癌变前的结直肠肿瘤的突变分析

文摘

积累等位变异的基因,调节细胞增殖、分化和凋亡可能导致肠道上皮的异常扩张,产生腺瘤。在此,我们比较传统结直肠腺瘤的突变概要文件(CNADs)阶段对早期癌的进展。DNA分离出17个入侵腺癌(ACs)和58大CNADs,其中包括19个低级发育不良(乐金显示器),21乐金显示器毗邻地区的高档发育不良和/或癌(LGD-H)和28高档发育不良(HGD)。离子AmpliSeq综合癌症面板图书馆准备和测序离子质子。我们确定了956个独特的等位基因变异;其中,499年被认为是产生的变体。11个基因(APC,喀斯特,SYNE1,新的高度,BLNK,FBXW7,玲娜,KMT2D,TAF1L,TCF7L2,TP53)突变至少15%的样本。经常突变基因,TP53和BCL2对恶性肿瘤突变患病率有一致的趋势,而其他两个基因(HNF1A和FBXW7)表现出相反的趋势。HGD腺瘤变异率要明显高于乐金显示器腺瘤,而LGD-H腺瘤表现出突变频率与乐金显示器腺瘤相似。拷贝数变异频率大幅提高观察从乐金显示器通过HGD恶性样本。先进的CNADs证明突变的变化模式的分析结直肠初癌。有限数量的重复基因突变而多数是在单一情况下改变。大多数基因改变腺瘤可以被认为是早期大肠癌的贡献者致癌作用。

1。介绍

癌症是高度异构的多基因疾病,出现在多步microevolutionary过程涉及连续发生的细胞克隆的选择响应特定的环境因素,以及遗传影响。结直肠癌(CRC)是一种常见的上皮瘤形成全球和癌症相关的发病率和死亡率的主要原因1]。选择性生长优势的结果在正常的邻居,不典型增生细胞分子改变的形态学影响导致进步的细胞学和架构混乱,辨认adenoma-carcinoma序列,首先描述了Fearon和福格斯坦2]。有多个结直肠肿瘤通路,包括染色体不稳定(CIN)途径,微卫星不稳定性(MSI)通路,CpG岛methylator通路(CIMP,也称为锯齿状的瘤形成通路)(3]。

大多数crc是零星的,只有5 - 10%的肿瘤发展中作为高度渗透遗传综合症的一部分,由罕见的遗传突变基因DNA错配修复或腺瘤息肉病杆菌(APC)基因4]。一项研究显示,癌症基因组图谱,TCGA的大约四分之三的crc MSI,展览hypermutation[15%左右5]。Nonhypermutated肿瘤常见的“司机”突变APC,TP53,喀斯特,PIK3CA,FBXW7,SMAD4,TCF7L2,国家管制当局方面,CTNNB1,SMAD2,FAM123B,SOX9,自动取款机,ARID1A,而hypermutated肿瘤通常有改变ACVR2A,APC,TGFBR2,BRAF,MSH3,MSH6,SLC9A9,TCF7L2。nonhypermutated和hypermutated肿瘤,改变“癌症基因”目标WNT, RTK / RAS, PI3K TGF -β和TP53的途径6),证明了CRC的遗传复杂性可能局限于各种突变信号和代谢途径(3]。在染色体层面,nonhypermutated肿瘤倾向于非整倍体,而hypermutated肿瘤near-diploid [6]。

组织学检查传统结直肠腺瘤(CNADs)分类是基于他们的比例的绒毛组件(管状、tubulovillous或绒毛状腺瘤)和发育不良的严重程度(低等级或优质)7]。绒毛生长和高档发育不良(HGD)是最重要的决定因素与腺瘤的风险转变成恶性增生,也与腺瘤大小密切相关8];然而,多数腺瘤稳定经济增长进程甚至倒退(9]。突变的APC,喀斯特,β-catenin代表关键事件发展的腺瘤,而突变的PIK3CA和TP53发生在发展为侵袭性CRC (10- - - - - -12]。最早的临床相关的crc肿瘤侵入黏膜下层,而不是肌肉层。现在仍不知道哪个分子改变诱导最后转向侵入性增长;因此,为了防止CRC,腺瘤和癌变前的锯齿状息肉应切除(3]。

虽然大规模的序列分析crc拥有先进的遗传特征的理解,我们的知识的良性和癌变前的CNADs仍然有限。最近确定突变概要,包括有限数量的基因,可以清楚地分辨CNADs和crc (13,14]。在这项研究中,我们比较了突变的概要文件和丰富发展CNADs向早期癌的深度测序409“癌症基因的编码区。“与先前的报告相一致5,13,14),产生变异的总数明显高于腺瘤表现出HGD比那些低级的发育不良(良性腺瘤);然而,他们没有良性腺瘤和癌之间差异。

2。材料和方法

这是一个回顾性研究使用石蜡包埋的集合结直肠息肉经内视镜息肉切除术移除玛丽亚·斯卡洛多斯卡·居里纪念癌症中心肿瘤研究所,华沙,波兰,2010年和2016年之间。根据病理报告,58岁 被推荐的评估病理学家(第二意见),18个息肉切除在一块,和40被使用零碎的技术。病人特征详细表1。

2.1。符合道德标准

所有程序都按照道德标准执行当地的生命伦理委员会同意了这个回顾性研究(批准ID: 13/2008和3/2019),根据1964年的赫尔辛基宣言的原则。

2.2。使用离子隔离和DNA测序AmpliSeq综合癌症面板

几个系列的部分准备每个标本的不同部分,并从每组上、下部分被病理学家评估相对细胞类型内容的控制。DNA分离部分代表给定组件(管状或绒毛状腺瘤),包含了上皮细胞的百分比最高。此外,包含HGD息肉的碎片和/或癌入侵macrodissected黏膜下层。总的来说,从85年肿瘤样本DNA提取使用QIAamp DNA FFPE (formalin-fixed)石蜡包埋组织工具包(试剂盒)后,制造商的协议。

DNA样本浓度测定用量子位荧光计(表达载体),制造商的指示后,储存在-20°C。离子AmpliSeq综合癌症面板图书馆准备从DNA的分析409癌基因和肿瘤抑制基因的编码区序列使用离子质子系统(热)。

2.3。Postsequencing数据调用分析和变体

原始序列读取处理使用洪流套件分析管道和映射到人类基因组组装使用TMAP hg19。变体调用调用者是用激流变体(5.6.0版本),使用默认参数体细胞变异。称为变体与bcftools过滤(版本1.3)使用以下参数:phred-scaled , , indels和≥2个snp, 单核苷酸多态性和indels > 10, 单核苷酸多态性, indels。过滤变体进一步过滤使用fpfilter工具使用默认参数除了以下:min-strandedness, 0.05;——max-mapqual-diff 10;——max-readlen-diff 10;max-mm-qualsum-diff, 50。变异与 等位基因总数的观察被丢弃。注释的变异和预测后果成熟的蛋白质进行了使用ANNOVAR [15使用筛选[],deleteriousness评估16]和PolyPhen [17)算法。变异与人口 ,根据1000年基因工程数据库(欧洲和全球),外显子组测序项目的国家心脏,肺和血液研究所(18),外显子组聚合财团数据库(19),被丢弃。清单的概率降低当地居民的生殖系特定变体,我们删除了所有变异出现在超过35%的样本。

拷贝数变异(CNVs)被称为使用反(2.0.8版本,20.])使用默认参数(除了-minReadDepth,设置为32),并创建一个参考基准使用测序结果从78年从胰腺囊肿患者血液样本收集分析了平行的另一个项目。基因拷贝数异变在≥20%的样本尽可能丢弃的假阳性结果。

2.4。司机突变,产生的变异分析

两种类型的突变被指定:产生的罕见突变和所谓的“司机”突变。产生的变异被认为是驱动突变如果他们至少满足下列条件之一:(i)指定的一个已知的基因(如司机领带(21),(2)癌症司机罗斯福(≤0.1(计算使用鸿沟22),(3)基因与癌症司机罗斯福≤0.1的价值。

突变频率的变化趋势的良性与恶性息肉样品通过标本使用Cochran-Armitage趋势评估测试。司机的数量和产生的变化进行评估通过线性回归,以良性息肉为参考。

随机森林分类器是准备三组,良性腺瘤,HG腺瘤和癌,考虑产生的存在与否和司机突变基因。的意义值评估使用rfPermute包(https://cran.r-project.org/web/packages/rfPermute/index.html埃里克·阿切尔)。

3所示。结果

建立基因在结直肠肿瘤的频谱分析,我们测序409癌症相关基因编码区域85年样本切割从58岁 。其中,19个样本从腺瘤(十管和九tubulovillous)只包含低级发育不良(乐金显示器、良性腺瘤),21岁来自腺瘤与乐金显示器与同步高档异生腺瘤或癌相关组件(premalignant-related腺瘤)(LGD-H), 28日来自高档发育不良(HGD)腺瘤,和17名来自粘膜下浸润性癌(AC)。的统计分析为目的的突变频率,乐金显示器和LGD-H团体被视为一个。

测序深度中值为750×,> 95%的目标序列覆盖在≥50×76个样本(90%)。我们确定了956个独特的单核苷酸变异在409个基因中综合癌症面板(表S1)。其中,499年被认为是产生的等位基因变异。平均基因变异率为15.7 / Mb,和产生的变异率为8.0 / Mb;平均每个样本的发现产生的变异数10.3。总共1632点突变序列中发现包含在综合癌症面板。的平均速度突变在癌症基因组图谱(TCGA) CRC数据集是8.8 / Mb。而在五(5.9%)样品,nonsilent突变率20 - 30 / Mb,没有一个可以被视为hypermutated。遗传方差在调查样本的结构呈现在图1。

八百四十三独特的基因拷贝数异变在292个基因被确定。平均数量的基因拷贝数异变在乐金显示器样品(12.4)显著低于HGD样品(43.6, )。同样,意味着数量的基因拷贝数异变在CA样品(76.1)显著高于HGD样本( )。

产生的变异(表S1)提交进一步分析。总共92个司机基因选择(表S2)。九个基因都突变;即。,they carried a nonsynonymous mutation in at least one sample per group and were mutated in ≥15% of samples on average (Table2(一个)),其他两个基因突变在≥15%的样本平均而不是突变的肿瘤组(表2 (b))。

六个基因表现出显著的趋势变化产生的变异频率从良性的恶性组(名义值< 0.05),其中HNF1A,TP53,FBXW7,BCL2平均变异在≥10%的样品。突变的比例为TP53和BCL2上涨,这些的FBXW7和HNF1A拒绝在CA进程。这四个基因也表现出显著趋势驱动突变的比例由于所有产生的突变被认为是驱动突变(表2(一个)和2 (b)、表S3)。

随机森林分类器指定10个基因,其中一个司机突变的存在与否是统计学意义在至少一组(名义上的分类 ,表3)。三个基因对整个模型的建设也很重要:喀斯特,HNF1A,TP53。

4所示。讨论

逐步,非随机的等位变异积累基因调节细胞增殖、分化,细胞凋亡可以引起异常扩张的肠上皮腺瘤。在特定基因序列的改变,包括APC和喀斯特有助于早期息肉样病变的发展,而其他基因畸变,灭活突变等TP53,能促进恶性肿瘤,观察到更高级的发展阶段的CRC (23]。Intratumor异质性,造成不同的积累,会导致不和谐的突变的肿瘤细胞腺瘤息肉的孤立的从不同的组件。例如,43%的和51%的癌腺瘤组件组件从70年肿瘤样本包括腺瘤和癌阳性喀斯特突变,而23%产生不和谐的结果(24]。此外,喀斯特突变被发现在一个小数量的样品从组织学上癌旁正常结肠粘膜(25]。

突变,提供一个司机改变生长优势,而那些巧合的发生与司机乘客事件(被称为26]。等位基因变异在腺瘤可以被认为是早期司机事件导致肿瘤发生的起始,而富含癌可分为后驱动突变参与肿瘤恶化。尽管高突变负载的腺瘤,肿瘤形成的各种突变的贡献有所不同(27]。因此,只有一小部分腺瘤会发展成为CRC,剩下大部分稳定甚至回归。而< 5%的小管状腺瘤,乐金显示器会转变成CRC (28),10年累积的风险一个先进的腺瘤(≥25%绒毛状组件、HGD或 )发展成癌症是55岁的患者为25%,增加大约40%的80岁(29日];因此,性腺瘤有潜在恶性肿瘤高于nonadvanced腺瘤(3]。尽管如此,现在仍不知道哪个分子改变诱导最终转向恶性肿瘤。

我们分析了突变的组件配置文件CNADs完全由乐金显示器或乐金显示器同步HGD和/或癌组件。相应的正常样本用时,我们采用高度严格的过滤,基于现有数据库的变异。所有变异出现在> 0.1%的人口被丢弃,导致减少变异数据集> 10倍。使用离子AmpliSeq综合癌症面板,它提供了多路复用的目标选择的所有外显子409年肿瘤抑制基因和致癌基因与癌症,我们确定了956个独特的变异(毕竟过滤步骤),其中499被认为是产生的等位基因变异在214年“癌症基因。“在这些突变基因,与先前的研究一致5,13,14),APC,喀斯特,SYNE1变异在76.5%、62.3%、和35.3%的样本,分别,另一个11个基因(BCL2,BLNK,FBXW7,玲娜,LRP1B,MLL2 / KMT2D,MLL3 / KMT2C,PKHD1,RNF213,TAF1L,TCF7L2,TP53)突变在≥10%的样本。虽然大多数的等位基因变异被发现在个别情况下,在两个或两个以上的所有基因都突变癌组件也改变了至少在一个腺瘤组件。“私人”变体可能出现腺瘤发展处于初级阶段,生成multiclonal腺瘤(30.]。

突变的研究概要文件的同步结肠腺瘤和CRC使用全外显子组测序(韦斯),李et al。14)发现nonsilent等位变异基因在癌症普查,APC,喀斯特,TP53,玲娜,国家管制当局方面,SMAD4,ARID2,PIK3CA在12 HGD腺瘤,在古典adenoma-carcinomas匹配序列,并报告等位变异MTOR,ACVR1B,GNAQ,自动取款机,CNOT1,EP300,ARID2,受潮湿腐烂,MAP2K4首次在结肠腺瘤(2,10]。林等人发现了四个额外的影响基因(CTNNB1,KRTAP4-5,GOLGA8B,TMPRSS13在腺瘤),代表了潜在的新躯体驱动突变致癌基因的特征(13]。大多数的突变基因之前报道腺瘤(5,13,14在我们的研究还发现;然而,大多数出席一个低频率。

138潜在驱动基因(74 64年肿瘤抑制基因和癌基因),一个典型的零星的CRC可能只包含2 - 8司机基因改变,使每个肿瘤独特的(31日- - - - - -33]。9423年覆盖肿瘤外使用26个计算工具,299年司机基因编目最近在解剖网站和癌症的上下文/细胞类型(34]。APC,喀斯特,BRAF,PIK3CA,SMAD4,TP53是最常见的“司机”晚了crc (35];然而,区分罕见的司机突变和乘客仍然具有挑战性。基于严格的标准驱动基因分类,我们选择92年影响性腺瘤基因,可以在结直肠肿瘤发生早期被认为是司机。

基因突变患病率显示一致的趋势从nonadvanced性腺瘤和CRC可以反映出恶性肿瘤的进展13]。在突变TP53和PIK3CA是晚期CRC的特征36),致病性TP53等位基因变异也被报道在结肠腺瘤(10,14]。在这项研究中,0%,21.4%,和35.3%的LG腺瘤、HG腺瘤,和同步癌组件,分别受到影响TP53突变。TP53是一个相当一致的趋势的两个基因突变对恶性肿瘤发病率,而其他四个基因(HNF1A,KAT6B,FBXW7,NFKB1表现出相反的趋势,对癌突变频率降低。类似的增加然后减少在一个特定的基因突变的频率结肠肿瘤发生之前已经指出[37]。这些可能代表突变作为结直肠致癌的司机在一个特定的阶段,其次是损失当他们的角色不再是必不可少的生长优势(37,38]。也有可能观察到的基因的突变频率降低或增加资料结果从不同的发展水平对恶性肿瘤在腺瘤组织。

基因参与WNT信号通过进化高度保守的,在多个基因编码的关键蛋白质和复发性突变规范化WNT /β连环蛋白信号通路发生在一个广泛的人类癌症39,40]。在这些基因中,APC和CTNNB1(编码β连环蛋白)是关键因素的重组核T细胞因子/淋巴增强因子(TCF /中位数)转录网络。大多数的APC突变结直肠肿瘤被删除并影响WNT通路(35]。正如预期的那样,我们发现APC是最常见的突变基因的腺瘤,而其他WNT通路基因(CTNNB1,EP300,TCF7L2,AMER1)改变的频率更低。所有这些基因涉及WNT-dependent肿瘤生长的司机(39]。这两个APC和CTNNB1经典的致癌基因,而AMER1(也称为肿瘤基因位于X染色体上,WTX)是一种肿瘤抑制基因(41]。除了WNT-related基因,其他突变基因,包括BCL2,FBXW7,玲娜,HNF1A,喀斯特,MLL2 / KMT2D,MLL3 / KMT2C,SYNE1,TCF7L2,TP53,NOTCH1,叫做PBRM1,受潮湿腐烂,RARA,FN1结直肠肿瘤发生的,可以被认为是司机。

人类基因组结构的变化,包括删除、插入、复制,和大规模的拷贝数变异,集体称为基因拷贝数异变。基因拷贝数异变在正常基因表达的影响因素和各种癌症组织(42- - - - - -44]。正如预期的那样,我们发现进步增加基因拷贝数异变从乐金显示器通过HGD恶性样本。大多数零星的crc CIN和可能部分归因于体细胞APC突变(45]。然而,第一次大规模基因组分析调查罕见基因拷贝数异变在零星的CRC表示,罕见的基因拷贝数异变CRC的风险增加和染色质的组装或nucleosome-related olfaction-associated基因可能导致这种风险46]。因此,基因组不稳定性在CRC肿瘤发生可能不相关APC突变或在WNT信号通路相关的改变。有趣的是,比较基因畸变检测在正常结肠CRC患者样本中发现相应的息肉组织和外周血表明基因拷贝数异变,不仅在肿瘤组织中,而且在正常结肠和血47]。

总之,我们在HGD证实突变负载的增加与乐金显示器腺瘤相比,虽然腺瘤有突变的癌组件加载与乐金显示器腺瘤相似(图1)。此外,腺瘤的基因拷贝数异变逐步增加样本的数量代表乐金显示器HGD, CA样本。大多数基因的改变在本研究中发现,包括那些参与WNT信号通路,可以被认为是早期大肠癌的贡献者致癌作用[48];然而,只有有限数量的基因都突变在≥10%的情况下,虽然大多数基因变化影响单例。这些突变的最终贡献CRC肿瘤发生的过程仍不清楚。

数据可用性

测序数据集不公开由于关注保护个别病人保密,但可从相应的作者以合理的要求。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

Jakub Karczmarski和Krzysztof Goryca贡献同样这项工作。

确认

本研究支持的内部格兰特(GW16JP)和美国国家科学中心格兰特(2012/05 / D / NZ2/01623)。

补充材料

补充表S1:变异识别评估样本:基因记号的基因地图或给定的变体的名字最近的基因;函数。相对于基因变体的refGene-location;census-indication如果一个给定的基因与CRC发展根据基因癌症普查;变种的染色体,position-genome坐标;REF / ALT-reference /替代变量序列;variantsFound-number样本变异被发现;GT-genotype检测到在一个给定的样本(0:参考,1:替代);SAF /吸收率正向/反向链支持替代变量的读取;DP / SAF吸收率高质量的读/ nonreference读从正向链/ nonreference读反向链,分别在一个给定的位置在一个给定的病人; ExAC_XXX—frequency of the alternative variant in XXX population according to the ExAC database; 1000g_all/eur—variant frequency in the 1000 Genomes Project database (total/European); esp6500siv2_all—variant frequency according to National Heart, Lung, and Blood Institute GO Exome Sequencing Project; SIFT/Polyphen2/LRT/FATHMM/RadialSVM “_pred”—prediction of variant impact on protein structure: B—benign, N—neutral, T—tolerated, and D—deleterious; and ICGC_Id—variant ID in the ICGC database (known cancer-related variants). Heterozygous variants are marked orange, homozygous are marked red. Supplementary Table 2: driver genes and criteria for inclusion: TSG—tumor suppressor gene, Oncogene; CHASM—gene included for its composite鸿沟的价值;CHASM-single-gene单驱动突变,根据鸿沟。补充表3:全部结果Cochran-Armitage趋势测试产生的,司机突变。(补充材料)

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