乙型肝炎患者中lncRNA-HEIH和lncRNA-HULC与HBXIP的相互作用

摘要

乙型肝炎病毒(HBV)感染是肝硬化(HC)和肝细胞癌(HCC)发生的主要危险因素，在世界范围内具有很高的发病率和死亡率。许多研究表明，长链非编码rna (lncrna)在HCC中高表达(lncRNA-HEIH)，在肝癌中高表达(lncRNA-HULC)，参与了乙型肝炎相关HC和HCC的发生发展。本研究通过逆转录和定量PCR检测lncRNA-HEIH和lncRNA-HULC的表达，western blot检测乙型肝炎x -相互作用蛋白(HBXIP)的表达。采用RNA免疫沉淀法检测HBXIP与lncRNA-HULC和lncRNA-HEIH的相互作用。结果显示，lncRNA-HEIH、lncRNA-HULC、HBXIP在乙型肝炎患者中升高，特别是在乙型肝炎相关HCC患者中。lncRNA-HEIH和lncRNA-HULC均与HBXIP相互作用。提示在乙型肝炎相关疾病中，lncRNA-HEIH和lncRNA-HULC与HBXIP相互作用。

1.介绍

乙型肝炎病毒(HBV)感染仍然是一个重大的公共卫生问题，影响着全世界3.5亿多人，尽管已经出现了有效的疫苗和其他控制措施[1- - - - - -3.]。慢性乙型肝炎病毒感染的特点是检测血清乙型肝炎表面抗原(HBsAg)感染连续6个月后肝脏炎症和激活的纤维发生的过程,从而导致肝硬化(HC)、失代偿性的肝脏疾病(症状),和肝细胞癌(HCC)的发展在25% - -40%的乙肝病毒携带者3.]。因此，迫切需要找出新的和有前途的乙肝相关疾病的诊断标志物和治疗靶点。HBV是含有四个双链DNA病毒部分重叠的开放阅读框，编码C，S，和X蛋白，和病毒DNA聚合酶[4]。在这四种蛋白中，只有X蛋白(HBX)与肿瘤发生明显相关[5]。乙型肝炎x -相互作用蛋白(HBXIP)最初是通过与HBX的c末端相互作用确定的，已发现其可促进肝癌细胞生长并促进肿瘤发生[6]。

长链非编码RNA (Long noncoding RNAs, lncRNAs)是一类长度为200个核苷酸的RNA片段，由于其编码蛋白质的能力有限，被认为是基因组转录的“噪音”[7]。随着病毒研究的不断发展，它已经表明，lncRNAs中的蛋白质编码基因的调控中发挥重要作用，干细胞分化，等位基因表达，细胞周期调控和细胞死亡[8- - - - - -11]。此外，lncRNAs的异常表达已被广泛与许多疾病的生理和病理过程相关联。因此，lncRNAs作为治疗目标的潜力已经提出并在最近的几项研究测试。A 16 kb lncRNA found at chromosomal location 6p24.3, which is highly upregulated in liver cancer (lncRNA-HULC) and HCC, is composed of one intron and two exons [12,13]。此外，在HCC中高表达的lncRNA (lncRNA- heih)与疾病复发相关，被研究为b型肝炎相关HCC患者总生存的独立预后因素[11]。虽然发现lncRNA-HULC和lncRNA-HEIH在HCC中表达水平升高，但其潜在的分子机制尚不清楚。

本研究旨在量化lncRNA-HULC、lncRNA-HEIH和HBXIP在HBV感染和乙型肝炎相关疾病患者中的表达水平。

2。材料和方法

2.1。道德守则

研究协议是人民医院的伦理委员会批准安吉,依照《赫尔辛基宣言》的原则和涉及人体受试者的医疗卫生研究中的伦理指南由美国国立卫生研究院的建立和人类研究委员会安吉的人民医院。在使用外周血和肝脏组织时，得到了所有患者或其直系亲属的书面知情同意。

2.2。外周血样本

收集在安吉人民医院接受治疗或体检的75例hbv阳性患者和25例hbv阴性正常对照组的外周血。HBV或其他病毒感染(如甲型、丙型、D型、E型和I型肝炎病毒)或肝脏疾病(如肝囊肿和肝转移)的患者不纳入分析。100名研究参与者被分为以下四组( : hbv阳性组(14名女性和11名男性，无hbv相关疾病);HBV + HC组(女性12例，男性13例，合并HBV相关疾病及HC);HBV + HCC组(女性10例，男性15例，合并HBV相关疾病和HCC);或对照组(13名女性和12名男性，年龄匹配，HBV阴性，无感染、精神、神经或代谢性疾病史)。表中总结了所有研究参与者的临床特征1.

2.3。肝组织

乙型肝炎病毒-positive HCC tissues and corresponding adjacent noncancerous liver tissues (NT) were obtained from patients in the HBV + HCC, HBV-HCC, HBV + NT, and HBV-NT groups who underwent resection in our hospital. On account of the ethical limitation, liver tissues were not collected from the normal controls, HBV carriers, or HBV-positive patients with HC. Thus, normal and cirrhotic liver tissues were not assessed in this study. The clinicopathological characteristics of the study participants are summarized in Table2.

2.4。RT-qPCR

RT-qPCR检测lncRNA-HULC和lncRNA-HEIH的表达。总RNA分离外周血样本,肝组织,HepG2.2.15细胞使用试剂盒试剂(美国英杰公司公司,卡尔斯巴德,CA)然后反向转录成cDNA Veriti 96孔热循环仪(美国应用生物系统公司,卡尔斯巴德,CA)使用PrimeScript RT试剂盒和gDNA橡皮擦(豆类生物科技(大连)有限公司,大连,中国)。每个RT-qPCR反应含有2个μcDNA的L, 0。4μ正向引物的L, 0。4μL的反向引物，7.2μL H₂O₂,10μ大号SYBR®绿色主MIXI（宝生物工程（大连）有限公司）。The RT-qPCR protocol consisted of an initial denaturation step at 95°C for 30 s, followed by 40 cycles of amplification at 95°C for 5 s and at 60°C for 34 s, and a final elongation step at 95°C for 15 s. Melting curve analyses were also performed (65.0 to 95.0°C at 0.5°C increments for 5 s). Experimental cycle threshold values were normalized to glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) and the relative gene expression levels were determined using the 2^{- - - - - -△△CT}方法 [14]。RT-qPCR引物序列为:LncRNA-HEIH:正向(F)/反向(R) CCT CTT GTG CCC CTT TCT T/ATG GCT TCT CGC ATC CTA T;LncRNA-HULC:(F/R) AAC CTC CAG AAC TGT GAT/CAT AAT TCA GGG AGA AAG;mRNA: (F/R) GCC TTA GAG TCT CCT GAG CA/GAG GGA GTT CTT CTT CTA GG;和GAPDH:(F/R) GAA GGT GAA GGT CGG AGT C/GAA GAT GGT GAT GGG ATT TC。

2.5。RNA免疫沉淀（RIP）

使用Magna RIP rna结合蛋白免疫沉淀试剂盒(EMD Millipore Corporation, Billerica, MA, MA)按照说明书进行RIP分析，检测LncRNA-HEIH/LncRNA-HULC和HBXIP之间的相互作用。简单地说，肝组织或收获的细胞在RIP裂解液中裂解，然后在含有连接到抗HBXIP抗体(Abs) (Abcam，剑桥，英国)或正常兔免疫球蛋白(Ig) G (Abcam)的RIP缓冲液中孵育。用蛋白酶K孵育消化蛋白，RT-qPCR检测共沉淀RNA。

2.6。免疫印迹分析

总蛋白提取从肝脏组织和HepG2.2.15细胞,然后量化,稀释5×加载缓冲同一浓度,变性在95°C,由钠十二烷基sulfate-polyacrylamide凝胶电泳,然后转移到聚偏二氟乙烯膜,阻止了5%的脱脂牛奶在室温下2小时,然后用Abs孵化HBXIP(稀释,1:1000;Abcam)和GAPDH(稀释1:3000;在4℃过夜。之后，膜用Tween 20的tri缓冲盐水洗涤三次，用辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔抗体孵育(稀释1:4000;并用吐温20洗涤三次。然后，使用增强化学发光试剂(Santa Cruz Biotechnology Inc.， Dallas, TX, USA)对蛋白条带进行可视化，并用fx7系统(Vilber Lourmat, Collegien, France)进行密度计扫描定量。将样本的平均光密度归一化为GAPDH的平均光密度。

2.7。统计分析

All data are expressed as the mean ± standard deviation and were analyzed using thet用SPSS 11.5版软件（SPSS公司，Chicago，IL，USA）方差-test，卡方检验或单向分析确定显着性。概率（ )的<0.05值被认为是统计学显著。

3.结果

3.1。在外周血和肝脏组织LncRNA-HEIH和L​​ncRNA，HULC的表达水平

According to the RT-qPCR results, the expression levels of LncRNA-HEIH and LncRNA-HULC were significantly upregulated in the peripheral blood of HBV-positive patients (HBV, HBV + HC, and HBV + HCC groups), as compared to the control group ( ,数字1(一))。且HBV + HCC组比HBV、HBV + HC组更明显( ,数字1(一))。同样，LncRNA-HEIH和LncRNA-HULC在HCC患者肝组织(HBV + HCC组和HBV-HCC组)中的表达水平明显高于相应的邻近非癌肝组织(HBV + NT组和HBV-NT组)( ,数字1 (b))。此外，HBV + HCC和HBV + NT组肝脏组织中LncRNA-HEIH和LncRNA-HULC的表达水平高于HBV-HCC和HBV-NT组，说明HBV阳性肝脏组织中LncRNA-HEIH和LncRNA-HULC的表达水平高于HBV-阴性肝脏组织( ,数字1 (b))。

3.2。LncRNA-HEIH和L​​ncRNA，HULC与免疫共沉淀HBXIP

进行RIP检测以确定HBXIP是否与LncRNA-HEIH和LncRNA-HULC相互作用。使用抗HBXIP和IgG抗体的RIP实验获得的RNA进行RT-qPCR分析。结果表明，HBXIP Ab预处理后的LncRNA-HEIH和LncRNA-HULC的表达水平高于IgG预处理后的( ,数字2(一个)），这表明LncRNA-HEIH和L​​ncRNA-HULC免疫共沉淀与HBXIP。随后，HBXIP的表达水平通过Western印迹分析肝组织进行定量。如图2 (b),the expression levels of HBXIP were notably increased in the liver tissues of patients with HCC (HBV + HCC and HBV-HCC groups) as compared to corresponding adjacent noncancerous liver tissues (HBV + NT and HBV-NT groups) ( )HBV + HCC和HBV + NT组高于HBV-HCC和HBV-NT组( )。

4。讨论

随着高分辨率微阵列技术和大规模并行测序技术的发展，人们普遍认为90%以上的人类基因组被积极转录成非编码rna (noncoding RNAs)，只有不到2%的人真正编码蛋白质[15]。的非编码RNA被分类为根据大小小非编码RNA（<200个核苷酸）和lncRNAs（> 200个核苷酸）。虽然这些RNA被认为是基因组转录的“噪音”而实际上并没有直接参与编码基因和蛋白质的合成，他们可能会在一个伟大的各种疾病，如乙肝感染的发挥显著的调节作用[16- - - - - -19]。例如，小ncRNA miR-137通过靶向蛋白抑制剂STAT 2的表达促进HBV基因的表达和病毒复制[20.]。此外，miR-99家族通过IGF-1R/PI3K/Akt/mTOR/ULK1信号诱导的自噬后转录促进HBV复制[21]。近年来，lncrna在乙型肝炎相关疾病中的重要作用也越来越明显[22,23]。然而，很少有研究研究lncrna参与乙型肝炎相关疾病的机制，因此其机制尚不清楚。然而，已有研究表明，lncrna在蛋白编码基因调控、干细胞分化、等位基因表达、细胞周期控制和细胞死亡等方面发挥着重要作用[8- - - - - -11]。此外，lncrna广泛参与生理和病理过程，已成为分子生物学领域的主要研究热点[24]。

在HCC中lncRNA-HULC和lncRNA-HEIH表达水平较高。lncRNA - hulc位于染色体6p24.3上，被认为是HCC中首个具有高特异性上调的lncRNA，提示其可作为一种有前景的非侵入性新型生物标志物用于HCC的诊断和/或预后[11,12]。Du等认为HBX可促进lncRNA-HULC在人永灭正常肝L-O2细胞和肝癌HepG2细胞中的表达，通过抑制p18导致肝癌细胞增殖增加[1,25]。此外，刘等人。表明对lncRNA-HULC的突变可能有助于减少肝癌的易感性在持续性HBV携带者[26]。此外，lncRNA-HULC的表达与乙肝感染的进展以及乙肝相关疾病如HC、HCC的发生呈正相关。同样，在本研究中，lncRNA-HULC在对照组、HBV组、HBV + HC组和HBV + HCC组的外周血标本中表达逐渐升高。此外,lncRNA-HULC表达更大的乙肝病毒阳性的肝组织和HBV-negative肝癌组与相应的相邻的非癌变肝脏组织(HBV + NT和HBV-NT组)和表达lncRNA-HEIH和lncRNA-HULC大的肝组织HBV +肝细胞癌和乙肝病毒+ NT组比HBV-HCC和HBV-NT组,这与先前的研究结果是一致的(27]。类似地，lncRNA-HEIH，另一个高度表达lncRNA在HCC，表明在患者的外周血和肝组织乙型肝炎或乙型肝炎相关疾病的lncRNA-HULC相同的表达的趋势。杨等人。发现lncRNA-HEIH抑制细胞分化在G0 / G1期和加速乙型肝炎相关HCC的发生[11,28]。提示lncRNA-HULC和lncRNA-HEIH与乙型肝炎感染及乙型肝炎相关疾病呈正相关。我们知道，lncrna参与基因调控的各个方面，包括染色体剂量补偿、印迹、表观遗传调控、核质运输、转录以及mRNA的剪接和翻译[29]。本研究通过RIP分析进一步研究了HBXIP与lncRNA-HULC和lncRNA-HEIH的相互作用，结果显示hbv阳性的HCC中HBXIP的表达大于hbv阴性的HCC。Wang等认为HBXIP可能通过增强肝癌血管生成在肿瘤发生中发挥重要作用[6]。因此，lncRNA-HULC和lncRNA-HEIH的高表达可能促进了HBXIP的表达，从而导致HBV复制增加，导致乙型肝炎相关疾病的发生。

综上所述，本研究结果表明，lncRNA-HULC和lncRNA-HEIH与HBXIP的相互作用可能参与了乙型肝炎相关疾病的发生。了解lncRNA-HULC和lncRNA-HEIH与HBXIP在乙型肝炎及乙型肝炎相关疾病中的关系，可能有助于开发新的治疗干预措施，改善肝炎网络功能障碍及相关疾病。

数据可用性

支持本研究结果的数据可从通讯作者处获得。

利益冲突

作者无利益冲突需要申报。

作者的贡献

阮玲娟和黄立仪对这一工作同样做出了贡献。

致谢

感谢捐献外周血和肝组织的患者及其家属。本工作由湖州市科技局公益应用研究项目(项目号:2017GY67)资助。

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