基于全面测序的丙型肝炎病毒相关早期肝细胞癌的突变分析

摘要

背景。肝细胞癌（HCC）作为中国发病率越来越多的癌症相关死亡率的第三个主要原因。本研究旨在探讨通过全外壳测序探讨含有HCC肿瘤引发和进展的早期遗传变化。方法．我们首先测序了5种成对乙型肝炎病毒相关的早期HCC和外周血样品的整个外部，其次是基因本体类别分析和对单核苷酸变异的途径分析。然后，通过Sanger测序进一步证实高频率的突变。结果。我们鉴定了优势T的突变签名：A> A：T在早期HCC中的横转化，并且具有显着富集的途径，包括ECM-受体相互作用，轴突引导和局灶性粘附和富含细胞粘附，轴突引导和pH调节的富集的生物方法。八个基因，包括MUC16，UNC79，USH2A，DNAH17，PTPN13，Tenm4，PCLO和PDE1C经常突变。结论．该研究揭示了突变型材和具有HBV感染早期HCC早期HCC中的T：A> A：T转化的不同突变特征，其将丰富我们对早期HCC的遗传特征的理解。

1.介绍

肝细胞癌(HCC)是中国癌症相关死亡的第三大原因[1］.与此同时，它的发病率往往在过去十年中趋于增加[2］.2012年，Globocan报告了大约782,500例新肝癌病例[2］.尽管近年来在病毒性肝炎的治疗方面取得了巨大的进展，在诊断和治疗肝脏肿瘤方面也取得了最新的手段，但这种恶性肿瘤的预后仍然令人沮丧[3.，4］.随着发病率接近死亡率，大多数HCC患者死于这种致命疾病[5］.

连续基因变化的多步骤过程是癌症发展和进展背后的核心驱动力[6］.在这个新的高通量基因组和外显子组测序技术的时代，以高分辨率探索癌症基因组并对给定的人类癌症中的每个基因突变进行分类是可行的。最近对多个HCC队列中外显子和基因组的测序研究发现了许多不同病因的新分子变化，包括复发性基因突变TP53，ARID2，ARID1A，CTNNB1，AXIN1，RPS6KA3， 和IRF2［7- - - - - -10]，以及常见改变的主要通路，如染色质重塑和Wnt/ -连环蛋白通路[7，9］.然而，hcc相关的体细胞突变在个体之间，甚至在单个肿瘤内都有很大的差异。由于这种巨大的多样性，没有明确的遗传特征被识别来分层突变，而研究针对HCC的新靶向策略的药物研究遇到了巨大的挑战[11］.唯一批准的FDA批准的药物治疗先进的HCC，Sorafenib，仅仅延长患者的寿命，平均为2.8个月，并伴随着一系列副作用[12］.因此，进一步研究这种恶性肿瘤的分子发病机制仍势在必行。

全球有超过2.4亿人受到慢性感染[3.，乙型肝炎病毒(HBV)是导致肝癌发生的最重要因素，在发展中国家，肝癌占所有肝癌病例的3/5以上，在发达国家占略低于1/4 [13］.HCC的各种风险因素可能影响相应癌症基因组的突变谱[14］.此外，针对癌症发展的早期步骤限制了随时间发展的遗传多样性。基于以上考虑，我们对5对HBV感染的早期HCC (eHCC)和外周血样本进行了全外显子组测序研究。本研究旨在破解HCC肿瘤发生和发展过程中涉及的遗传变化，并推进治疗策略和早期诊断的发展。

2.材料和方法

2.1。患者和样品

在中山医院肝癌研究所(复旦大学，中国上海)采集行根治性切除的患者的5对HCC标本和外周血标本，立即在- 80°C下冷冻，随后进行病理检查，经经验丰富的病理学家确认为HCC。这些患者之前没有接受任何治疗，如经动脉化疗栓塞或射频消融。中山医院伦理委员会批准了本研究，每位患者根据机构审查委员会协议签署知情同意书。

2.2。全极端捕获，排序和突变分析

使用DNeasy组织试剂盒（QIAGEN），提取来自5名患者的配对肿瘤/正常基因组DNA，并随机超声处理，以产生150-200bp产品。在用3'A悬垂和Nimblegen接头适应的终端修复后，将Ampure XP珠纯化的DNA片段进行LM-PCR。根据制造商的协议，制备的DNA文库与Agilent Sureselectxt人的所有外显子套件杂交，以捕获目标外壳。在另一轮LM-PCR之后，通过QPCR确认所有捕获序列的QPCR确认至少80倍的富集。然后在Illumina Hiseq2000平台上测序execond DNA文库。通过挖掘机轮式对齐器（BWA，版本0.6.2）软件，从UCSC基因组浏览器对齐对人参考基因组（GRCH37 / HG19）的测序读取并通过SAMTOOLS软件删除PCR复制。为了检测潜在的变体，我们使用基因组分析工具包（GATK）来执行互联呼叫，并且发现管道详述图S1．通过以下标准，每个配对样品的体细胞变体是合理的：（1）PHRED-SCALED共识分数> 20和映射品质> 30;（2）变体读数≥10％的总读数;（3）变体读数≥5和总读数≥10。我们通过与DBSNP135和1000个基因组项目数据库进行比较除去常见的多态性（http://www.1000genomes.org)，以及在正常外显子中发现的同义突变和变异。利用整合基因组Viewer (Integrated Genomics Viewer, IGV)软件对所有候选突变进行检测，并在每个肿瘤组织和配对血样中通过基于pcr的Sanger测序进行确认。每个肿瘤的突变特征被应用解构图谱提取，如前所述[15］.

２.３.基因功能分析

具有SNV的鉴定基因进一步输入数据库以进行注释，可视化和集成发现（David;http://david.abcc.ncifcrf.gov) v6.7，使用GO来揭示基因谱中表示的分子功能。同时，这些基因被输入到京都基因和基因组百科全书(KEGG)中，以分析相关途径[16］.的截止建议值0.05。

3.结果

3．1.hbv相关eHCC的体细胞突变概况

为了了解hbv相关eHCC的遗传基础，我们对5例HCC患者(BCLC A期，1例肿瘤结节，直径≤3cm;表格1）.靶向偏振区的平均序列覆盖深度达到80.7倍（范围从68.3倍至92.2倍），中值深度为63.4倍（范围为54倍至73倍）。超过95％的目标exome获得至少一个读取的覆盖范围（表S1）.使用中描述的算法预测了体细胞单核苷酸变体（SNV）和小插入和缺失（Indels）图S1．简单地说，为了去除常见的种系变异，我们删除了dbSNP135或1000基因组项目数据中已经存在的候选突变，通过将肿瘤数据与匹配的外周血样本进行比较，确定了肿瘤特异性突变。总体而言，我们在708个基因中发现了736个潜在的蛋白改变体细胞突变，其中614个是错义突变，43个是无义突变，79个小突变(表S2和S3）;这种模式类似于固体肿瘤中发现的分布[17］.每个肿瘤的体细胞突变数量范围为52至308（图1(一))，与以前研究报告的数值相当[7- - - - - -9］.

值得注意的是，我们发现T: a > a:T转化具有很强的转录链偏倚，这影响了我们队列中5个个体中的4个(图)1 (b)）.case 5在所有突变类型中，该突变的突变率达到63.2%。在使用解构特希斯方法提取每个肿瘤样本snv的准确签名后，签名22，如在癌症体细胞突变目录(http://cancer.sanger.ac.uk/cosmic/signatures）由主导的T：A> A：T横向组成，被发现超过5个HBV相关的EHCC中的4个，并且当汇集所有SNV时（图S2）.此外，发现了过度表达的转位(速率，3.11)，这与之前的HCC测序研究结果一致[9，10］.

为了更好地了解hbv相关eHCC的潜在潜在机制，我们基于已鉴定的snv (表S4和S5）发现与细胞外基质 - （ECM-）受体相互作用相关的途径（ ，误发现率[FDR] = 0.04)，局灶粘连( ， FDR = 0.19)，以及阿米巴病( ，FDR = 0.19）是前3个显着富集的途径和细胞粘附（ ， FDR = 0.00)，轴突引导( ， FDR = 0.01)，调节pH值( ， FDR = 0.13)是富集程度最高的3个生物过程(图1 (c)和1 (d)）.

3.2。exame测序显示的候选躯体突变

总共有8个基因，包括MUC16, UNC79, USH2A, DNAH17, PTPN13, TENM4, PCLO和PDE1C，在至少2个HCC样本中被发现突变(见表)2）;基于pcr的Sanger测序进一步证实了这些基因上的17个候选体细胞突变(图)2，表S6）.每个突变都是杂合的，导致编码蛋白中相应氨基酸的序列发生变化。

4.讨论

癌症是基因组的疾病[18］.遗传改变，赋予选择性生长优势，由于各种因素和机制，在肿瘤发生过程中依次积累。尽管最近的外显子组和基因组测序研究已经检查了大量的HCC病例，并完善了突变格局，但我们对这种恶性肿瘤发生和进展中涉及的驱动突变和相关信号通路的了解仍远未完成。这就排除了使用基因测试来对患者进行分类和靶向治疗。

不同癌症之间的突变特征大相径庭[17］.多种致癌物也可能影响hcc中的体细胞替代模式，所确定的突变谱可能表明肿瘤细胞中发生的特定突变模式[19］.通过全外显子组测序，Huang等人．最近在相对晚期门静脉血栓形成的hcc中发现显性G:C>T:A和T:A>A:T转移[10］.基于外显子组测序，在eHCC中发现了T: a > a:T，而不是G:C>T: a。这种突变特征与在其他实体肿瘤中观察到的明显不同，在其他实体肿瘤中，C:G>T:A转变是主要变化[17］.值得注意的是，我们的研究与黄之间的突变谱的差异表明，不同的突变签名可能在癌症的不同阶段（例如，早期和晚期和晚期）。T：A-> A：T横向于尿液癌曝光后尿液癌（AA），通常，签名22表示AA曝光[20.］.虽然AA具有这种特征相似性，但AA并不是HCC的常见病因，本研究多次发现T: a > a:T的显性转移，但没有AA暴露等证据[10，21，这很难说都是因为意外的AA敞口。因此，显性T:A>A:T转录可能是hbv相关ehcc的一个独特的突变特征，但这一假设必须在更大的hbv相关ehcc样本中进行检验。

使用5例受SNV影响的突变基因，我们进行了GO和途径分析，并确定了ECM-受体相互作用，轴突引导和局灶性粘附，以及显着突变的途径和/或生物过程。值得注意的是，轴突引导被鉴定为显着突变的途径和生物过程。参与该途径的12个突变基因受到该队列中5例中的4例。轴突引导基因最初是其作用，其作用在引导轴突靶向其突触靶标中，从而形成神经连接并在胚胎发生期间将神经系统接线[22］.最近的测序研究显示，在各种人类癌症中，包括胃癌、胰腺癌和肝吸虫相关性胆管癌，轴突引导基因频繁和多样的体细胞突变，突出表明它们参与驱动恶性肿瘤[23- - - - - -25］.狭缝和环状(Robo)都是轴突引导分子。令人信服的证据推断，Slit/Robo信号通路抑制e -cadherin介导的细胞粘附并诱导大肠癌中emt样表型[26］.EMT是一种复杂的生物学过程，其上皮细胞揭示了它们的分化特征（例如，破坏细胞间粘附和细胞极性的丧失），而是假设间充质表型，包括降解ECM，增强运动/侵袭性和增强对细胞凋亡的能力的能力[27］.累积的观察表明，它在癌变和癌症相关的侵袭和转移传播中起着关键作用[28，29］.此外，ecm受体相互作用和黏附通路也与EMT相关。在我们的eHCC研究中发现的涉及EMT的显著富集的途径表明，有利于转移进展的遗传改变在HCC发展的早期阶段获得。

在8个频繁突变的基因中，有7个(除TENM4)在癌症体细胞突变目录(COSMIC)中作了注释，最近的HCC测序研究也有报道[9，30.以及多种癌症类型。MUC16和USH2A在记录的组织样本中突变超过5％的频率。Muc16的表达已被发现在乳腺癌和晚期和胰腺癌的转移性位点中发现[31，32］.Eudy等．MUC16可抑制NK细胞介导的对卵巢癌细胞的细胞毒性。由于它参与了ECM的构成和细胞粘附[33的突变USH2A可能会加速EMT的进程无义突变(Tyr1758))PTPN13导致功能丧失，符合先前的研究推理PTPN13作为HCC的候选肿瘤抑制基因[34］.这些观察结果可能暗示重叠的突变基因可能孕育了这种恶性肿瘤的驱动突变。

总之，我们的工作记录了HBV相关的EHCC中的突变型材，受影响的途径，不同的T：A> A：T横转化签名和频繁的突变基因，这丰富了我们对HCC肿瘤瘤的潜在生物学的理解。

缩写

EHCC：	早期肝细胞癌
HBV：	乙型肝炎病毒
SNVs:	单核苷酸变异
indels:	小的插入和删除
EMT：	上皮间充质转换
ECM:	细胞外基质。

的利益冲突

作者声明没有利益冲突。

作者的贡献

郝湛和嘉豪江同等地贡献了这项工作。

致谢

中国天然科学基金（Grant No.81502502和81472672）是中国国家重点科技专项项目的支持（授予No.2003ZX10002007005），上海的杨帆项目（授予No.15YF1402200）和中国国家自然科学基金（Grant No.81402376）。

补充材料

图S1:基于Illumina/Solexa测序鉴定snv和Indels的生物信息学流程图。SNVs，单核苷酸变异;UTR区域;dbSNP:单核苷酸多态性数据库;索引，小的插入和删除。表S1: 5例肝癌的外显子组序列分析摘要。表S2:全外显子组测序发现的5例单核苷酸变异。表S3:全外显子组测序发现的5例小插入和小缺失的列表。表S4:受影响snv生物过程的GO分析。表S5:受影响snv的通路分析。 Table S6: Primers used to carry out Sanger sequencing of the frequent mutations. Figure S2: The mutational signatures consisting of 96 different mutated trinucleotides identified in each case and all cases together. Signature 22 dominated in 4 out of 5 cases（补充文件）.

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