血清液来自肠易激综合症患者增加细胞渗透性通过调节mir - 148 b - 5 - p / RGS2信号在人类结肠上皮细胞

文摘

目的。肠易激综合征(IBS)是一种多因子的功能性肠道疾病的特点是肠道屏障的破坏。循环exosomal小分子核糖核酸(microrna)参与调节上皮屏障功能,和upregulation mir - 148 b - 5 - p在IBS被发现。然而,exosomal mir - 148 - 5 - p是否参与IBS的发病机制仍不清楚。本研究旨在调查的关系exosomal mir - 148 - 5 - p与结肠上皮通透性。方法。液分离血清的IBS患者和健康对照组。HT-29细胞培养与IBS-derived血清液(IBS-exo)。外来体吸收试验被用来评估是否IBS-exo可以吸收HT-29细胞。FITC-Dextran通量和transepithelial /内皮电阻测量评估上皮通透性。荧光素酶记者分析是用来确定G蛋白信号的监管机构——(该公司)2是一个目标基因mir - 148 b - 5 - p。结果。mir - 148 b - 5 - p在IBS-exo control-exo相比明显升高。Upregulation mir - 148 b - 5 - p与IBS-exo HT-29细胞培养中观察到。接触IBS-exo增加细胞渗透性和减少RGS2表达式。IBS-exo-induced变化明显逆转通过干扰mir - 148 b - 5 - p的表达。模仿IBS-exo治疗,mir - 148 b - 5 - p过度增加细胞渗透性和表达下调RGS2表达式,由overexpressing废除RGS2。荧光素酶报告实验发现,RGS2 mir - 148 b的直接目标- 5 - p。结论。Serum-derived液IBS患者结肠上皮通透性增加通过mir - 148 b - 5 - p / RGS2信号。

1。介绍

肠易激综合征(IBS)是一种多因子的胃肠功能障碍表现为腹痛、腹泻、和放松管制的排便习惯,影响生活质量的9 - 23%的普通人群(1,2]。肠道屏障,是一个物理上的障碍对腔的炎症分子,在免疫激活和肠道研究结果和慢性轻度粘膜炎症3,4]。腹泻和肠道研究是一个关键机制内脏过敏(VH)肠易激综合症的病人5,6]。然而,肠易激综合症的病理生理机制尚未清楚。小分子核糖核酸(microrna)对维持肠上皮屏障功能是至关重要的,因为他们的参与调节紧密连接的表情——(TJ -)相关的蛋白质。miR-16和mir - 125 b参与调节claudin-2和cingulin表达空肠的腹泻型IBS患者,从而削弱上皮屏障功能(7]。在活的有机体内实验表明,mir - 144是调节,可以增加肠道研究通过针对occludin和zonula occludens 1在IBS大鼠模型[8]。此外,myeloid-derived mir - 223抑制肠道炎症通过减少NLRP3 inflammasomes [9]。在肠易激综合症,最近的一项研究报道,mir - 148 - 5 - p是调节患者的结肠粘膜(10]。然而,分子机制mir - 148 - 5 - p的IBS尚未完全了解。

分子的合成细胞外囊泡(EVs)是一个反射器产生细胞的生理状态(11]。血液循环EVs的子群,作为发射机的信息和运输的蛋白质和RNA从细胞到细胞或器官(12]。循环exosomal microrna吸引了越来越多的关注近年来作为胃肠道癌症的潜在生物标记物(13]。电动汽车参与调节上皮屏障的完整性和功能,影响肠道上皮细胞功能复合体的装配和调节贩运和免疫细胞通过调节细胞因子的表达和传输不同的趋化因子和脂质(14]。例如,upregulation IBS患者的血液中miR-29a液参与肠道通透性的规定(15]。监管机构的G蛋白信号(该公司)蛋白质在胃肠道炎症中发挥作用和内脏疼痛通过调节G protein-coupled受体(GPCRs)在胃肠道,从而调节内源性阿片类药物的活性,大麻素和5 -羟色胺系统(16]。此外,最近的一项研究报告,间充质干细胞exosomal mir - 148 b - 5 - p介导免疫抑制效应通过下调15-LOX-1巨噬细胞在炎症性肠病(17]。然而,mir - 148 b的关系- 5 - p与肠道通透性肠易激综合症和底层机制尚不清楚。

在这项研究中,人类结肠上皮HT-29细胞培养与serum-derived液从IBS病人测量细胞通透性的改变。转染mir - 148 b - 5 - p抑制剂或模拟被用来实现mir - 148 b - 5 - p击倒或超表达HT-29细胞。

2。方法

2.1。人类血液样本的收集

本研究招收20名IBS患者和20名健康受试者从湖州中心医院,附属医院湖州大学中心。血液样本收集从每个IBS患者或健康的控制问题。本研究湖州中心伦理委员会批准的医院,医院湖州大学附属中心,符合1964年赫尔辛基宣言及其后来的修正案或类似的道德标准。

2.2。细胞培养

人类HT-29结肠上皮细胞从细胞获得银行上海生物研究所(上海,中国),在DMEM培养(美国Trueline、Kaukauna WI)中补充10%的边后卫(热科学),2毫米谷酰胺,和1%的P / S (Solarbio,北京)37°C, 5%的公司₂。

2.3。细胞转染

mir - 148 b - 5 - p抑制剂干扰mir - 148 b - 5 - p;mir - 148 b - 5 - p模仿overexpressing mir - 148 b - 5 - p,或miNC;和oeRGS2质粒RGS2过度或oeNC转染到HT-29细胞使用Lipofectamine 2000(美国卡尔斯巴德英杰公司)根据制造商的指示。24小时后,细胞被培养serum-derived液IBS患者。

2.4。定量实时聚合酶链反应

短暂,总RNA提取来自不同样本使用试剂盒试剂(美国沃尔瑟姆英杰公司)和反向转录成cDNA使用互补脱氧核糖核酸合成装备(美国沃尔瑟姆热科学)。本研究中使用的引物如下:列出hsa - mir - 148 b - 5 - p F: 5 - - - - - -CGCGCGAAGT TCTGTTATACAC-3 ,R: 5 - - - - - -AGTGCAGGGTCCGAGGTATT-3 ;U6, F: 5 - - - - - -CTCGCTTCGGCAGCACA-3 ,R: 5 - - - - - -AACGCTTCACGAATTTGCGT-3 ;RGS2 F: 5 - - - - - -GATTGGAAGACCCGTTTG-3 ,R: 5 - - - - - -CCCTGAATGCAGCAAGAC-3 ;和GAPDH, F: 5 - - - - - -GGATTGTCTGGCAGTAGCC-3 ,R: 5 - - - - - -ATTGTGAAAGGCAGGGAG-3 。使用2−相对表达式计算ΔΔCt方法(18]。GAPDH是作为内部参考规范化表达水平。每个实验进行了一式三份。

2.5。免疫印迹

简而言之,总蛋白(25μg)分馏在sds - page凝胶,随后electroblotted PVDF膜。细胞膜是孵化主要抗体在一夜之间(4°C),其次是anti-mouse二级抗体免疫球蛋白(Beyotime、上海、中国)1 h在37°C。在这项研究中使用的所有主要抗体提供了如下:CD9 (Ab92726, Abcam,英国),CD63 (Ab134045, Abcam,英国),RGS2 (Ab36561, Abcam,英国),和GAPDH (60004 - 1 - 1 g, Proteintech,美国)。实验进行了一式三份。

2.6。FITC-Dextran通量和Transepithelial /内皮电阻(te)

右旋糖酐通量的测量,简单地说,细胞接种到参议院的24-well Transwell板和培养在中添加荧光标记右旋糖酐(FITC-Dextran 1毫克/毫升)24 h。FITC荧光强度在490纳米测量使用标(Pulangxin,北京),和渗透率率计算。

美国微孔Millicell ERS-2 (Millicell ERS-2)被用来检查t值。t值计算如下: 。

2.7。外来体隔离和观察

液被使用外来体沉淀沉淀的解决方案(Exo-Quick;系统生物科学)制造商的指令后19]。超微结构和尺寸分布的净化液进行了分析通过透射电子显微镜(TEM)和NanoSight(莫尔文),分别。蛋白质标记,CD9(英国Abcam Ab92726)和CD63 (Ab134045, Abcam,英国),测定免疫印迹。

2.8。外来体吸收试验

确定HT-29细胞能吸收IBS-exos,我们染色液与PKH67(美国σ)根据标准协议之前报道(2)。然后我们cocultured这些标记液HT-29细胞。最后,我们用DAPI染色HT-29细胞(σ,美国)。24小时后,用共焦显微镜观察细胞。

2.9。荧光素酶报告实验

在24-well HT-29细胞培养板与荧光素酶记者向量携带转染野生型(WT)或突变体(傻瓜)3UTR RGS2 mir - 148 - b - 5 - p。荧光素酶活性是评价使用Dual-Luciferase记者分析系统(美国麦迪逊Promega)。

2.10。统计分析

GraphPad棱镜软件(版本7.0,拉霍亚、钙、美国)是统计分析应用。一式三份复制为每个实验是必要的。数据显示为 。比较两组之间使用学生的执行执行测试,比较在多个团体使用单向方差分析。统计学意义是定义使用值< 0.05。

3所示。结果

3.1。mir - 148 b - 5 - p在IBS患者的血清调节

血清mir - 148水平- b - 5 - p在IBS患者(化验 )和健康受试者( )。与健康对照组相比,IBS患者明显更高层次的mir - 148 b血清中p - 5 - (值< 0.001,图1)。

3.2。血清液源自IBS患者诱导的Upregulation mir - 148 b - 5 - p HT-29细胞

肠易激综合症患者血清液分离(IBS-exo)和健康对照组(control-exo)和由表面标记标识CD9和CD63。在透射电镜下,液是圆形的(图2(一个))。积极CD9的表达和CD63 IBS-exos和control-exo(图中被发现2 (b))。这个结果表明液被成功分离出IBS患者和健康对照组。肠易激综合症患者的隔离液然后贴上PKH67 cocultured HT-29细胞。如图2 (c)可以内化,PKH67-labeled IBS-exo HT-29细胞。此外,HT-29细胞cocultured IBS-exo有一个非常高水平的mir - 148 b - 5 - p细胞比HT-29 cocultured control-exos (值< 0.001,图2 (d))。

3.3。mir - 148 b - 5 - p抑制剂抑制的影响在细胞渗透性和RGS2 IBS-Exo HT-29细胞

细胞渗透性是评价使用FITC-Dextran通量的测量和三通。如数据所示3(一个)和3 (b),HT-29细胞cocultured IBS-exo细胞通透性增加,显著降低三通和增加FITC-Dextran建议,而控制细胞(值< 0.001)。调查的角色mir - 148 b - 5 - p的影响背后的分子机制IBS-exo HT-29渗透率的细胞,这些细胞被pretransfected mir - 148 - b - 5 - p抑制剂24 h沉默mir - 148 b - 5 - p前24小时coculture IBS-exo。mir - 148 b - 5 - p抑制剂成功表达下调mir - 148 b - 5 - p HT-29细胞(值< 0.001,图S1)。Pretransfection mir - 148 b - 5 - p抑制剂显著恢复细胞的渗透性与IBS-exo cocultured(数字3(一个)和3 (b))。此外,coculture IBS-exo显著调节mir - 148 b - 5 - p,逆转的转染和mir - 148 b - 5 - p抑制剂(值< 0.001,图3 (c)),这些发现表明,IBS-exo HT-29细胞的渗透性增加部分通过上调mir - 148 b - 5 - p。

使用TargetScan,我们发现RGS2 mir - 148 b的预测目标- 5 - p。的差别明显,IBS-exo治疗引起的一个明显的对这些RGS2 HT-29 mRNA和蛋白水平的细胞,由转染废除mir - 148 b - 5 - p抑制剂(值< 0.001,数字3 (c)和3 (d))。根据这些观察,我们假设RGS2是一个潜在的目标,mir - 148 b - 5 - p。

3.4。mir - 148 b - 5 - 3 p规范RGS2表达式通过绑定UTR

确定RGS2的下游目标mir - 148 b - 5 - p,荧光素酶的记者向量包含广泛的类型(WT)或突变体(傻瓜)结合位点cotransfected mir - 148 - b - 5 - p模拟成HT-29细胞(图4(一))。mir - 148 b - 5 - p超表达明显降低了荧光素酶活性在细胞cotransfected WT 3UTR RGS2 (值< 0.001)但诱导荧光素酶活性的变化与变异细胞cotransfected 3UTR RGS2(图4 (b))。它意味着3UTR RGS2 mir - 148的目标——b - 5 - p。

3.5。RGS2过度废除的影响mir - 148 b - 5 - p过度HT-29细胞的渗透性

我们进一步探讨RGS2是否参与mir - 148 b - 5 - p促进结肠上皮通透性。mir - 148 b - 5 - p或RGS2 HT-29细胞中过表达通过mir - 148 - b - 5 - p模仿或oeRGS2转染(数字S1和S2)。Overexpressing mir - 148 b - 5 - p t值减少,增加了FITC-Dextran涌入,类似于IBS-exo治疗引起的变化,这表明mir - 148 b - 5 - p超表达细胞通透性增加(值< 0.001,数字5(一个)和5 (b))。增加细胞渗透性恢复通过转染oeRGS2(数字5(一个)和5 (b))。此外,RGS2表达减弱由于mir - 148 b - 5 - p超表达,但增强应对cooverexpression RGS2和mir - 148 b - 5 - p(图5 (c))。这些发现暗示mir - 148 b - 5 - p可能通过针对RGS2调节结肠上皮通透性。

4所示。讨论

电动汽车出现在各种生物体液和涉及不同的病理过程(11]。IBS液的功能和机制的研究将帮助我们获得更多的见解IBS的分子特征,为识别更多的诊断和治疗奠定基础生物标志物的临床意义14]。分子组成的电动汽车是一个反射器产生细胞的生理状态(20.]。据报道,电动车与炎症性肠病病人激活结肠上皮细胞和巨噬细胞21]。在目前的研究中,我们分离和纯化血清液IBS患者和治疗人类HT-29结肠上皮细胞这些液建立在体外肠易激综合症的模型。我们的研究提供了令人信服的证据,serum-derived液IBS患者被人类结肠上皮细胞实验。此外,HT-29细胞培养IBS-exo显示减少三通和FITC-Dextran通量增加,表明IBS-exo结肠上皮通透性增加。这些观察表明,IBS-exo扮演了一个角色在IBS肠道屏障功能的破坏。一致,新兴研究已经证明,电动汽车大玩家在肠上皮的完整性(22,23]。

液体活检往往代表了一种快速、无创替代组织活检。此外,它允许癌症发展的纵向评价(24,25]。blood-based液体活检由disease-derived的隔离和分析或疾病有关的组件,在血液中循环,如微rna (microRNA)和非编码rna (ncRNAs) [26]。在目前的研究中,我们收集了IBS患者和健康对照组的血液样本。我们的研究结果表明,mir - 148 b - 5 - p在IBS患者的血液调节。这些发现表明,mir - 148 b - 5 - p的潜在价值作为IBS的生物标志物临床实践和可以用作IBS的治疗目标。

mirna - 148 / -152家庭(mir - 148 a, mir - 148 - b和mir - 152)参与调节免疫细胞的分化和功能并提出候选人慢性炎性肠道疾病的治疗靶点[27]。Upregulation mir - 148 - 5 - p在结肠粘膜肠易激综合症患者(10]。按照先前的发现,目前的研究表明,mir - 148 b - 5 - p在IBS-exo以及显著的调节与IBS-exo HT-29细胞培养。此外,目前的研究表明,IBS-exo提升细胞渗透,由mir - 148 b部分逆转。差别p - 5 -对这些此外,mir - 148 b - 5 - p过度上皮通透性增加,类似于IBS-exo治疗。这些结果表明,IBS-exo结肠上皮通透性增加部分由deliveringmir - 148 b - 5 - p。这是第一个研究中,我们所知,描述的监管作用mir - 148 b - 5 - p在IBS的结肠上皮通透性。它已经建立,microrna操纵紧密连接蛋白的表达保持上皮屏障完整性的关键(28]。mir - 148 b - 5 - p可能在IBS影响结肠上皮通透性通过操纵紧密连接蛋白的表达。

该蛋白质参与调节GPCRs参与调节肠道炎症和内脏疼痛(16]。RGS2属于R4 / B亚科和负调节G蛋白信号激活GTPase [29日]。使用TargetScan,我们预测RGS2 mir - 148 b的承诺目标- 5 - p。我们的研究结果表明,RGS2表达式是由mir - 148 b - 5 - p。此外,mir - 148 b - 5 - p结合3UTR RGS2调节其表达。这是第一个报告,据我们所知,这表明mir - 148 b - 5 - p是一个消极的调制器RGS2表达式。此外,我们的研究表明,类似于IBS-exo治疗,mir - 148 b - 5 - p超表达促进结肠上皮通透性和被RGS2逆转过度。这意味着mir - 148 b - 5 - p影响结肠上皮通透性通过调节RGS2表达式。mir - 148 b - 5 - p / RGS2信号通路可能是一个关键机制的削弱效果IBS-exo结肠上皮屏障。记录,增加肠道屏障导致微生物易位的渗透性和有助于VH和肠道炎症的恶化30.- - - - - -32]。据报道,RGS2负调节信号κ阿片受体与疼痛知觉和肠道蠕动33]。RGS2防止气道炎症和增加促炎S100A12在气道上皮细胞的表达34,35]。因此我们推断mir - 148 b - 5 - p增加结肠上皮通透性表达下调RGS2,从而加剧炎症和VH IBS的发病机制。我们的研究支持追求mir - 148 b - 5 - p / RGS2信号作为IBS的前景目标。未来的努力致力于定义的详细机制mir - 148 b - 5 - p / RGS2信号肠易激综合症的病理生理学是必要的。

5。结论

总之,我们建议serum-derived液IBS患者促进结肠上皮通透性移植mir - 148 b - 5 - p抑制RGS2结肠上皮细胞的表达。这项研究开拓未来渠道确定新药治疗肠易激综合症和其他肠道疾病相关。

数据可用性

和/或使用的数据集分析在当前研究可从相应的作者以合理的要求。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

所有作者的研究理念和设计。材料制备、数据收集和分析由小虎聂,应兴,山雪、吴京,Jianhong周,芳芳兴及天星,李。手稿的初稿编写和修订了小虎聂和应兴。所有作者评论以前版本的手稿。所有作者阅读和批准最终的手稿。

确认

我们真诚地承认所给予的援助湖州中心医院,附属医院湖州大学目前研究中心。这项研究是财务支持的中国浙江青年自然科学基金(没有。LQ19H030001)。

补充材料

图S1: mir - 148 b - 5 - p是沉默或过表达使转染mir - 148 b - 5 - p抑制剂或模仿。值< 0.001 miNC vs。图S2: RGS2超表达是HT-29诱导细胞。信使rna (A) (B)和蛋白质水平的RGS2 HT-29细胞转染oeNC或oeRGS2。值< 0.001 vs oeNC。(补充材料)

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