基质金属蛋白酶与BB-94的抑制经由调制嗜中性粒细胞和巨噬细胞活化防止雨蛙素诱导的胰腺炎

抽象

背景/目标。基质金属蛋白酶（MMP），尤其是MMP-9，衰减白细胞浸润和胰腺及远处器官损伤的急性胰腺炎（AP）的抑制。但是，目前还不清楚是否基质金属蛋白酶介导的炎性细胞活化。在这项研究中，我们调查了抑制蛙皮素诱发胰腺炎中性粒细胞和巨噬细胞活化基质金属蛋白酶的影响。方法。AP通过蛙皮素（10次小时腹膜内注射100在Balb / C小鼠中诱导 μ和脂多糖(5 mg/kg)。在AP诱导前30分钟腹腔注射MMP抑制剂BB-94 (20 mg/kg)。组织学和血清淀粉酶、脂肪酶证实为胰腺炎。胰腺促炎介质和NF-的表达κ乙活化进行了评估。骨髓衍生的中性粒细胞（BMDNs）和巨噬细胞（的BMDM）中分离得到。BMDNs were activated by phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA, 50 ng/ml) and neutrophil reactive oxygen species (ROS) production was recorded. BMDMs were stimulated with 10 ng/ml IFN-γ和100 ng/ml LPS诱导M1巨噬细胞极化。结果。青紫素诱导的胰腺炎中，胰腺MMP-9明显上调，血清MMP-9升高。用BB-94抑制MMP可以改善胰腺组织损伤，降低促炎细胞因子(TNF)的表达α或趋化因子(CCL2和CXCL2)和NF-κB激活。此外，通过分离的BMDNs和BMDMs，我们发现用BB-94抑制MMP可以显著降低中性粒细胞ROS的产生，抑制炎症巨噬细胞的极化和NF-κB激活。结论。我们的结果表明，通过调节中性粒细胞和巨噬细胞的激活，BB-94抑制MMP对青紫素诱导的胰腺炎的胰腺炎症反应具有保护作用。

1.介绍

急性胰腺炎(AP)是一种常见的、可能危及生命的胰腺炎症性疾病，是世界各地胃肠道疾病入院的主要原因。1- - - - - -3.]。AP的总死亡率一直在下降，但以持续器官衰竭和胰腺坏死为特征的重度AP的死亡率仍高达30% [1]。尽管AP的发病率和死亡率很高，但目前仍没有明确的治疗方法被批准。AP的治疗仅限于支持性治疗，部分原因是我们对AP病理生理学的理解不全面。多年来，人们一直认为胰腺腺泡细胞(PACs)内胰蛋白酶原的过早激活会引发AP，导致PAC损伤[4,5]。受伤的PAC产生促炎性介质招募循环白细胞入胰脏，这反过来又放大局部和全身炎症反应，从而导致多器官功能衰竭[6- - - - - -8]。

基质金属蛋白酶(MMPs)具有内肽酶的功能，可裂解大多数基质蛋白以及许多非基质靶蛋白，如趋化因子、细胞因子和粘附分子[9- - - - - -11]。某些基质金属蛋白酶，尤其是MMP-9，已经报道了密切相关胰腺炎严重程度和在胰腺炎的不同实验模型以及与AP [患者远处器官损伤12- - - - - -19]。在文献中积累的证据已经表明，具有广谱抑制剂衰减白细胞浸润的MMPs，全身性炎症应答，和组织损伤的抑制AP [12,14,16- - - - - -18]。然而，对炎性细胞活化的MMP抑制的作用和机制仍难以捉摸。因此，在本研究中，我们力求审查MMP-9的抑制与BB-94对蛙皮素诱导的胰腺炎中性粒细胞和巨噬细胞活化。

首先，我们发现在caerulein诱导的胰腺炎中，胰腺MMP-9显著上调，血清MMP-9也升高。用BB-94抑制MMP可减轻胰腺水肿、炎症浸润、坏死，并显著降低胰腺促炎细胞因子或趋化因子的表达和NF-κB激活。此外，利用分离的骨髓来源中性粒细胞(BMDNs)和巨噬细胞(BMDMs)，我们发现，用BB-94抑制MMP可以显著降低中性粒细胞活性氧(ROS)并抑制炎性巨噬细胞的极化。这些发现表明，MMP-9在介导AP过程中的炎症细胞激活中发挥了重要作用，提示特异性靶向MMP-9可能是治疗AP的一种潜在的治疗方法。

2.方法

2.1。动物

Balb/C mice (male, 6 weeks, 20-21 g) were purchased from Shanghai SLAC Laboratory Animal Co Ltd. (Shanghai, China). The animals were housed for 1 week under specific-pathogen-free conditions at a temperature of 22°C and 12 h dark/light cycle and allowed standard rodent diet and water ad libitum before experimentation. All mice (male, 21-22 g) were randomly allocated into experimental groups ( 每组)。所有程序经上海交通大学医学院动物伦理委员会批准(SYXK 2013-0050，上海，中国)。

2.2。实验性胰腺炎的诱导和治疗

蛙皮素诱导的胰腺炎（CER）在本研究中，这是实验性的AP的非侵入性，广泛使用的，并且高度可再现的模型中使用的[20.]。CER诱导的蛙皮素（10次小时腹膜内注射100 μ在最后一次注射caerulein后立即腹腔注射LPS (5 mg/kg)和LPS (5 mg/kg)。第一次注射青紫素12 h后人道处死小鼠。对照组为注射等量生理盐水的小鼠。BB-94 (20 mg/kg)在首次注射青紫素前30分钟腹腔注射。

2.3。血清学试验

采集血样，4℃，2000 rpm离心20 min，取血清。血清淀粉酶和脂肪酶使用商品化试剂盒根据制造商的协议在罗氏/日立模块化分析系统(罗氏，瑞士)中由酶动力学化学测定。血清MMP-9采用ELISA法检测，方法参照说明书(上海西唐生物技术有限公司)。

2.4。HE染色和免疫组化染色

新鲜胰腺标本4%中性多聚甲醛固定24 h，石蜡包埋4μm切片按照之前描述的标准程序进行H&E染色[21]。胰腺切片的水肿、炎症和坏死评分为0 - 3分(0:正常，3:严重)[22，分别由两位独立的有经验的病理学家以一种盲目的方式进行研究。免疫组化染色，内源性过氧化物酶被3%的过氧化氢阻断。切片用抗Ly6G单克隆抗体在4℃孵育过夜(1:50,Abcam, Cambridge, UK)。磷酸缓冲液(PBS)冲洗三次后，二抗37℃孵育1 h，用超敏SP试剂盒和多巴胺B试剂盒(中国福州马欣)观察，光镜(德国徕卡Wetzlar)观察。

2.5。定量聚合酶链反应

如前所述，使用Trizol试剂(Invitrogen, CA, USA)从胰腺组织和BMDMs中提取总RNA [23]。cDNA样品，从根据制造商的说明书使用Superscript II预扩增试剂盒（Fermentas公司，MD，USA）的总RNA制备。然后将合成的cDNA被用作qRT-PCR的模板与基因特异性的，在表中列出内含子跨越引物1。定量PCR（qPCR）中的溶液使用KAPA SYBR套件ABI PRISM 7900HT序列检测系统（Applied Biosystems，CA，USA）（卡帕生物系统公司，威尔明顿，USA）进行。靶基因的相对表达水平标准化成管家基因β对比CT计算-actin、fold change (2)^−ΔΔCT)方法。每个目标基因在每个三次实验中都被分析了三次。

2.6。西方墨点法

如前所述提取胰腺组织总蛋白[21]。使用bicinchoninic acid蛋白检测试剂盒(碧时生物技术，中国)检测蛋白浓度。40μ每泳道装载g个蛋白样品，用10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离，转移到硝酸纤维素膜(Millipore, USA)。用5%的BSA孵育60分钟，然后用抗MMP-9 (1:500, Abcam, Cambridge, UK)、TNF-的一抗孵育α(1:500, Proteintech, Rosemont, USA)， IL-6 (1:500, Cell Signaling Technology, Boston, USA)， NF-κBp65 (1 : 400, Cell Signaling Technology, Boston, USA), p-NF-κB p65 (1:400, Cell Signaling Technology, Boston, USAκBα(1:400, Cell Signaling Technology, Boston, USA)， p-IκBα(1 : 500, Cell Signaling Technology, Boston, USA),β-actin (1:20 00, Proteintech, Rosemont, USA)和α-肌动蛋白(1:1000,Cell Signaling Technology, Boston, USA)在4℃过夜。在含0.1% ween的PBS中洗涤三次后，用山羊antirabbit或山羊antimouse IR-Dye 800或700 CW标记的二抗在37℃下检测1 h。信号是可视化的奥德赛红外扫描仪(LI-COR，美国)。不同组的蛋白水平均归一化β肌动蛋白或α辅肌动蛋白和靶蛋白的磷酸化水平与他们的总体水平进行比较。作为倍数变化相比于对照组，提出靶蛋白的相对表达。

2.7。骨髓嗜中性粒细胞和巨噬细胞的分离和细胞培养

从小鼠股骨和胫骨分离bmdn和BMDMs。在手术解剖骨后，用无菌PBS冲洗股骨和胫骨(桑根，上海，中国)，并通过70μ米无菌过滤器（Fisher Scientific公司，沃尔瑟姆，USA），获得粗骨髓细胞。After centrifugation at 600 g for 5 minutes at 4°C with the brake off, cells were resuspended in 4 ml PBS and loaded on top of a discontinuous density gradient (62% and 81% Percoll) [24] and centrifuged at 1500 g for 20 min at 4°C with the brake off. BMDNs were collected between 62% and 81% Percoll layers and suspended in 4 ml Red Cell Lysis Buffer (eBiosciences, multispecies) for 5 minutes on a rocker, washed with PBS and centrifuged at 600 g for 5 min before resuspending in RPMI1640 (Hyclone, Logan, USA). BMDNs were counted using 0.4% trypan blue, typically >95% purity and >90% viability. BMDMs were collected on top of 62% Percoll layer and washed with PBS and centrifuged at 400 g for 5 min at 4°C with the brake on. BMDMs were then counted using 0.4% trypan blue, typically >95% purity and >90% viability, and cultured for 6 days in DMEM medium supplemented with 10% heat-inactivated FBS, 1% l-glutamine, 1% penicillin/streptomycin antibiotics, and 20 ng/mL M-CSF. After 6-day culture, BMDMs were stimulated with 100 ng/mL LPS and 10 ng/mL IFN-γ使用BB-94 24小时。未刺激的巨噬细胞(M0)作为对照。

2.8。化学发光测量ROS的产生

如前所述，通过过氧化物酶增强鲁米诺化学发光监测中性粒细胞ROS的产生[25，使用Synergy H1版阅读器(BioTek, Winooski, Vermont, USA)。简单地说，BMDNs被镀(500,000个细胞每孔)，然后加入50个细胞μM luminol and 75 units/ml horseradish peroxidase, and stimulated with 50 ng/ml phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA, Sigma) with or without BB-94 pre-treatment. ROS production was recorded for 30 min. The area under the curve (AUC) was calculated, normalized to negative control for each mouse/run, averaged across the runs, and converted to 每个实验组至少有3只或更多的老鼠。

2.9。统计分析

所有数据均以 至少来自三个独立的实验。两组间的比较以双尾学生的成绩进行测试。三个或更多的组间差异显著采用单因素方差分析和Bonferroni的后测进行比较。使用GraphPad Prism 7.0版（拉霍亚，CA，USA）进行统计分析。<0.05为差异有统计学意义。

3.结果

3.1。急性胰腺炎中MMP-9上调

在caerulein诱导的胰腺炎中，我们通过qPCR和western blotting检测胰腺MMP-9的mRNA和蛋白水平，发现MMP-9的mRNA和蛋白水平在caerulein诱导的胰腺炎中均显著上调(图)1(一)和1 (b))。类似地，血清MMP-9显著升高（图1 (c))。与先前发表的研究结果一致[19，我们发现MMP-9在AP中上调，提示它可能是AP发病机制中的主要调节因子。

3.2。BB-94抑制MMP对青紫素诱导的胰腺炎有保护作用

接下来我们研究了MMP抑制是否介导胰腺损伤。广谱MMP抑制剂BB-94抑制MMP [12,14,16,17，它是MMP-1、2、3、7和9的有效抑制剂。BB-94在首次注射青紫素前30分钟腹腔注射。第一次注射12小时后评估胰腺组织学和血清标记物。我们观察到，通过胰腺水肿、炎症浸润和腺泡细胞坏死( ,数字2 (b))。同样，BB-94显著降低了血清淀粉酶和脂肪酶(图)2 (c))。与以前的报道是一致的[14,17，我们的数据表明，使用广谱MMP抑制剂抑制MMP，可以防止青紫素诱导的严重胰腺炎。

3.3。BB-94抑制MMP可减轻胰腺炎症

以往研究中积累的证据表明，MMP-9在介导器官损伤和炎症反应中发挥着重要作用[12- - - - - -14,17]。接下来我们研究了BB-94对胰腺炎症反应的影响。用BB-94对对照、青紫素诱导的胰腺炎和青紫素诱导的胰腺炎的胰腺组织进行免疫组织化学染色显示，MMP抑制降低了Ly6G染色的胰脏炎症浸润(图)3(一个))。此外，嗜中性粒细胞（CXCL2）和巨噬细胞（CCL2）趋化因子募集也被下调与BB-94（图3 (b))。中枢促炎信号NF-的激活κ乙在胰腺在很大程度上是由BB-94（图抑制3 (c))。最后是促炎细胞因子包括TNF-的蛋白水平αBB-94显著下调IL-6(图)3 (d))。总之，这些结果表明，MMP抑制显著降低了AP期间的胰腺炎症反应。

3.4。MMP抑制介导中性粒细胞和巨噬细胞的激活

由于MMP的抑制可显著减少胰腺炎症浸润，而MMP的激活在介导其他组织损伤中发挥了关键作用[26- - - - - -28]。接下来，我们研究了MMP抑制是否会影响中性粒细胞和巨噬细胞的激活。分离的BMDNs被PMA刺激，PMA是中性粒细胞中ROS产生的有效激活剂[25，在存在或不存在不同浓度的BB-94的情况下。我们发现，经BB-94预处理后，pma诱导的中性粒细胞ROS产生明显减少，而在较高浓度的BB-94预处理时，减少更明显( ,数字4)。这些发现表明，抑制MMP可以通过减少中性粒细胞ROS的产生来减轻炎症反应。

经典活化巨噬细胞(M1)具有显著的促炎表型，并在组织损伤中发挥关键作用[29]。为了确定BB-94对促炎巨噬细胞极化的影响，用100 ng/mL LPS和10 ng/mL IFN-刺激BMDMsγ以诱导巨噬细胞M1极化在存在或不存在各种浓度的BB-94的。通过qPCR检查M1巨噬细胞 - 特异性标记物的表达。用BB-94 MMP的抑制减少所有炎性巨噬细胞的基因的mRNA的表达，包括iNOS和TNF-αα,il - 1β，及IL-6 ( ,数据5(一个)- - - - - -5 (c))。这些结果提示MMP，可能是MMP-9，在介导炎性巨噬细胞极化中发挥重要作用。自NF -κB信号通路有助于维持巨噬细胞极化状态[30.]。接下来我们研究了BB-94对NF-的影响κ研究发现，抑制MMP可显著下调p-I蛋白水平κBα和p-NF -κB p65(数据5 (d)和5 (e))。总之，这些数据证明MMP的抑制通过抑制炎性巨噬细胞极化防止胰腺的炎症反应。

4.讨论

在本研究中，我们证明了在青紫素诱导的胰腺炎中，胰腺MMP-9上调，血清MMP-9升高。用BB-94抑制MMP对胰腺组织损伤，降低血清淀粉酶和脂肪酶。我们进一步研究了MMP抑制对胰腺炎症浸润的影响，发现BB-94抑制MMP-9可显著减少胰腺中性粒细胞浸润。此外，抑制MMP-9可显著下调胰腺中性粒细胞和巨噬细胞特异性趋化因子，导致促炎细胞因子和中枢促炎信号NF-的表达降低κ乙活化，其可能是通过抑制嗜中性粒细胞的ROS产生和炎性巨噬细胞介导的极化。

MMPs家族在介导炎症反应方面的关键作用已经涉及到各种炎症疾病，包括AP [14,31,32]。在AP蛋白酶大多数已发表的研究在调节重症急性胰腺炎相关的全身性炎症和肺部并发症都集中在自己的关键作用[12,13,16- - - - - -18]。有限的研究表明MMPs，特别是MMP-9对胰腺炎症反应的影响[14,17]。在这里，我们发现MMP-9的mRNA水平在caerulein诱导的胰腺炎中上调(数据未显示)，提示MMP-9在急性胰腺炎中发挥更重要的作用。有趣的是，通过下调中性粒细胞和巨噬细胞相关趋化因子的表达和激活中央促炎信号NF-， BB-94抑制MMP可显著降低胰腺炎症浸润κB，从而导致促炎细胞因子的表达。Scannevin等。报道MMP-9，JNJ0966，其是用于在未来的急性胰腺炎模型中测试[一个有趣的潜在候选的高度选择性的化学抑制剂33]。

中性粒细胞浸润发生在急性胰腺炎的早期，对AP的发生起着至关重要的作用[26]。Gukovskaya等研究表明，浸润性中性粒细胞通过NADPH氧化酶介导的ROS生成介导胰腺组织损伤[34]。进一步的研究表明，中性粒细胞MMP-9促进中性粒细胞迁移、胰蛋白酶原激活和胰腺炎相关的肺损伤体内(12,14]。在本研究中，利用分离的BMDNs，我们发现用BB-94抑制MMP可显著减少中性粒细胞ROS的产生，提示BB-94减少胰腺相关组织损伤可能是由于中性粒细胞ROS产生减少。

AP中单核细胞和巨噬细胞浸润胰腺，分化为炎性m1极化巨噬细胞，并介导进一步组织损伤[35,36]。利用BMDMs，我们发现BB-94抑制M1巨噬细胞的极化。此外,NF -κ乙激活有助于维持M1极化巨噬细胞的状态，从而导致细胞毒性和炎性功能[30.]。我们发现，用BB-94抑制MMP可显著降低NF-κm1极化巨噬细胞中B的激活。这些结果表明，MMPs在介导炎症性巨噬细胞极化中发挥重要作用，而炎症性巨噬细胞极化又有助于介导AP中进一步的胰腺炎症和损伤。

综上所述，我们的研究结果表明，用BB-94抑制MMP可以通过抑制胰腺炎症浸润来防止胰腺炎症反应。其作用机制可能是通过抑制中性粒细胞ROS的产生和炎性巨噬细胞的极化。我们的数据表明靶向mmp，特别是MMP-9，是治疗AP的一种潜在的治疗方法。

缩写

记者:	急性胰腺炎
BMDNs:	来源于中性粒细胞的骨头
BMDMs:	骨骨髓来源的巨噬细胞
CCL2:	C-C基序趋化配体2
CER:	Caerulein
CXCL2:	C-X-C基序趋化因子配体2
MMP的:	基质金属蛋白酶
政治行动委员会：	胰腺腺泡细胞
PMA：	佛波醇12-myristate 13-acetate
ROS:	活性氧物种。

数据可用性

支持本研究结果的数据可从通讯作者处获得。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

G.H.和L.W.设计、构思了这项研究，并监督了这项研究。G.H.,L.W., and C.C. provided funding to support the study. Z.W., T.M., X.Y., and Y. H. performed the experiments and collected and analyzed the data. N.M. performed the experiments on BMDNs. B.L., J.D., and C.C. provided critical technical advice for the experiments. Z.W., B.L., and J.D. drafted the manuscript. G.H. and L.W. revised the manuscript. All the authors approved the final version of the manuscript. Zengkai Wu and Tunike Mulatibieke contributed equally to this work.

致谢

这项工作由国家自然科学基金资助，G.H.(81670584、81970556)，L。W (81900585)， C.C(81800566)，上海浦江计划，G.H. (18PJD041)和L。W (19 pj1408400)。

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