GRP 胃肠病学研究和实践 1687 - 630 x 1687 - 6121 Hindawi 10.1155 / 2019/3682836 3682836 研究文章 有益的益生菌治疗肠道微生物群在极低出生体重婴儿 https://orcid.org/0000 - 0001 - 9433 - 9248 李 跃峰 1 2 朱 Chuan-rui 1 https://orcid.org/0000 - 0002 - 1878 - 6422 龚 Xue-lei 2 https://orcid.org/0000 - 0002 - 2821 - 9798 李 Hui-ling 3 熊 Li-kuan 4 王 Ke-jian 5 https://orcid.org/0000 - 0002 - 7975 - 9217 刘 Guo-Sheng 1 Gionchetti 保罗 1 儿科 第一附属医院 暨南大学 广州510630 中国 jnu.edu.cn 2 儿科 深圳罗湖妇幼保健医院 518019年 中国 3 新生儿学部门 宝安妇幼保健医院 深圳518133年 中国 4 中心实验室 宝安妇幼保健医院 深圳518133年 中国 5 林院士工作站的新医学和临床翻译 第三附属医院 广州医科大学 广州510150 中国 gzhmu.edu.cn 2019年 17 10 2019年 2019年 13 04 2019年 12 08年 2019年 09年 09年 2019年 17 10 2019年 2019年 版权©2019跃峰李et al。 这是一个开放的文章在知识共享归属许可下发布的,它允许无限制的使用,分布和繁殖在任何媒介,提供最初的工作是正确的引用。

极低出生体重(出生)婴儿肠道微生物群的明显失调的风险。在目前的研究中,总共36出生婴儿被随机分为两组,与组合益生菌和安慰剂治疗,72粪便标本收集14天、28天的生活。最后,32粪便标本提取16早产出生婴儿合格使用16 s rRNA基因测序和分析。主要结果评估肠道微生物群的变化在出生后婴儿益生菌补充剂相结合。二次结果分析相关的肠道微生物组成和细胞因子水平。我们发现益生菌治疗,但不是安慰剂,减少了 α多样性出生婴儿的肠道微生物群。在门级,强烈增加了大量的益生菌治疗 厚壁菌门,而 变形菌门显著降低。在家庭层面上, 链球菌科和 乳杆菌科益生菌治疗后成为流行,而相对丰富的 肠杆菌科同时减少。最值得注意的是,重要的之间的相关性观察 乳杆菌科丰富和血清细胞因子水平。还需要进一步的研究来解释出生新生儿的肠道微生物群的特点。和微生物群的灯应该考虑改善出生婴儿的存活率。

 1。介绍

由于最近的进步在新生儿重症监护,极度早产儿的存活率显著增加在过去20年里( 1]。然而,高发病率和死亡仍然观察到婴儿> 26周多中心调查在中国( 2]。因此,改善生存没有伴随着比例减少残疾的发生率在这个人口。坏死性小肠结肠炎(NEC)是一种常见的胃肠紧急和极度早产婴儿发病率和死亡率的主要原因。许多相关的荟萃分析表明,口服益生菌有效降低NEC和死亡( 3, 4]。此外,一个更新荟萃分析研究表明,多个株益生菌可以更有效的防止极早产儿(NEC和死亡 5),但目前还不清楚哪些益生菌组合是最有效的( 6]。

正如我们所知,益生菌殖民增加粘膜屏障功能可以改变肠道炎症的关键部件和移植的免疫系统 7]。然而,目前,肠道微生物和炎性因子的相关性研究还缺乏,尤其是coeffect补充益生菌在肠道微生物和炎症因素。我们假设肠道微生物可能参与不仅肠道疾病的发病机理和NEC而且系统性炎症过程。

在这项研究中,我们进行了一项随机、双盲对照试验在出生婴儿益生菌补充剂为了阐明复合益生菌对肠道微生物群落和炎症的影响因素。

 2。材料和方法 2.1。道德声明

综述了研究过程和伦理委员会批准深圳宝安妇幼保健医院。签署知情同意是每个婴儿的父母后,机构审查委员会批准的协议(注册号码:LL2014006)。

 2.2。研究设计和样本收集

这是一个随机、双盲对照试验。早产儿与 妊娠期 年龄 遗传算法 ≤ 34 周 和 出生 重量 BW < 1500年 通用汽车 承认深圳宝安妇幼保健医院从9月1日,2014年到2015年12月31日,在NICU中幸存的人登记后获得家长知情同意。严重的早产儿窒息(第三阶段),胎儿染色体异常,青紫的先天性心脏病,先天性肠闭锁、腹裂,脐膨出,积极上胃肠道出血,缺乏/拒绝父母的同意,或者那些在研究期间禁食> 3周出生后被排除在外。

 2.3。随机分配隐藏,致盲,随访

注册出生的婴儿被随机分为两组:益生菌(PB)集团联合益生菌处理,与安慰剂(PL)组与安慰剂治疗。随机顺序进行使用电脑编号随机化算法。分配隐藏了治疗主要研究者根据顺序数字开始前。地理生物技术有限公司提供的药物和包,都是相同的大小和形状。此外,药物标签在装船前B和C。药物之前添加到母乳或配方喂养的高级护士没有参与照顾这些婴儿。护士和医生参与管理婴儿不知道毒品的内容,直到研究结束。所有登记婴儿被照顾,由主治医师随访直到36周后月经年龄或放电。

 2.4。喂养指导和干预

所有登记初始喂养婴儿被认为是出生后在24小时内根据胎龄和出生体重。母亲的母乳是首选,跟随由捐献的母乳,然后早产公式。第一天,最小的母乳或配方是每2 - 4小时根据喂养宽容。进食的数量增加缓慢如果容忍,增量的每天不超过20毫升/公斤/喂养。口服每天摄入100毫升/公斤被定义为完整的肠内喂养。喂养了如果有任何喂养不耐受的迹象,包括胃管的存在这一金额超过一半的是前面的喂养,两次,或腹胀。

同时,加入婴儿接受治疗的一部分的益生菌组:母乳或配方组合益生菌(包含 l .杆菌LK006 20%, b . longumLK014 40%, b . bifidumLK012 40%;每个益生菌胶囊包含500毫克的510菌落(CFU),由地理生物科技有限公司),或安慰剂组:接收1毫升5%葡萄糖溶液。总500毫克的益生菌(包含510CFU)每天或葡萄糖是由鼻胃管在出生后4 h。每天两次250毫克剂量添加母乳或配方到36周后月经年龄。

特点、临床资料和实验室数据从我们的医疗记录。

粪便标本被收集在30 - 50 g 14岁和28天的生活然后立即运送到实验室在冰上和储存在-80°Cfor进一步的研究。

主要结果评估肠道微生物群的变化在出生后婴儿益生菌补充剂相结合。二级结果分析相关的肠道微生物组成和细胞因子的水平阐明益生菌补充后的有利影响。

 2.5。DNA提取

基因组DNA提取粪便样本使用QIAamp快速DNA凳子迷你包(试剂盒、德国)根据制造商的指示。DNA的数量取决于NanoDrop 2000紫外可见分光光度计(美国热科学)。完整性和大小的DNA检查0.8% ( w / v 在0.5毫克/毫升)琼脂糖凝胶电泳溴化乙锭。DNA样本都储存在−20°C之前进一步处理。

 2.6。16 s rRNA基因测序

细菌正向引物5 ′ -CCTACGGGRSGCAGCAG-3 ′ 和反向引物5 ′ -GGACTACVVGGGTATCTAATC-3 ′ 被用来放大V3-V4 16 s rRNA基因的变异度高的区域在每个样本。DNA库使用PicoGreen量化DNA的浓度测定(美国表达载体)。池DNA库是稀释10点和变性0.2 N氢氧化钠和混合PhiX控制库(美国Illumina公司Inc .)。DNA库测序的Illumina公司MiSeq编曲(美国Illumina公司Inc .)。

 2.7。生物信息学和统计分析

定量见解微生物生态学管道来处理测序数据(QIIME版本。1.9.0, http://www.qiime.org/)。使用PANDAseq Paired-end读取被合并,序列运用使用USEARCH(版本。8.0.1623)和嵌合体与UCHIME26检查。操作分类单元(辣子鸡)选择使用UCLUST相似度97%,和代表序列生成。使用绿色煤电数据库和序列与PyNAST分类分配到尽可能低的分类级别使用核糖体数据库项目分类器阈值在80%的引导价值。辣子鸡中发现超过50%的样本保留。序列的数据规范化进行进一步的分析。

内群体细菌多样性(例如, α多样性)评估与ACE、曹国伟、香农,辛普森指数。加权快速UniFrac主坐标分析基于辣子鸡(PCoA)进行概述的肠道微生物动力学响应益生素和安慰剂治疗。群体间的细菌的差异(例如, β使用一个标准的多样性)检查 t 以及。皮尔森相关系数是计算评估细菌丰度之间的关系和细胞因子水平。统计分析和数据可视化使用R执行软件包版本(3.4.2)。

 3所示。结果 3.1。参与这项研究的特点

研究期间,共有72名从36出生婴儿的粪便标本收集14天、28天的生活。所有这些,20粪便样本数量不足导致完全被排除在外元rDNA放大后,和2标本进一步被排除在外,因为较低的内容尽管优化二元rDNA放大。最后,50粪便标本提取30早产出生婴儿是合格的和接受16 s rRNA基因测序。后续时期,18粪便标本进一步排除由于缺少样品在14天、28天的生活,重复。最后,32粪便标本提取16早产出生婴儿进行了分析。本研究的流程图如图 1。

本研究的流程图。

所有16岁早产婴儿出生时被随机分为两组接受益生素和安慰剂治疗(以下称为PB和PL)。详细的人口统计学、临床特征、喂养类型和抗生素暴露的两组表进行了总结 1。两组之间没有差异的人口数据,临床特征,喂养类型和抗生素暴露( p > 0.05 )。

人口统计学和临床特征的两组之间的母亲和她们的婴儿。

PB组( n = 8 ) PL组( n = 8 ) 或(95%置信区间) p 价值
母亲的特性
年龄( 的意思是 ± SD ) 27.5 ± 3所示。8 28.6 ± 7.5 0.7
剖腹产( n ,%) 5 (62.5) 3 (37.5) 2.8 (0.4 ~ 21.0) 0.6
毕业舞会( n ,%) 4 (50) 1 (12.5) 7.0 (0.6 ~ 86.3) 0.3
妊娠高血压( n ,%) 1 (12.5) 1 (12.5) 1.0 (0.0 ~ 19.4) 1.0
前置胎盘( n ,%) 2 (25) 0 (0) 0.4 (0.2 ~ 0.8) 0.5
交货前抗生素( n ,%) 1 (12.5) 0 (0) 0.5 (0.3 ~ 0.8) 1.0
新生儿的特性
胎龄(周) 29.3 ± 1.3 30.4 ± 1.6 0.2
出生体重(克) 1176年 ± 164年 1326年 ± 193年 0.1
男( n ,%) 6 (75) 3 (37.5) 5.0 (10.6 ~ 42.8) 0.3
SGA ( n ,%) 1 (12.5) 1 (12.5) 1.0 (0.0 ~ 19.4) 1.0
1分钟的阿普加分数 8.5 ± 3所示。1 8.9 ± 1.6 0.8
5分钟阿普加分数 9.4 ± 1.4 9.4 ± 0.9 1.0
喂养类型
专门配方 6 (75) 3 (37.5) 0.3
母乳+奶粉 2 (25) 5 (62.5) 0.3
抗生素暴露( n ,%) 7 (87.5) 5 (62.5) 0.6
临床并发症
CLD 4 (50) 3 (37.5) 1.0
IVH 2 (25) 0 (0) 0.5
罗普 1 (12.5) 0 (0) 1.0

CLD:慢性肺病;IVH:脑室内出血;罗普:视网膜病变。

 3.2。益生菌治疗影响出生婴儿肠道微生物群

的基础上,得到了高质量的阅读,在测序,我们确定了总共597操作分类单位(辣子鸡)在所有样本在97%相似性水平。王牌,曹国伟、香农和辛普森指数的应用进行分析 α多样性(图 2)。PB组中,ACE的减少,曹国伟,香农指数和辛普森指数增加14天、28天的生活集体表现出减少 α益生菌治疗后的多样性。相比之下,未发现显著差异在安慰剂治疗后14天、28天的PL组。

的变化 α多样性的PB组(模拟)和PL组(情况)。

分析 β计算未加权的多样性也由UniFrac个体样本之间的距离。主坐标分析(PCoA)情节表明样品进行聚合,以形成一个集群在14天的生活,而分散在PB组(图28天 3(一个))。然而,没有观察到明显的变化在14天、28天的生活PL组(图 3 (b))。

主坐标分析(PCoA)的粪便微生物群PB组(a)和PL组(b)。14日和28天样本显示在单独的面板强调时态的区别。

 3.3。肠道微生物组成和水平的细胞因子之间的相关性

在不同分类水平,肠道微生物群组成14 -之间的比较和28天PB组粪便样本。表示微生物群的进化分枝图结构和线性判别分析效应产生的主要细菌大小(LEfSe)方法(图 4)。在门级, 厚壁菌门更丰富的肠道微生物群在28天比14天的样品。和的相对丰度 变形菌门减少在28天的生活。在家庭层面上, 链球菌科和 乳杆菌科成为流行在28天的生活,而的相对丰度 肠杆菌科同时减少。

LEfSe方法生成的进化分枝图表明不同的细菌类群之间14天、28天样本PB组。节点用红色表明细菌富集在28天的新生儿,节点在蓝色表明细菌富集在14天的新生儿。

确定益生菌治疗缓解症状的出生婴儿,我们也评估了PB组的血清样本的细胞因子水平。在28天的生活,减少il - 6(成对的学生的 t 以及 p 值= 0.026)和增加TGF - β2观察(成对的学生的 t 以及 p 值= PB组(图0.011) 5)。另一方面,没有明显的细胞因子水平的变化被发现PL组(数据没有显示)。

血清il - 6水平的显著变化(a)和TGF - β2 (b)在PB组。

我们最终评估各种细菌的相对丰度之间的相关性,il - 6, TGF - β2。在细菌之间的差距14 - 28天样品,微分的丰富 乳杆菌科与il - 6的变化显著相关(图 6(一))和TGF - β2(图 6 (b))。大量的增加 乳杆菌科伴随着减少il - 6和海拔TGF - β2。

之间的相关性差大量的细菌和细胞因子的变化。皮尔森相关系数( r )和双尾概率( p )被用来评估统计的重要性。

 4所示。讨论

积累的数据表明,人类对宿主代谢紊乱(肠道微生物群的深远的影响 8]。比较的细菌多样性的肠道微生物群作用和调查是必不可少的对于理解早产低出生体重婴儿的病因和发展潜在的治疗策略。在这项研究中,我们研究了组合益生菌的功效在细菌多样性,群落结构,出生婴儿的免疫系统。据我们所知,这是第一次研究肠道微生物群和炎性因子的变化和相关同时出生婴儿口服益生菌补充剂相结合。

LEfSe确定一系列不同的丰富的分类单元之间的14天、28天样本PB组。我们的结果大多是合理和符合实验设计或发表的研究结果。首先,益生菌在这项研究中包含测试相结合 l .杆菌。因此,的比例 乳杆菌科家庭无疑增加了PB组( 9]。第二,在门级的增加 厚壁菌门的减少 变形菌门益生菌治疗后往往是有益的,因为它已经被报道,粪便微生物从早产儿坏死性小肠结肠炎的相对丰度增加 变形菌门和减少的相对丰度 厚壁菌门( 10, 11]。这些细菌不平衡可能会被本研究益生菌。第三,在家庭层面上,增加的 链球菌科和 乳杆菌科的减少 肠杆菌科很容易解释前面的发现 肠杆菌科主要在早产婴儿出生吗 链球菌科和 乳杆菌科主要在足月的婴儿( 12]。出于这个原因,减少 α多样性益生菌治疗后发生由于减少相对大量的有害细菌,其份额的微生物被益生菌的物种。

在PB组,益生菌的治疗是伴随着减少il - 6和增加TGF - β2在血清中。与先前的研究一致的( 13),这些细胞因子的变化暗示TGF -的保护作用 β,特别是TGF - β2同种型,通过抑制巨噬细胞炎症反应发展中肠( 14]。在微生物研究出生的婴儿,是迄今为止的表现,很少有人注意到微生物群和细胞因子水平的变化之间的关系。因此,益生菌在早产婴儿出生的详细机制仍很大程度上不清楚。在目前的研究中,我们发现 乳杆菌科与血清il - 6水平显著相关,TGF - β2。这表明细菌家庭出生婴儿的病理密切相关。鉴于这一点,大量的 乳杆菌科和其他著名的益生菌属(如 双歧杆菌)可以作为益生菌治疗的疗效的生物标志物。

尽管新发现,我们的研究有一定的局限性。首先,样本容量相对较小。然而,我们的研究的独特之处在于有一个连续的评估益生菌治疗和肠道微生物群。此外,本研究主要观察到细菌类群的变化按照当前的理解这些微生物的影响。第二,主题都是华人,这些发现可能不是直接外推到其他人群。欢迎进一步确认研究其他民族理解interpopulation肠道细菌的差异。

总之,我们发现了一个微分的细菌丰度在益生菌治疗,安慰剂组中没有。基于这些,未来宏基因组研究涉及到更大的早产儿出生队列可以提高益生菌疗法和阐明肠道微生物群之间的因果关系和早产婴儿出生。

 数据可用性

使用的数据来支持本研究的发现正在禁运而研究成果商业化。请求数据(6/12months)后发表这篇文章将被视为由通讯作者。

 的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

 作者的贡献

两位作者跃峰李和朱Chuan-rui同等贡献的手稿。

 补充材料

配偶2010清单的信息包括在报告一个随机试验。

图S1:的变化 α多样性(香农指数)益生菌组和安慰剂组。

图S2:显著减少中性粒细胞的百分比在PB组28天。

 斯托尔 b . J。 汉森 n I。 贝尔 e . F。 沃尔什 m . C。 卡洛 w·A。 Shankaran 年代。 Laptook a。R。 桑切斯 p . J。 范·穆尔 k P。 Wyckoff M。 达斯 一个。 黑尔 e . C。 球 m B。 纽曼 n S。 Schibler K。 波因德克斯特 B . B。 肯尼迪 k。 Cotten c . M。 Watterberg k . L。 D 'Angio c . T。 DeMauro 美国B。 Truog w·E。 Devaskar U。 希金斯 r D。 尤尼斯肯尼迪施莱佛国立儿童健康和人类发展研究所的新生儿研究网络 护理实践的趋势,发病率和死亡率极早产儿,1993 - 2012 《美国医学会杂志》 2015年 314年 10 1039年 1051年 10.1001 / jama.2015.10244 2 - s2.0 - 84941702065 香港 X。 徐 f . D。 吴 R。 吴 H。 居 R。 赵 x L。 通 x M。 Lv h . Y。 丁 y . J。 刘 F。 徐 P。 刘 w·P。 程 h . B。 程ydF4y2Ba t, Q。 曾 美国J。 贾 w Z。 李 z K。 邱 h . X。 王 J。 冯 z . C。 新生儿死亡率和发病率在24至31日完成周之间的婴儿:一项多中心调查在中国从2013年到2014年 BMC儿科 2016年 16日,第174条 10.1186 / s12887 - 016 - 0716 - 5 2 - s2.0 - 84993933891 AlFaleh K。 Anabrees J。 益生菌预防早产儿的坏死性小肠结肠炎 2014年 10 10.1002/14651858. cd005496.pub3 CD005496 Athalye-Jape G。 饶 年代。 Patole 年代。 这种乳酸菌DSM 17938作为早产儿的益生菌:毒株特异性系统综述 肠外和肠内营养杂志》上 2016年 40 783年 794年 10.1177 / 0148607115588113 2 - s2.0 - 84978976670 常 h . Y。 程ydF4y2Ba j . H。 常 j . H。 林 h . C。 林 c . Y。 彭 C . C。 多种益生菌菌株似乎最有效益生菌预防坏死性小肠结肠炎和死亡率:一个更新的荟萃分析 《公共科学图书馆•综合》 2017年 12条e0171579 10.1371 / journal.pone.0171579 2 - s2.0 - 85012050869 Cassir N。 维埃 U。 La斯科拉 B。 肠道微生物群的早产儿和坏死性小肠结肠炎的发病机理 未来的微生物学 2016年 11 273年 292年 10.2217 / fmb.15.136 2 - s2.0 - 85012097427 卡普兰 m . S。 马丁 r . J。 Fanaroff 答:一个。 沃尔什 m . C。 新生儿坏死性小肠结肠炎:临床观察、病理生理学和预防 Fanaroff &马丁的Neonatal-perinatal药 2010年 9日。 密苏里州 爱思唯尔处于 1431年 1442年 华纳 B . B。 Deych E。 周 Y。 Hall-Moore C。 魏因斯托克 g . M。 Sodergren E。 谢赫 N。 霍夫曼 j . A。 Linneman l。 Hamvas 一个。 卡纳 G。 Rouggly-Nickless l . C。 Ndao i M。 弗罗 b。 Escobedo M。 沙利文 j·E。 拉德马赫 p·G。 香农 w·D。 塔尔 p . I。 肠道菌群失调和坏死性小肠结肠炎在极低出生体重婴儿:前瞻性病例对照研究 《柳叶刀》 2016年 387年 10031年 1928年 1936年 10.1016 / s0140 - 6736 (16) 00081 - 7 2 - s2.0 - 84959924044 梅 V。 年轻的 c . M。 Ukhanova M。 Warng X。 太阳 Y。 卡塞拉 G。 Theriaque D。 李 N。 沙玛 R。 Hudak M。 Neu J。 粪便微生物群在早产儿之前坏死性小肠结肠炎 《公共科学图书馆•综合》 2011年 6 6条e20647 10.1371 / journal.pone.0020647 2 - s2.0 - 79958154014 安德鲁 J。 抗生素早产婴儿肠道微生物和resistome的扰动 肠道微生物 2016年 7 5 443年 449年 10.1080 / 19490976.2016.1218584 2 - s2.0 - 84982252654 Pammi M。 应对 J。 塔尔 p . I。 华纳 B . B。 明天 a . L。 梅 V。 格雷戈里 k . E。 克罗尔 j·S。 马克穆特 V。 摩天 m·J。 Engstrand l Lilja h·E。 霍利斯特 e . B。 Versalovic J。 Neu J。 之前在早产儿肠道失调坏死性小肠结肠炎:系统回顾和荟萃分析 微生物组 2017年 5 1 31日 10.1186 / s40168 - 017 - 0248 - 8 2 - s2.0 - 85015945763 Arboleya 年代。 盎 l Margolles 一个。 Yiyuan l 亚东 Z。 梁 X。 索利斯 G。 费尔南德斯 N。 de los Reyes-Gavilan c·G。 Gueimonde M。 深16 s rRNA宏基因组和定量PCR分析早产儿粪便微生物群 厌氧生物 2012年 18 378年 380年 10.1016 / j.anaerobe.2012.04.013 2 - s2.0 - 84861864308 Maheshwari 一个。 Schelonka r . L。 Dimmitt r。 卡洛 w·A。 Munoz-Hernandez B。 达斯 一个。 麦当劳 美国一个。 于 P。 Skogstrand K。 Hougaard d . M。 希金斯 r D。 的尤尼斯•肯尼迪•施莱佛国立儿童健康和人类发展研究所新生儿研究网络 细胞因子与extremely-low-birth-weight婴儿的坏死性小肠结肠炎 儿科研究 2014年 76年 1 One hundred. 108年 Maheshwari 一个。 凯利 d·R。 尼古拉 T。 Ambalavanan N。 耆那教徒的 美国K。 Murphy-Ullrich J。 阿特 M。 Shimamura M。 班达里 V。 Aprahamian C。 Dimmitt r。 塞拉 R。 哦! r·K。 TGF - β2抑制巨噬细胞细胞因子的生产和发展中肠粘膜炎症反应 胃肠病学 2011年 140年 242年 253年 10.1053 / j.gastro.2010.09.043 2 - s2.0 - 78650455673