案做准备。AMPK抑制剂化合物C (P5499)从Sigma-Aldrich购买。

2.8。细胞培养和治疗

HepG2细胞培养在含10%胎牛血清的DMEM(的边后卫)和1% 100 U /毫升penicillin-streptomycin 37°C公司5%₂的气氛。体外模拟非酒精性脂肪肝模型,HepG2细胞生长在培养基含有棕榈酸(PA)的浓度为0.4毫米。实验分为三组:对照组(BSA + DMSO), PA组(0.4毫米PA + DMSO)和PA +槲皮素组(0.4毫米PA + 25μ米槲皮素)。整体的实验时间是24小时。此外,HepG2细胞培养在没有或化合物的C (20μ米)来验证槲皮素特异性的AMPK激活。

2.9。细胞脂质含量测定

肝细胞TG内容量化使用商业套装(Applygen技术有限公司,北京,中国)。实验操作都是按照制造商的指示执行。此外,油红O染色也用于评估细胞内脂质积聚。这些细胞被固定在10%多聚甲醛,然后染色屏蔽。所有病理图像使用光学显微镜观察。

2.10。定量实时聚合酶链反应

总RNA分离使用RNAiso +从细胞培养试剂(豆类)根据制造商的指示。使用PrimeScript RT执行反转录试剂盒(豆类)。实时PCR进行罗氏LightCycler 480(罗氏,曼海姆,德国)使用SYBR绿色(Bestar qPCR Mastermix, DBI,德国)。2相对基因表达水平进行了计算^{- - - - - -△△CT}方法和结果表示为褶皱变化相对于控制。使用的PCR引物如表所示1。

2.11。免疫印迹分析

从HepG2细胞总蛋白提取使用蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂(美国休斯顿Bimake)。蛋白质浓度测定用BCA蛋白质定量分析工具。目标蛋白质与以下抗体:涂抹anti-phospho-p38 (CST, 4511), anti-p38 (CST, 9212), anti-phospho-ERK (CST, 4376), anti-ERK (CST, 4695), anti-phospho-JNK (CST, 4668), anti-JNK (CST, 9252), anti-phospho-AMPK (CST, 2535), anti-AMPK (CST, Thr172 2532年代),anti-phospho-ACC (CST, Ser79, 11818), anti-ACC (CST, 3662), anti-CPT1α(Abcam ab128568), anti-GAPDH (Proteintech 60004 - 1 - ig)。适当的二次抗体结合辣根过氧化物酶(合)(Amersham,小都美元,英国)使用1:5000稀释。一个α问检测系统用于可视化主要抗体。

2.12。统计分析

数据呈现的 (SD)。在GraphPad Prism 8.0软件进行统计分析。单向方差分析(方差分析)进行检查多个组之间的差异。一个值< 0.05被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。AMB的活性化合物和目标

从TCMSP获得八十七AMB的组件。根据筛选的标准 %, ,20活性成分AMB终于获得了后续研究和分析(表2)。然后,450活跃component-targets AMB筛选使用TCMSP数据库,和202年component-targets终于确定后删除复制(补充表S1)。阐明直观AMB的组件之间的交互,他们的目标,我们构建了一个compound-target网络使用Cytoscape 3.7.2章(图2(一个))。网络包含219个节点和465的边缘,这意味着一种化合物可以对应多个目标。前三个活性成分槲皮素、山柰酚、7-O-methylisomucronulatol对应于142年,61年,分别和44个目标。网络建议这些组件可以作为主要治疗AMB anti-NAFLD的成分。

(一)

(b)

(c)

(d)

图2

Compound-target网络建设。(一)component-target AMB的网络。橙色三角形代表活性化合物,绿色节点代表组件的目标。(b)文氏图。橙色代表一部分AMB的数量目标,和绿色的部分代表非酒精性脂肪肝的数量目标。(c) Compound-NAFLD目标网络。圆形节点代表AMB的潜在活性成分,和广场代表着99 AMB的共同目标和非酒精性脂肪肝。(d)程度的潜在的活性化合物。

3.2。潜在目标,在Anti-NAFLD AMB的活性成分

总共1674 NAFLD-related蛋白质目标从GeneCards下载数据库(补充表S2)。此外,202年的活性成分与NAFLD-related AMB的目标分割的目标。最后,99年共同的目标是获得和维恩图解的形式所示(图2 (b)和补充表S3)。上面提到的99年共同的目标可能是治疗非酒精性脂肪肝的关键潜在目标。

识别的主要anti-NAFLD AMB的有效成分,我们构建了一个component-NAFLD目标网络(图2 (c))。圆形节点代表AMB的潜在活性成分,和广场代表着99 AMB的共同目标和非酒精性脂肪肝。节点面积越大,颜色越深,表明更重要的组件。如图2 (d)槲皮素(MOL000098)最高学历,这表明槲皮素可能是最重要的活性成分对非酒精性脂肪肝AMB。

3.3。PPI网络分析

蛋白质-蛋白质之间的关系进行评估,99年共同的目标是上传到数据库的字符串。然后,Cytoscape 3.7.2章被用来建立一个视觉PPI网络(图3)。有97个节点,1476 PPI网络的边缘。越来越深的颜色节点,密集的线表明蛋白质才是更重要的。最后,10个中心目标筛选根据中间性(BC),和亲密(CC)值。(23AKT1)十大目标,白细胞介素6、TNF, TP53, PTGS2, CXCL8, MAPK8, MMP9, CASP3(表3)。这些目标可能是AMB治疗非酒精性脂肪肝的主要目标。值得注意的是,这些关键目标是预测主要来自槲皮素。

3.4。去富集分析

阐明生物功能的治疗目标,99年通用组件目标是上传到大卫数据库。总共有486去丰富根据参数的值( )。其中,383条款生物过程(BP)(补充表S4),40条款蜂窝组件(CC)(补充表S5),63条款的分子功能(MF)(补充表S6)。前十名去英国石油(BP)、MF、CC(图所示4(一))。

(一)

(b)

3.5。KEGG通路富集分析和Compound-Target-Pathway网络建设

进一步探索AMB的信号通路对非酒精性脂肪肝,我们执行KEGG通路富集分析基于99通用组件的目标。后删除无关的广谱通路(24),我们确定了基于一个排名前20位的途径值< 0.05(图4 (b))。数据分析表明,目标明显富集在多个通道,如肿瘤坏死因子信号通路、MAPK信号通路,非酒精性脂肪肝病(NAFLD)和toll样受体信号通路。最重要的是丰富了通路是肿瘤坏死因子信号通路。

此外,进一步系统地阐明AMB的分子机制与非酒精性脂肪肝,前20名大大丰富了通道,相应的目标,和组件被用来完成component-target-pathway网络(图5)。图形面积的大小成正比的程度值。槲皮素展品最多的基因,被认为是最代表AMB中活性成分。TNF和MAPK信号通路都大大丰富了相应的目标。总的来说,这些结果表明,AMB在非酒精性脂肪肝的治疗效果是多目标和multipathway的方式实现。

3.6。分子对接的验证

进一步验证对ANFLD AMB的潜在目标,10 PPI的中心基因筛查与槲皮素分子对接分析。十大重点AKT1基因,白细胞介素6、TNF TP53, PTGS2, CXCL8, MAPK8, MMP9, CASP3。结果如表所示4。关联的值是一个重要的参数来评估受体和配体之间的结合强度。亲和力值越低,越强的约束力。一般来说,一个亲和千卡每摩尔表示良好的亲和力,一个亲和分数值千卡每摩尔表示强的粘附受体的配体。结果表明,槲皮素停靠与所有关键目标,也说明了网络药理学的准确性。此外,槲皮素亲和力与TNF最高(-8.3千卡每摩尔),虽然它有第二个和第三个最高的亲和力与白细胞介素6 PTGS2(-7.6和-7.5千卡每摩尔)。因此,上述结果表明,肿瘤坏死因子将AMB对非酒精性脂肪肝的最重要目标。此外,3双对接分数最高的选择3 d可视化(图6)。槲皮素与肿瘤坏死因子主要通过氢键相互作用发生ser - 65(图6(一))。槲皮素与il - 6主要通过氢键与参数- 295,arg dt - 106, - 289(图6 (b))。槲皮素和PTGS2发生主要通过氢键的相互作用参数arg - 1061和- 1044(图6 (c))。此外,网络药理学证实了分子对接的精度。

(一)

(b)

(c)

3.7。槲皮素展品Anti-NAFLD效果PA-Induced HepG2细胞

研究槲皮素对非酒精性脂肪肝的影响,与槲皮素(25 HepG2细胞治疗μ米)的存在与否PA为24小时(0.4毫米)。PA-induced HepG2细胞被用作非酒精性脂肪肝模型。细胞内TG含量结果表明PA组TG含量明显高于对照组。然而,槲皮素治疗显著降低细胞内TG水平(图7(一))。槲皮素的影响在减轻脂质积累HepG2细胞进一步证实了油红O染色(图7 (b))。总之,这些研究表明,槲皮素会产生一个anti-NAFLD效应在PA-induced HepG2细胞。此外,这些结果进一步强调,槲皮素对非酒精性脂肪肝AMB的主要活性成分。

(一)

(b)

图7

Anti-NAFLD槲皮素的影响在PA-induced HepG2细胞。(一)TG含量HepG2细胞处理DMSO溶液或25μM槲皮素对BSA或0.4毫米PA刺激24 h ( )。给出的数据。和。(b)油红O染色显示,PA诱导脂质积累,抑制槲皮素治疗后24 h在HepG2细胞( )。

3.8。槲皮素抑制炎症的调控AMPK / MAPK / TNF -α信号通路

对非酒精性脂肪肝探索AMB的机制,我们首先测试的想法TNF可能非酒精性脂肪肝的主要治疗目标预测的网络药理学和分子对接。实时qPCR结果表明PA显著增加TNF -α信使rna表达,槲皮素显著降低PA-induced TNF -αmRNA水平HepG2细胞(图8(一个))。

(一)

(b)

(c)

图8

槲皮素抑制炎症的调控AMPK / MAPK / TNF -α信号通路在PA-induced HepG2细胞。(一)qPCR分析TNF -αmRNA水平HepG2细胞刺激通过0.4毫米PA DMSO溶液或25μ24 h M槲皮素( )。(b)免疫印迹分析p-AMPK, AMPK, p-p38, p38, p-ERK, HepG2细胞ERK p-JNK,物水平刺激PA与槲皮素( )。(c)的灰度值分析p-AMPK / AMPK, p-p38 / p38 p-ERK / ERK和p-JNK /物。给出的数据。和。

肿瘤坏死因子-α是由MAPK信号通路(25,26]。此外,MAPK信号通路被认为是最高的一个重要途径KEGG浓缩富集基因数量分析。因此,我们调查了槲皮素是否影响MAPK信号通路的表达。与先前的报道一致,PA治疗增强p-p38的表达,p-ERK, p-JNK。然而,这个表达式槲皮素治疗后趋势逆转。没有观察到显著变化总p38,兵,或者物的水平。此外,我们发现槲皮素调节AMPK的磷酸化水平。确定AMPK活化抑制MAPK的表达,我们应用了AMPK抑制剂化合物C PA-induced HepG2细胞。槲皮素的抑制作用MAPK通路已经被复合C(数字8 (b)和8 (c))。在一起,这些数据表明,AMPK / MAPK / TNF -α信号通路参与槲皮素的抗炎效应PA-induced HepG2细胞。

3.9。槲皮素减轻脂质积累的调控AMPK / ACC / CPT1α信号通路

进一步阐明槲皮素的机制减轻脂质积累,我们检测到蛋白的表达与脂肪酸有关β氧化途径。乙酰辅酶a羧化酶(ACC)是一个直接衬底AMPK,和槲皮素治疗后增加的磷酸化水平。槲皮素也显著增强CPT1水平α。然而,upregulation p-ACC CPT1α废除了复合C(图9)。总之,这些结果表明,槲皮素减轻脂质积累通过激活AMPK / ACC / CPT1α信号增加脂肪酸β氧化。

(一)

(b)

图9

槲皮素增加脂肪酸β氧化通过调控AMPK / ACC / CPT1α信号在PA-induced HepG2细胞。(a)的蛋白表达水平p-ACC, ACC和CPT1α通过免疫印迹分析检查HepG2细胞( )。(b)的灰度值分析p-ACC, ACC和CPT1α。给出的数据。和。

4所示。讨论

非酒精性脂肪肝是一种进步的疾病。非酒精性脂肪肝是指简单的肝脏脂肪变性,这常常发生在疾病的初期阶段。纳什被定义为一个更严重的过程伴随着炎症和肝细胞损伤,最终可发展为肝硬化和肝癌(27]。非酒精性脂肪肝的发病机制的复杂性导致治疗的重大挑战。目前没有相关治疗非酒精性脂肪肝FDA批准的药物(28]。到目前为止,治疗的目标集中在改善胰岛素抵抗,降低脂质沉积,减少炎症反应。据相关报道,AMB展览优秀的王亚南功效在临床治疗通过减轻炎症和抗氧化剂6]。然而,反弹道导弹对非酒精性脂肪肝的生物活性成分和药理机制还没有完全阐明由于其多组分和多目标特性。网络药理学屏幕了许多中药活性成分和全面预测多个目标和途径通过构建一个系统性的网络(29日]。因此,在本研究中,我们旨在探索AMB的活性成分和机制改善非酒精性脂肪肝通过整合网络药理学、分子对接和实验验证。

首先,网络药理学预言反弹道导弹有能力改善非酒精性脂肪肝,这效果密切相关的规定TNF -α和MAPK信号通路。具体来说,20活性成分AMB和202组件从TCMSP数据库目标筛选。component-target价值根据拓扑网络,三大组件在AMB槲皮素、山柰酚、7-O-methylisomucronulatol,表明他们是AMB anti-NAFLD的关键部件。槲皮素被认为是组件相关程度最高的几个非酒精性脂肪肝的目标。因此,槲皮素被选为最具代表性的组件AMB的随访研究。研究表明,槲皮素可以保护肝脏,促进肝VLDL大会(30.]。此外,槲皮素改善非酒精性脂肪肝引起2型糖尿病,以恢复肝酶异常,降低肝脏脂质沉积在db / db老鼠31日]。此外,槲皮素不仅改善肝脏脂肪变性,也减轻肝纤维化。促炎因子和纤维发生的基因的表达减少(32]。尽管许多研究,但anti-NAFLD机制仍然是模棱两可的。

其他化合物研究,证据表明,CYP2b9 Cyp4a12b, Mup17, Mup7, Mup16通过整合为纳什山柰酚处理的差异表达基因转录组和代谢组学33]。同样,研究已经证实,山柰酚可以有效地减轻肝纤维化的形成和发展有选择地绑定受体激酶5和表达下调TGF -β1 / Smad通路(34]。一般来说,几个AMB的主要活性成分有不同程度的治疗对非酒精性脂肪肝的影响。

PPI网络分析表明,反弹道导弹的关键基因与非酒精性脂肪肝主要是与炎症相关的因素。99普通component-disease目标的相关性提出了PPI网络,其中10中心AKT1基因,白细胞介素6、TNF, TP53, PTGS2, CXCL8, MAPK8, MMP9, CASP3。这些基因在葡萄糖和脂类代谢发挥重要作用,炎症反应和细胞凋亡。与此同时,PPI网络显示99共同的目标并不是独立的而是相互作用,这表明AMB治疗非酒精性脂肪肝通过调节多种蛋白质。

KEGG富集分析表明反弹道导弹可能发挥anti-NAFLD效应通过调节炎症和代谢相关通路,如肿瘤坏死因子信号通路、MAPK信号通路,toll样受体信号通路,PI3K-Akt信号通路,胰岛素抵抗,nf -κB信号通路,AMPK信号通路,和其他信号通路。肝脂质积累是最初的非酒精性脂肪肝的病理特点,从而导致炎症,氧化应激,最终肝癌在缺乏有效的干预措施(35]。在这里,我们选择的路径具有良好的相关性,讨论AMB治疗非酒精性脂肪肝的机制。肿瘤坏死因子信号通路是最重要的是丰富了通路,并通过分子对接结果进一步验证。近年来,作为一种方便、有效的新兴技术,分子对接是常用来预测组件之间的约束力和目标。这些结果表明,肿瘤坏死因子信号通路可能是一个潜在的有效的目标对非酒精性脂肪肝AMB通过网络药理学分析和分子对接。

进一步验证结果预测的网络药理学、体外实验进行。首先,与PA HepG2细胞诱导形成一个非酒精性脂肪肝模型。非酒精性脂肪肝肝细胞过多的脂质沉积,主要是甘油三酸酯(36]。我们的体外实验结果表明,槲皮素显著降低甘油三酸酯含量HepG2细胞,这是进一步支持油红O染色。基于上述证据,我们相信槲皮素在改善非酒精性脂肪肝的发病中扮演重要角色。

接下来,我们检查AMB的机制与非酒精性脂肪肝。过度在肝细胞脂质积累初期非酒精性脂肪肝的病理特征。过多的脂肪酸产生lipotoxic物种,导致inflammasome激活,氧化应激和ER应激。炎症,在NASH的发病机制中起着至关重要的作用,可以促进肝纤维化的进展到肝硬化4]。在这项研究中,我们发现TNF -α信使rna水平也显著减少了槲皮素治疗相比PA组。肿瘤坏死因子是一种炎性细胞因子与多种生物效应,包括促进细胞生长、分化、凋亡和诱导炎症(37]。肿瘤坏死因子由TNF -α巨噬细胞分泌TNF -β由T淋巴细胞,肿瘤坏死因子-α占到总成本的70%到95%的活动(38]。肿瘤坏死因子-α是促进的加速器的发展最终性脂肪肝和肝纤维化肝脂肪变性。包括52名肥胖病人的一项研究表明,肝脏肿瘤坏死因子-α在纳什病人mRNA水平高于对照组。接下来,纳什患者进一步分类根据纤维化的存在与否。发现肝脏肿瘤坏死因子-αmRNA表达NASH患者肝纤维化是比在NASH患者纤维化。此外,肿瘤坏死因子-α信使rna表达在纳什的脂肪组织炎症患者明显升高(39]。另一项研究显示,肿瘤坏死因子-α可以激活星状细胞,加快纳什的进展。此外,肿瘤坏死因子也促进了胰岛素抵抗,最终导致非酒精性脂肪肝患者(增加肝脂肪变性40]。因此,肿瘤坏死因子——的发展α非酒精性脂肪肝抑制剂可能是一种有效的治疗策略。在一个实验中,纳什模型小鼠的腹腔内注射英夫利昔单抗。因此,anti-TNF -α减少AST和ALT水平和改善肝脏炎症、坏死、纤维化相比对照组腹腔注射无菌生理盐水(41]。同样,另一项研究表明,HFD-induced小鼠接受注射英夫利昔单抗肝脏较低水平的il - 6、il - 1β,比HFD模型小鼠il - 10。此外,英夫利昔单抗也改善胰岛素抵抗和抑制肝脏脂质沉积和纤维化42]。,以上结果证实肿瘤坏死因子是一个关键的目标AMB治疗非酒精性脂肪肝,也证实了网络药理学和分子对接技术的准确性。

有趣的是,我们还发现槲皮素表达下调MAPK信号通路的表达,包括ERK p38和物。MAPK信号通路密切相关,细胞生长、分化、凋亡、炎症和由细胞外signal-regulated激酶(ERK),小君n端激酶(物),和p3843,44]。MAPK信号通路已经吸引了广泛关注由于其参与调节多种基因的表达与非酒精性脂肪肝相关。肝脏脂质沉积、炎症和纤维化可以提高通过抑制MAPK通路在HFD-induced老鼠45]。AMB提取物可以有效地抑制il - 1的分泌和表达β和肿瘤坏死因子-α在巨噬细胞。机制密切相关的规定p38 MAPK和NF -κB信号通路(46]。此外,MAPK信号通路与最多的另一个重要途径丰富基因KEGG富集分析。

此外,在目前的研究中,我们发现槲皮素可以增加AMPK磷酸化水平和槲皮素的抑制作用在MAPK信号通路被废除的AMPK抑制剂化合物C PA-induced HepG2细胞。这些结果表明,AMPK信号通路调节MAPK的表达,MAPK AMPK的下游蛋白质。此外,先前的研究已经表明TNF -α可以通过MAPK信号通路被激活(47]。总之,这些数据表明,槲皮素可以通过调控AMPK / MAPK /改善非酒精性脂肪肝TNF -α信号通路,抑制炎症反应。

除此之外,我们进一步探讨槲皮素改善脂质代谢的机制,因为槲皮素减轻脂质积累HepG2细胞,也是符合文献报道[31日,48]。肝脂质沉积脂肪生成和脂类分解之间的失衡造成的。线粒体脂肪酸β氧化脂类分解加速,这有助于减少肝细胞脂质沉积。AMPK被认为是一个关键因素,调节能量代谢体内平衡,和AMPK信号通路激活已被证实对非酒精性脂肪肝有保护作用[49]。ACC催化malonyl-CoA的生产,这是一个变构抑制剂CPT1 [50]。磷酸化的ACC ACC AMPK灭活,这增强了活动CPT1和脂肪酸β氧化。在我们目前的研究中,槲皮素治疗显著增加AMPK和ACC磷酸化水平,抑制ACC活动,最终,CPT1的表达α是调节。然而,这种效应被废除的AMPK抑制剂化合物完全c,槲皮素减轻肝脏脂质积累提高脂肪酸β通过激活AMPK氧化/ ACC / CPT1α信号通路在PA-induced HepG2细胞。

然而,目前的研究有一些局限性。首先,尽管槲皮素被认为是AMB的主要成分被证明有一个anti-NAFLD效应,它不能完全代表AMB。因此,阐明AMB治疗非酒精性脂肪肝的机理,进一步的实验是必不可少的。其次,本研究只是确认了槲皮素在体外对非酒精性脂肪肝的效果和机理。因此,还需要进一步的体内实验和临床试验来验证我们的结论。

5。结论

总之,本研究采用一个集成的策略,结合网络药理学、分子对接,实验验证来说明小说AMB的非酒精性脂肪肝的治疗机制。我们的研究结果显示,槲皮素,AMB的主要活性成分,可以抑制炎症反应,增强脂肪酸β氧化,减轻肝脏脂质积累通过AMPK / MAPK / TNF -α和AMPK / ACC / CPT1α信号通路发挥其anti-NAFLD效果(图10)。这个发现不仅提供了一个科学依据揭示AMB的分子机制在非酒精性脂肪肝的治疗也表明anti-NAFLD小说有前途的治疗策略。

图10

槲皮素会产生一个anti-NAFLD效应调控AMPK / MAPK / TNF -α和AMPK / ACC / CPT1α信号通路抑制炎症,增强脂肪酸β氧化。激活AMPK的槲皮素的差别会导致对这些MAPK信号通路和降低TNF的表达α,这可能有助于减轻炎症。此外,phospho-AMPK磷酸化ACC,病原脂肪从头合成的酶。这种减少ACC活动限制丙二酰辅酶a生产、减轻CPT-1的抑制α活动,增强脂肪酸β氧化。

数据可用性

最初的贡献提出了研究中都包含在这篇文章/补充材料,并进一步调查可以直接到相应的作者。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

研究的设计是由JJZ,多发性骨髓瘤,里夫,这项研究是由里夫,和技术援助是由ZMW, YJC,白细胞和LG。所有作者阅读和批准最终的手稿。

确认

这项工作是支持的项目的“特殊疾病中西医综合建设山东省卫生和计划生育委员会”(2019 - 2021),中国国家自然科学基金(82070819)、山东省自然科学基金(ZR2020MH103)和济南科技计划(201907038)。

补充材料

表S1:生物活性成分和相应的反弹道导弹的目标。表S2:从GeneCards NAFLD-related目标收集的信息数据库。表S3:反弹道导弹的共同目标和非酒精性脂肪肝。表S4: 383年的生物过程。表S5: 40蜂窝组件的条件。表S6: 63年的分子功能。(补充材料)

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