益生菌对极低出生体重儿肠道菌群的有益作用

摘要

极低出生体重（VLBW）婴儿是对肠道菌群的微生态失衡标记很大的风险。在本研究中，共36名VLBW婴儿随机分为两组，谁用组合益生菌和安慰剂治疗，和72个粪便标本上天14，并从中收集生命的28。最后，从16早产VLBW婴儿萃取32个粪便标本进行合格和使用16S rRNA基因测序分析。主要结果是评价肠道菌群的极低出生体重儿合并补充益生菌后的变化。次要结果是分析的相关性肠道微生物组合物和细胞因子的水平。我们发现，益生菌治疗，但不是安慰剂组，降低了α-超低体重婴儿肠道微生物群的多样性。在门水平上，益生菌处理显著提高了细菌的丰度厚壁菌门，而那的变形菌门被显著减少。在家庭层面，链球菌和乳杆菌科变得普遍后，益生菌治疗，而相对丰富肠杆菌科在此期间减少了。最值得注意的是，与观察显著的相关性乳杆菌科丰度和血清细胞因子水平。需要进一步的研究，以摆脱更多的光线在极低出生体重儿的肠道菌群的特点。和微生物的调节，应考虑提高极低出生体重儿的存活率。

1.介绍

由于新生儿重症监护的最新进展，极早产儿的存活率在过去20年中显著提高[1]。然而，高死亡率和发病率在婴儿仍可观察到出生>26周的多中心调查中国[2]。因此，在生存的改善并没有伴随着残疾的在这一人群中的发病率降低比例。坏死性小肠结肠炎（NEC）是一种常见的消化道应急和发病率和死亡率的主要原因在极早产儿。随机对照试验的许多荟萃分析表明，口服益生菌有效降低NEC和死亡[3.,4]。此外，更新的荟萃分析研究表明，多株益生菌可预防NEC和死亡的极度早产儿[更有效5]，但目前尚不清楚哪种益生菌组合最有效[6]。

正如我们所知，益生菌定植，增加黏膜屏障功能会改变肠道炎症的关键部件和上调免疫系统[7]。然而，目前肠道微生物组与炎症因子的相关性研究尚缺乏，特别是补充益生菌对肠道微生物组与炎症因子的协同作用研究。我们推测肠道微生物可能不仅参与了NEC等肠道疾病的发病机制，还参与了全身炎症过程。

在这项研究中，我们为了阐明对肠道微生物群落和炎症因子结合益生菌的作用进行了极低出生体重儿随机，双盲对照试验用补充益生菌。

2。材料和方法

2.1。道德守则

所有的研究程序进行了审查，并通过深圳市宝安区妇幼保健医院伦理委员会批准。知情同意书是由每个婴儿的以下机构审查委员会批准的协议（：LL2014006登记号）家长签字。

2.2。研究设计和样品收集

这是一个随机的，双盲的对照试验。早产儿与 和 住进深圳市宝安区妇幼保健院从2014年9月1日至2015年12月31日，谁幸存NICU中获得父母知情同意后录取。早产儿重度窒息（阶段III），胎儿染色体异常，紫绀型先天性心脏疾病，先天性肠闭锁，腹，脐膨出，活性胃上部肠出血，缺少/拒绝父母同意的，或在那些禁食>3周学习期间出生被排除后。

2.3。随机分组，分配隐藏，盲法和随访

入组VLBW患儿随机分为两组:采用联合益生菌治疗的益生菌(PB)组和采用安慰剂治疗的安慰剂(PL)组。随机化的执行顺序编号计算机化随机化算法。在开始前，主要研究人员根据序号隐瞒了治疗的分配。该药品由Glac生物技术有限公司提供，在包装、大小和形状上完全相同。此外，这些药品在装运前都标为B和C。这些药物是在高级护士喂奶之前添加到母乳或配方奶中，而这些高级护士并没有参与对这些婴儿的护理。负责管理婴儿的护士和医生直到研究结束才知道药物的含量。所有被登记的婴儿都由主治医生进行护理和随访，直到月经后36周、年龄或出院。

2.4。喂养指导和干预

所有入选婴儿取决于胎龄和出生体重在出生后考虑初始喂饲24小时内。母亲的乳汁是由供体乳，然后早产儿配方首选，随访。在第一天，最小的母乳或配方取决于馈送公差被赋予每2-4小时。The amount of feeding was increased slowly if tolerated, with increments of no more than 20 mL/kg per day per feeding. An oral intake of 100 mL/kg per day was defined as complete enteral feeding. Feeding was stopped if there was any sign of feeding intolerance, including the presence of gastric aspirate in an amount that was more than one half of the previous feeding, twice, or abdominal distension.

在此期间，就读婴儿接受治疗如任一益生菌基团的一部分：母乳或配方奶具有组合的益生菌（含有l .杆菌LK006 20％，长双歧杆菌LK014 40％，和b . bifidumLK012 40%;每个益生菌胶囊含有500mg的5¹⁰或安慰剂组:接受1ml 5%的葡萄糖溶液。益生菌总量500毫克(含5¹⁰CFU) per day or glucose was given by nasogastric tube within 4 h after birth. 250 mg per dose was added twice daily to the breast milk or formula until to 36 weeks post menstrual age.

特征、临床信息和实验室数据都是从我们的病历中提取的。

Fecal specimens were collected in 30-50 g at 14 and 28 days of life and then transported immediately to the laboratory on ice and stored at -80°Cfor further studies.

主要结果是评价肠道菌群的极低出生体重儿的综合补充益生菌后的变化。次要结果是分析细胞因子的相关肠道微生物组成和水平阐明补充益生菌后的有利影响。

2.5。DNA提取

基因组DNA从根据制造商的说明用QIAamp DNA快速粪便Mini试剂盒（QIAGEN，德国）每粪便样品中提取。DNA的量由下式确定使用NanoDrop 2000紫外可见分光光度计（Thermo Scientific的，USA）。DNA的完整性和大小是由0.8％检查（ )agarose gel electrophoresis in 0.5 mg/mL ethidium bromide. All DNA samples were stored at −20°C prior to further processing.

2.6。16S rRNA基因测序

细菌前引物5 -CCTACGGGRSGCAGCAG-3反向引物5 -GGACTACVVGGGTATCTAATC-3用于扩增16S rRNA基因的V3-V4的高变区的每个样本。DNA文库的浓度使用的PicoGreen DNA测定（Invitrogen，美国）定量。Pooled DNA library was diluted to 10 pM and denatured in 0.2 N NaOH and mixed with PhiX control library (Illumina Inc., USA). The DNA library was sequenced with an Illumina MiSeq sequencer (Illumina Inc., USA).

2.7。生物信息学和统计分析

采用微生物生态学管道定量分析方法(QIIME ver)对测序数据进行处理。1.9.0,http://www.qiime.org/)。使用PANDAseq对序列进行合并，使用USEARCH (ver)对序列进行去噪。(8.0.1623)， UCHIME26检测嵌合体。使用UCLUST以97%的相似度选择操作分类单元(OTUs)，生成具有代表性的序列。使用Greengenes数据库将序列与PyNAST进行对齐，并使用Ribosomal database Project分类器将其按80% bootstrap值阈值分配到最低可能的分类水平。超过50%的样品中发现otu被保留。序列的数目被归一化以供进一步分析。

群内细菌多样性(即:α-多样性)采用ACE、Chao、Shannon和Simpson指数进行评估。基于OTUs的加权快速UniFrac主坐标分析(PCoA)提供了益生菌和安慰剂治疗的肠道微生物动力学概况。组间细菌差异(即:β-多样性)被检查使用一个标准 -测试。计算Pearson相关系数，评价细菌丰度与细胞因子水平的相关性。使用R软件包(3.4.2版)进行统计分析和数据可视化。

3.结果

3.1。研究参与者的特征

在研究期间，从36名VLBW婴儿天14和生活28收集了总共72个粪便标本收集。所有这些中，20个粪便样品由于后元rDNA的扩增量不足完全排除，并且由于尽管第二元rDNA的放大的优化含量较低2个试样进一步排除。最后，从30早产VLBW婴儿萃取50个粪便标本进行合格和后行16S rRNA基因测序。在随访期，18个粪便标本进行进一步排除由于在14天或生活和重复的28天缺乏样品。最后，从16早产VLBW婴儿萃取32个粪便标本进行分析。本研究的流程图在图中示出1。

所有16名早产VLBW婴儿随机分为两组接收益生菌和安慰剂处理（以下称为PB分别和PL）。详细的人口统计，临床特征，喂养类型和两组抗生素曝光总结在表1。两组在人口统计学数据、临床特征、喂养类型和抗生素接触方面无差异( )。

3.2。益生菌治疗对超低体重婴儿肠道微生物群的影响

上的高品质的基础测序得到读取，我们在97％的相似性水平在所有样品中共有597个操作分类单元（的OTU）的鉴定。ACE，王超，香，和辛普森指数均适用于分析α多样性(图2)。在PB组，所述ACE，晁，和Shannon指数和增加的辛普森指数降低天14和生活28共同表现出降低α益生菌治疗后-diversity。与此相反，分别在PL组中安慰剂治疗后第14和28天没有检测到显著差异。

分析β-diversity也通过计算各个样本之间的加权距离UniFrac执行。主坐标分析（后交通动脉）曲线表明，聚合的采样以形成上生活，这分散在第28天的PB组中的第14天的簇（图图3（a）)。然而，没有观察到对天14和PL基团在生命的28无明显变化（图图3（b）)。

3.3。肠道微生物组成和细胞因子水平的相关性

在不同的分类级别，肠道菌群的组合物的PB组中的14位和28天的粪便样品之间进行比较。通过线性判别分析效果大小（LEfSe）方法生成表示微生物群结构和优势菌甲分支图（图4)。在门的水平，厚壁菌门是在28天的样品比14日的人的肠道菌群显著更加丰富。和相对丰度变形菌门在出生后28天下降。在家庭层面，链球菌和乳杆菌科成为普遍的28天的生命，而相对丰富的肠杆菌科在此期间减少了。

为了确定益生菌治疗是否缓解了超低体重婴儿的症状，我们还评估了PB组血清中的细胞因子水平。生活第28天，IL-6水平下降 -测试值= 0.026），并增加TGF-β的β观察2（成对学生 -测试PB组中，值= 0.011(图)5)。在另一方面中，PL组中检测到细胞因子水平没有变化显著（未示出数据）。

我们终于评估的相关性的各种细菌的相对丰度中，IL-6，TGF-β和β2.其中14位和28天的样品之间的差细菌，差动丰乳杆菌科与IL-6的变化显著相关(图6(一)）和TGF-ββ2（图6 (b))。的丰富的增加乳杆菌科伴有IL-6降低，TGF-升高β2.

4。讨论

累积的数据表明，人类肠道菌群对宿主代谢紊乱产生深远的影响[8]。对肠道菌群的细菌多样性比较和调查是为了解早产低出生体重儿的病因和发展潜力的治疗策略至关重要。在这项研究中，我们探讨的细菌多样性，群落结构，并在VLBW婴儿的免疫系统相结合益生菌的功效。据我们所知，这是第一次用口服的补充益生菌的同时研究极低出生体重儿的变化和肠道菌群的相关性和炎症因子。

LEfSe识别从PB组14天和28天的样品之间的串联差异丰富分类单位的。我们的研究结果大多是合理的，并与实验设计或公布调查结果一致。首先，在这项研究中测试的组合含有益生菌l .杆菌。因此，比例的乳杆菌科毫无疑问，在PB组中家庭成员增加[9]。二是在门水平上，的增加厚壁菌门和减少变形菌门益生菌治疗后往往是有益的，因为它已经报道了从与坏死性小肠结肠炎早产儿粪便微生物已经增加的相对丰度变形菌门和下降的相对丰度厚壁菌门[10,11]。在本研究中，益生菌可以逆转这种细菌失衡。三是在家庭层面，增加链球菌和乳杆菌科和减少肠杆菌科可以很容易地解释之前的发现肠杆菌科主要是早产VLBW婴儿而链球菌和乳杆菌科占主导地位的足月儿[12]。由于这个原因，减少α益生菌治疗后-diversity发生因有害细菌，其份额在微生物被接管的益生菌种类减少的相对丰度。

在PB组，益生菌处理后IL-6下降，TGF-升高β₂在血清。与以前的研究结果是一致的[13]，细胞因子的这种变化暗示TGF-的这种保护作用β尤其是TGF-β₂异构体，通过抑制发育中的肠道巨噬细胞炎症反应[14]。在已经迄今为止进行的极低出生体重儿的微生物学研究，很少有人注意支付给在微生物和细胞因子水平的变化之间的相关性。因此，对早产VLBW婴儿益生菌的详细机制仍很大程度上不清楚。在本研究中，我们发现，乳杆菌科与IL-6和TGF-的血清水平被显著相关β₂。提示该细菌家族与VLBW婴儿的病理密切相关。鉴于此，……的丰富乳杆菌科和其他公知的益生菌属（例如，双歧杆菌)可作为益生菌治疗疗效的生物标记。

虽然有新的发现，但我们的研究有一定的局限性。首先，样本量相对较小。然而，我们的研究在益生菌治疗和肠道菌群的连续评估方面是独特的。此外，本研究中观察到的主要菌门的变化与目前对这些微生物作用的认识是一致的。其次，所有研究对象都是华裔，研究结果可能不能直接推断出其他人群。欢迎对其他民族进行进一步的验证性研究，以了解肠道菌群的种群间差异。

总之，我们确定了一些细菌具有在益生菌治疗，这些都没有在安慰剂组中发现了丰富的差别。在此基础上，今后涉及到更大的极低出生体重早产儿的同伙宏基因组学研究可以提高益生菌疗法并阐明肠道菌群和早产儿极低出生体重之间的因果关系。

数据可用性

用于支持这项研究结果的数据目前处于封锁状态，而研究结果正在商业化。在本文发表后(6/12个月)，通讯作者将考虑数据请求。

利益冲突

作者宣称，他们没有利益冲突。

作者的贡献

两位作者岳锋锂和传瑞珠曾在手稿平等的贡献。

补充材料

补充1。报告随机试验时，CONSORT 2010信息清单。

补充2。图S1:的变化α-diversity（Shannon指数）在益生菌组和安慰剂组。

补充3。图S2: PB组在第28天中性粒细胞百分比显著下降。

参考

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