治疗用单克隆抗体Anti-IL-12p40诱发大量的肠道微生物群的变化一个实验性结肠炎模型

文摘

背景和目的。节段性回肠炎与肠道微生物群(GM)失调。治疗anti-IL-12p40单克隆抗体(12 p40-mab)在克罗恩病的病人治疗效果。本研究解决12 p40-mab治疗是否影响肠道微生物群(GM)成分与过继转移小鼠结肠炎(AdTr-colitis)。方法。AdTr-colitis老鼠接受12 p40-mab rat-IgG2a或生理盐水从21天到47。疾病监测的变化体重,凳子,内镜和组织病理学评分,免疫组织化学和结肠细胞因子/趋化因子配置文件。通用汽车的特点是通过DGGE和16 s rRNA gene-amplicon高通量测序。结果。12 p40-mab治疗后,大部分临床和病理参数与结肠炎要么是减弱或消失。通用汽车转向更高Firmicutes-to-Bacteroidetes比率相比rat-IgG2a治疗老鼠。17之间的显著相关性细菌属和生物标志物被发现。的相对丰度RF32 (Alphaproteobacteria)和秩序Akkermansia muciniphila受损的组织病理学和结肠炎症与呈正相关。结论。通用分布的变化与临床应对12 p40-mab治疗观察,而特定的通用成员与结肠炎的症状。我们的研究牵涉到,具体的通用的变化可能与积极的临床结果和建议预防或纠正通用失调作为炎症性肠病的治疗目标。

1。介绍

炎症性肠病(IBD)源自失去宽容和过度免疫反应基因易感宿主共生的细菌,尽管环境因素可能影响。溃疡性结肠炎(UC)和克罗恩病(CD)的主要形式是影响胃肠道炎症性肠病(1]。关键这些疾病的临床特征包括腹痛、体重减轻、和腹泻,可以出血性(1- - - - - -3]。多达140万人在美国和欧洲的220万人患有IBD和数量正在增加4]。

动物模型被广泛用于研究和解释肠道炎症的病理机制。为了研究IBD和评估抗炎策略,各种动物模型已经开发和传统上分为自发发展的结肠炎由于遗传操作(例如,有针对性的抗炎细胞因子il - 10的删除),化学诱导结肠炎(如葡聚糖硫酸酯钠(DSS)), hapten-induced结肠炎(例如,2,4,6-trinitrobenzene磺酸(TNBS)),和过继转移(AdTr)模型(T细胞的转移从供体小鼠T细胞缺乏鼠标)(5]。相比化学诱导的结肠炎模型如那些基于DSS和TNBS AdTr CD4细胞⁺CD25⁻T细胞在免疫缺陷小鼠更紧密地反映了改变基因表达在人类炎症性肠病(6]。结肠炎引起的小鼠模型AdTr CD25⁻耗尽CD4⁺T细胞是高度适用于新的炎症性肠病药物的药理测试候选人,因为他们很容易和快速执行(相比其他慢性模型,例如,SAMP-1 / Yit) (7,8),没有代禁毒抗体,结果穿制服和高度可再生的临床和病理结肠炎的迹象9]。三周后细胞过继转移最受体小鼠发展明显迹象的结肠炎,特点是减肥,便溏,增加白细胞(WBC)计数,增厚和缩短结肠(5]。

Anti-IL-12/23p40单克隆抗体(mAb)目标p40亚基il - 12。白介素是由两个链,IL-12p35 IL-12p40,一起形成了活跃heteromer IL-12p70 [10),而活跃的异质二聚体IL-23由IL-12p40和IL-12p19。il - 12和IL-23都是由单核细胞、巨噬细胞和树突细胞在微生物刺激10]。白介素诱发T辅助细胞的生成类型1 (1)(11,它能增强自然杀伤(NK)细胞的细胞毒性的活动(12)导致分泌多种细胞因子,特别是移行细胞(IFN -γ)[11]。IL-23刺激CD4⁺T细胞分化成小说的子集称为辅助T细胞17细胞。17细胞产生促炎细胞因子,增强T细胞启动和刺激生产的其他促炎的分子如il - 1、il - 6和TNF -α,以及炎症趋化因子导致(13- - - - - -15]。CD与过量细胞因子活性介导有关1,17细胞。il - 12和IL-23增加患者的CD,但其生产管理后下调IL-12/23p40单克隆抗体(7,13,16,17]。用anti-IL12/23p40疗法临床试验表现出令人鼓舞的结果在CD患者不应对一线生物治疗,这是anti-TNF -α马伯,anti-IL12/23p40特别好用的原因在这个病人目前未知,但这可能是由于特定的基因改变,以及常见的肠道微生物群/交互IL-12/23p40途径推动这些患者的发病机理。此外,改变肠道微生物群(GM)已被证明在CD患者复发的预测(18]。

转基因动物模型的IBD不开发暴发性结肠炎在无菌条件下,但是是由细菌殖民时肠道炎症的发展,指出了通用汽车的重要作用的起始和发展结肠炎(19,20.]。此外,抗生素可能改善实验性结肠炎甚至在治疗设置7]。多项研究表明,炎症性肠病伴随着通用转向更高的大量的促炎的细菌,如肠杆菌科,而丰富的,例如,乳酸杆菌和双歧杆菌减少(21- - - - - -24]。此外,大量的研究表明,通用汽车在结肠炎(多样性降低21,25,26]。然而,详细了解关于转基因成分的变化与结肠炎仍然是有限的,需要更多的研究来验证我们还在通用汽车的整体构成肠道炎症和重要性的程度上这样的交替变化在预防或治疗干预。识别相关转基因成分和结肠炎的临床参数之间的联系也非常重要。

因此,本研究的目的是探讨如何在结肠微生物群组成内容与临床症状治疗IBD的鼠单克隆抗体(12 p40-mab) anti-IL12/23p40结肠炎的T细胞过继转移模型(AdTr-colitis)。

2。材料和方法

2.1。老鼠

所有实验按照欧洲社区理事会指令86/609 / ECC保护动物用于实验用途,经丹麦动物实验检查机构,食品、渔业和农业、丹麦,和内部的伦理审查委员会在诺和诺德公司/ S。

C。B-Igh-1b / IcrTac-Prkdcscid (C。b - SCID)和BALB / cAnNTac雌性老鼠(8 - 10周)屏障保护条件下繁殖(泰康利,噢。Skensved、丹麦)被安置在诺和诺德公司/ S。老鼠发现使用Plexx微芯片(Plexx、Elst、荷兰)和随机在笼子里减少笼效应。肮脏的笼子里床上用品被转移到单独的笼子在实验开始前在实验以及一次每周。健康监测进行根据FELASA指南(27]。

2.2。纯化的细胞和结肠炎的感应

结肠炎是CD4 AdTr引起的⁺CD25⁻从脾脏T细胞(AdTr-colitis) MHC-compatible BALB / c小鼠c。b - SCID收件人如前所述[9]。简单地说,BALB / c供体小鼠的脾细胞受到CD4的积极的选择⁺T细胞通过Dynabeads和DETACHaBEAD (Ballerup生命技术的欧洲,丹麦)和CD25的损耗⁺从CD4⁺使用CD25 MicroBead工具包T细胞悬浮液。利用流式细胞术分析细胞的纯度和显示,超过98%的CD4细胞⁺细胞CD25⁻细胞。每个收件人被腹腔内注射重组与300000个细胞。转让两到三周后,分析了从所有小鼠外周血CD4的流式细胞术⁺T细胞。只有动物成功移植的细胞被包括在研究。

2.3。实验小组

老鼠被分为四组。一群参与C。b - SCID小鼠(SCID控制)并没有受到AdTr-colitis (),而传输的收养三组C。b - SCID小鼠治疗中和鼠anti-mouse IL-12/23p40单克隆抗体(12 p40-mab)(克隆C17.8) ()或rat-IgG2a单克隆抗体(克隆2 a3)(同形像)或生理盐水(从第21天,直到终止在47天)。抗体购自生物X细胞(美国新罕布什尔州)和测试了木糖醇。抗体是每周至少三次腹腔注射和前根据体重25毫克公斤⁻¹。

2.4。疾病的监测

动物体重三次每周和老鼠,损失了超过20%的初始重量被牺牲掉了。粪便样本进行评估和得分从0到4根据他们的一致性(正常大便= 0;略软凳= 1;软但形成粪便= 2;没有形成粪便= 3;液体粪便或没有粪便在结肠牺牲= 4)。疾病活动指数(DAI)计算是基于数据从减肥和获得粪便类型如前所述,没吃等。28]。便血是很少观察到AdTr-colitis不是监控。老鼠被异氟烷麻醉(Isoba兽医,默沙东动物卫生、Ballerup、丹麦)和血液被retroorbital穿刺获得的。所有血液样本被收集在EDTA K2涂布超小型电子管(美国俄亥俄州Gahanna米莲,)。EDTA-stabilized末梢全血样品(20μL)被用于监测白细胞(WBC)的数量每升Medonic CA 620(议会的北欧,丹麦)血液分析仪器根据制造商的协议。结肠镜检查是进行天21到34岁。老鼠和异氟烷麻醉,放置在背侧躺着。刚性望远镜(霍普金斯直接0°)连接到一个光源/气泵(氙175)和相机(Telecam SL)所描述的贝克尔et al。29日]内窥镜(2毫米)涂上润滑剂含有盐酸利多卡因(Farco-Pharma,科隆,德国),介绍了通过肛门进入结肠远端4厘米。内镜表现的评价是由两人蒙蔽观察员通过小鼠内窥镜结肠炎严重程度指数(MEICS)得分(补充表1在网上补充材料http://dx.doi.org/10.1155/2016/4953120),贝克尔等概述。30.]。

2.5。后期分析

老鼠被颈椎错位47天牺牲了。然而,鼠标rat-IgG2a组是牺牲的一天45由于严重的减肥。动物牺牲后结肠切除和纵向剖开。粪便和结肠内容收集在一个无菌埃普多夫管和组织与生理盐水轻轻冲洗和它的重量(、镁)和长度(,测量厘米)。左边部分结肠被用来测量细胞因子和半固定在一个塑料与针板和加工进行组织学分析。盲肠切除,其内容在无菌收集埃普多夫管。

2.6。组织学

组织的组织学固定在4%多聚甲醛(VWR-Bie & Berntsen、Herlev、丹麦)大约24小时在4°C。随后,样品被转移到70%乙醇和储存在4°C到加工组织病理学。徕卡的样本处理Asp300S histoprocessor (Ballerup徕卡微系统公司、丹麦)一夜之间,嵌入在石蜡块使用Shandon Histocentre 3(热电子公司,玛丽埃塔,俄亥俄州),和切割的厚度3μ在徕卡切片机RM 2165 (Ballerup徕卡微系统公司、丹麦)。随后,幻灯片和苏木精染色(Ampliqon、Skovlunde、丹麦)和伊红(Sigma-Aldrich、Brøndby、丹麦)())light-microscopic检查,奥林巴斯Ax70显微镜。组织病理学损伤的严重程度的结肠段是失明的方式检查,使用补充表2中描述的标准。

免疫组织化学(包含IHC)检测CD3或S100A8 (calprotectin)多聚甲醛固定结肠部分安装在胶幻灯片(Superfrost +、Menzel-Glaser、德国)干60°C和保持在4°C到处理。组织部分是通过二甲苯和水化处理。对CD3包含IHC组织部分煮在Tris-EGTA缓冲和淬火H₂O₂(0 5%)。组织部分被封锁(山羊和小鼠血清、BSA和脱脂牛奶)和幻灯片孵化与多克隆兔反CD3抗体(rm - 9107;SP7,热科学)。洗后在二级antibody-polymer TBS缓冲复杂(设想,K4003)应用。然后,幻灯片与diaminobenzidine发达(DAB)和复染色与Pertex梅尔的苏木精和安装。

对于calprotectin包含IHC染色组织切片煮在柠檬酸缓冲和淬火H₂O₂(0 5%)。内源性生物素被使用一个avidin-biotin阻塞工具包。非特异性结合被孵化与含有脱脂牛奶的TBS,驴血清、鼠血清。主抗体(Rat-a-Mo S100A8 (MRP-8) MyBiosource)和二级抗体(Biotin-SP驴Anti-Rat免疫球蛋白,杰克逊ImmunoResearch)在三羟甲基氨基甲烷缓冲液稀释包含脱脂牛奶和驴和小鼠血清和每个在室温下孵化了60分钟。接下来,一个放大的步骤是由孵化与Vectastain ABC过氧化物酶包30分钟后跟民建联的显色反应。核与梅尔的苏木精复染色和部分水化,清除在二甲苯,并与Pertex安装。运行控制免疫染色没有主要的抗体和同样的废话多克隆抗体浓度的主要抗体CD3和calprotectin。

自动数字图像分析进行IHC积极地区使用Visiopharm积分器系统(VIS、版本4.5.1.324、Visiopharm Hørsholm,丹麦)。对个人数字图像的近端和远端结肠部分,一个区域(ROI)是自动定义的结肠部分使用——聚类分类。随后,分析运行使用阈值分类在ROI检测布朗DAB染色的具体calprotectin包含IHC疣状。结果给出了区域沾CD3或calprotectin整个结肠部分(%)。

2.7。细胞因子的测量

组织细胞因子分析称重和转移到个人3.6毫升CryoTubes包含组织匀浆裂解缓冲(Ampliqon、Skovlunde、丹麦)。缓冲区是200毫米氯化钠溶液,EDTA 5毫米,10毫米三,10%的甘油,1毫米PMSF, 1μ克毫升⁻¹亮抑酶肽,28μ克毫升⁻¹抑肽酶(pH值7.4)。缓冲一直冷(约。4°C)。管是立即snap-frozen在液氮和存储−80°C到均质。使用一个Ultra-Turrax T25基本扩散器(IKA-Werke Staufen,德国)结肠段均质和匀浆离心机三次15分钟在10000×g和4°C,在埃普多夫管两次和最后一次Ultrafree MC-Centrifugal过滤设备,5μ孔隙大小(Billerica的微孔,马萨诸塞州,美国)。分析了上层清液使用Milliplex水平的结肠细胞因子和趋化因子(美国马萨诸塞州微孔,Billerica)。运行分析根据制造商的指导方针与标准和测试样本的异常组织匀浆中稀释溶解缓冲区,而不是kit-supplied测定稀释剂。

2.8。肠道微生物群的特征

盲肠的、结肠和粪便收集的内容在安乐死是均质三次20秒速度5.5米/秒之前提取使用珠搅拌器(美国圣安娜FastPrep-24,议员生物医学)。DNA提取使用QIAamp DNA凳子迷你包(试剂盒、希尔登,德国)根据制造商的指示。浓度和提取的DNA质量测量使用NanoDrop 1000分光光度计(美国热科学)。通用汽车的初步筛选多样性(16 s rRNA扩增子的基于配置文件)的盲肠的结肠,粪便内容进行使用变性梯度凝胶电泳(DGGE)中概述Pyndt Jørgensen et al。31日]。只有从结肠内容中提取的DNA进行高通量测序(Illumina公司MiSeq)。V3-V4地区16 s rRNA基因(扩增子的大小~ 460个基点)是Nextera指数放大与引物包括适配器套件(美国加州Illumina公司)。扩增的引物序列,条件和tagmentation(第一和第二轮PCR),净化,测序进行如前所述[31日]。对夫妇结束了读取相应(质量分数)被修剪,合并使用CLC基因组工作台7.0.4 (CLC生物、奥尔胡斯、丹麦)31日]。UPARSE算法(32)是用于OTU嵌合序列的聚类(97%)和过滤,而绿色煤电数据库97%(12.10版)是用于OTU挑选(33]。使用定量数据进一步分析洞察微生物生态学(1.7.0 QIIME版本和1.8.0)(34]。

相对量化的Akkermansia muciniphila如前所述(进行35]。简单地说,反应混合物(20μL)包含10μL 1 x SYBR绿色PCR反应混合液(应用生物系统公司),1μL的答:muciniphilaspecific-primers或16 s rRNA通用引物(每个引物0.5最终浓度μ米),4μL nuclease-free水,和5μL的DNA模板(20 ngμl⁻¹)。qPCR的温度剖面图如下:95°C 5分钟和40 95°C的周期为1分钟15秒和60°C。代的标准曲线,连续10倍稀释答:muciniphilaDSMZ 22959基因组DNA。

2.9。统计分析

一般统计分析进行了使用GraphPad Prism 5.01版(美国加州La Jolla GraphPad软件)。未配对学生的以及时使用比较的方法从两组正态分布参数数据和Mann-Whitney测试执行时从两组比较非高斯分布的数据。当三个或更多组参数数据比较单向方差分析是使用图基的期末测验。克鲁斯卡尔-沃利斯和邓恩的后续测试是使用在多个数据集不认为高斯分布。高通量测序,序列用于子样品的数量(价值,α和β多样性;值,多个稀疏)将90%的最贫困的样本。重叠β多样性工作流用于生成PCoA情节(基于10距离矩阵,确定使用子样品OTU表)。类别之间的差异在UniFrac距离矩阵进行了评估与分析的相似之处(ANOSIM)。α多样性测定和表达为观察到的物种相似性辣子鸡(97%)和10稀薄OTU计算表。通过非参数α多样性的比较了以及方法(蒙特卡罗,999排列)。的发生和没有辣子鸡与给定组小鼠相关的评估以及独立,而丰富的辣子鸡的差异进行了方差分析。最后,相对丰度的差异答:muciniphila由qPCR双尾学生的评价以及。

3所示。结果

3.1。监测疾病(戴评分、体重变化、病理)

CD4⁺CD25⁻T细胞转移被老鼠,耐受性良好,没有不良事件直接关系到12 p40-mab rat-IgG2a同形像控制,或生理盐水被检测到。小鼠被随机分配根据体重(BW) 19天。无明显体征的疾病在头两周后观察AdTr-colitis(数据没有显示)。BW的变化的实验从21天到47如图1(一)。老鼠开始减肥三号到四号一周后转移。减肥的进展,直到终止研究。老鼠接受12 p40-mab没有任何明显的减肥和类似于SCID小鼠的控制,而老鼠同形像控制和氯化钠处理开发严重减肥(和)。之间没有显著差异观察生理盐水和rat-IgG2a治疗组。疾病活动指数(DAI)是一个组合索引从0到8包含减肥(得分0 - 4)和凳子分数(得分0 - 4),它提供了一个综合评价在研究疾病的强度。戴秉国显著降低小鼠治疗12 p40-mab rat-IgG2a(相比)和生理盐水()(图1 (b))。AdTr-colitis在动物模型中,疾病可以关联到肠壁增厚和缩短宿主炎性反应。正如所料,结肠:比增加小鼠接受氯化钠和rat-IgG2a。显著的治疗效果观察与12 p40-mab相比同形像治疗组()和生理盐水()(图1 (c)),而没有观察到的差异之间的控件组。

内窥镜的图片是使用MEICS监控和分级炎症(包括结肠的增厚、血管的变化模式,可见纤维蛋白,粘膜表面,粒度和凳子之间的一致性的)。随机化后治疗前(21天),大多数小鼠结肠炎症的明显迹象;然而,两组之间没有显著差异可以发现(图1 (d))。在34天,然而,老鼠接受12 p40-mab内窥镜得分有显著减少,而老鼠rat-IgG2a处理()和生理盐水()。没有观察到的差异之间的12 p40-mab治疗和健康SCID小鼠的控制。同样,没有区别观察rat-IgG2a和氯化钠治疗小鼠在天34(图1 (d))。当比较疾病进展中的团体在第21天与34天,老鼠接受rat-IgG2a和氯化钠增加了内窥镜得分,从34(天21天)。相比之下,老鼠接受IL12p40-mAb显示疾病改善的迹象,(图1 (d))。

3.2。组织病理学和免疫组织化学染色

在47天,显著减少小鼠观察组织病理学评分治疗12 p40-mab相比,相应的同形像控制()和生理盐水()(数据2(一)和2(d)),而对照组之间差异无显著意义。由于致病CD4 T细胞驱动AdTr-colitis疾病进展,结肠部分是彩色的T细胞(CD3)标志。的百分比CD3彩色结肠组织被用来监测12 p40-mab结肠的影响T细胞炎症。老鼠接受12 p40-mab显著降低密度CD3和同形像控制和氯化钠和职责。)(数据2(b)和2(e))。Calprotectin主要是发现在中性粒细胞的胞质和显著调节炎症的地区,而很少观察到健康的组织。同形像控制和生理盐水治疗相比,老鼠接受12 p40-mab calprotectin密度较低(或中性粒细胞炎症)冒号(和职责。)(数据2(c)和2(f))。测定对照组之间无显著差异。

3.3。细胞因子

总结肠细胞因子/趋化因子水平测定结肠活检从小鼠治疗12 p40-mab rat-IgG2a或健康对照组。几个促炎细胞因子和趋化因子(TNF -α、CCL5 IP-10和KC)显著升高小鼠接受rat-IgG2a相比(表12 p40-mab治疗老鼠1)。细胞因子/趋化因子水平在12 p40-mab治疗老鼠不不同于健康老鼠(表控制1)。此外,老鼠接受12 p40-mab拥有更高水平的2 (IL-5、IL-9 IL-13)和免疫抑制细胞因子il - 10 rat-IgG2a治疗小鼠相比(表1)。因此,不同的T细胞环境中可能引起两种治疗的设置。

3.4。肠道微生物群组成

16 s rRNA扩增子档案的重要变化,基于变性梯度凝胶电泳(DGGE)中观察到的肠道内容氯化钠和12 p40-mab治疗小鼠(补充图1)。由于结肠内容之间的显著差异12 p40-mab rat-IgG2a也观察到,从结肠内容受到高通量DNA测序(Illumina公司MiSeq)。读取的数量得到16 s rRNA基因测序(V3-V4地区)扩增子来自32个结肠粪便样本是1697168(平均序列长度为341个基点)。预处理后(修剪、质量控制、排序和嵌合体过滤),获得的高质量的读取次数是990505,而每个样本序列的变化从14534年到61423年(平均30,,561)。估计的平均数量的观察OTU-species 12 p40-mab治疗组(),SCID控制(),rat-IgG2a治疗组(),生理盐水组()没有明显不同(减少数量的样本进行测序由于测序能力有限;样品是随机选择的,所有的治疗方法是代表](以及,;补充表3)。同样,没有观察到不同的β多样性之间的12 p40-mab和SCID控制(一般疾病)或同形像与生理盐水治疗小鼠结肠炎(活跃)(ANOSIM,)。主坐标分析的加权UniFrac距离矩阵,然而,显示重要的分离一般疾病和活跃的结肠炎小鼠(ANOSIM,,加权;图3)。此外,他们的通用显示变化的相对丰度7属(表2)[不统计不同修正后为多个比较)和门水平显著降低(以及,)壁厚菌门:拟杆菌比例的结肠炎的老鼠(0.30)比一般疾病的老鼠(0.83)(然而,当只有12 p40-mab rat-IgG2a相比没有显著差异的观察,认为由于低数量的观察和高intersample变异)。这样低的相对丰度操作分类单元(辣子鸡)分配给门壁厚菌门部分的相对丰度的下降引起的梭菌的从34.5%到15.9%(由成员瘤胃球菌属,Oscillospira和非保密属)。

3.5。肠道微生物群组成的相关性疾病参数

17 genus-level辣子鸡正面或负面关联与主机参数(图的变化4和补充表4)。在高度丰富的成员,拟杆菌(范围在1.5 - -89%的相对分布)表现出强烈的正相关性与大多数主机参数(AUC)的体重异常以及逆相关性对2,IL-9, IL-13。两个非保密的梭菌属的属(1.2 - -63%,非保密梭菌的和非保密Lachnospiraceae),Oscillospira(0.1 - -8.5%),S24-7家庭(3 - 60%)与宿主只负相关参数,而后者集团将积极与2,IL-9, il - 10, IL-13(图4)。其余的辣子鸡显示显著相关性不超过15%的相对分布。

在主机参数的分类(分数间隔)的患病率两个genus-level辣子鸡,分配到Akkermansia(相对丰富的0 - 7.8%,0.001≤-11.6%由Illumina公司测序和特有的qPCR resp)和一个非机密的成员RF32订单(0.1至9.2%,Alphaproteobacteria有关Rhodospirillum石)、相关(以及,与高组织病理学评分(图)5)。此外,特有的qPCR确认增加的相对丰度Akkermansia muciniphila与高分数相同的主机参数(图5)。同样,细菌是显著相关的患病率也CD3分数高的密度(分数> 2.7),疾病AUC(分数> 39.5)和calprotectin(分数> 0.15)。此外,RF32秩序的患病率也观察到结肠的高分率(> 33.7)。

4所示。讨论

一些研究支持因果角色失调的粘膜屏障在炎症性肠病的表现。最近的研究结果揭示肠道上皮细胞的机制,微生物群,在这种环境中免疫细胞相互作用和反应以及如何失去正常的监管过程可能导致炎症性肠病(17- - - - - -20.]。我们已经关注转基因后的监管与单克隆抗体治疗IL-12p40 AdTr-colitis小鼠模型,炎症性肠病的发展显然是预防治疗。大多数治疗小鼠的临床和病理体征明显减少或不明显。换句话说,老鼠受到AdTr-colitis和12 p40-mab治疗出现类似于SCID小鼠的控制,而老鼠对待同形像抗体开发的严重炎症性肠病的迹象。类似的结果已经通过其他的DSS模型(36]。通用的变化似乎是一个共享的主要现象在IBD患者和AdTr-colitis老鼠,和我们的研究结果表明,治疗12 p40-mab恢复转基因成分,也就是说,类似于SCID小鼠。此外,结肠细胞因子水平增加的响应IL-5, IL-9, il - 10, IL-13清楚地表明,它诱发2的反应,这是意料中的il - 12 / IL-23时阻止诱导1 /17个概要文件。与所观察到的在CD患者37)和同形像的小鼠抗体,12 p40-mab治疗有较高的啮齿类动物体内壁厚菌门的微生物的比例:拟杆菌门。此外,在CD患者减少细菌多样性以及相对较低的细菌分布与抗炎作用报道(18,38]。然而,在我们的研究中,通用汽车的整体多样性没有改变了治疗。失调甚至特定的菌株是否能成为未来的替代标记物炎症,不完整的疾病控制复发,和响应仍不确定。然而,根据鼠标时应采取谨慎。另一方面,增加壁厚菌门:拟杆菌门比小鼠治疗12 p40-mab主要是由于这样的事实:治疗组更高比例的梭菌属的成员,其中许多临床症状和TNF -反向相关α的水平。梭状芽胞杆菌种虫害强烈的Foxp3-positive诱导调节性T细胞在小鼠的结肠粘膜(39),和转让的混合物17人梭状芽胞杆菌种虫害或相关细菌的小鼠也增加了他们的调节性T细胞(40]。这非常符合我们观察到12 p40-mab显著调节il - 10在结肠。在我们的研究中,非保密Clostridiaceae家庭积极相关临床症状,属的效应细胞和促炎细胞因子,但这未必是在冲突与其他观察,还有许多的老鼠,梭菌的家庭来诱导炎症(41]。

老鼠接受12 p40-mab相对丰度较低拟杆菌,我们观察到丰富的之间的正相关关系拟杆菌与临床症状和TNF -α的水平。这是依照这一事实b . vulgatus(42),b . fragilis(43)是已知的在啮齿动物模型诱导肠道炎症。感兴趣的是丰富的普氏菌积极与il - 10水平相关。DSS模型已知增加炎症性肠病的严重程度(44,45),但很难比较DSS模型与AdTr模型在这方面作为il - 10的只有少数生产细胞存在于收件人SCID背景,因此,将不同的基线的il - 10水平。众所周知,通用汽车的变化可能导致的变化1 /2 /17平衡,又可以预防的症状1 /17诱发疾病,如CD。它,然而,似乎是小说一反1 /17治疗,如12 p40-mab,也导致转基因抗炎的方向。在我们的控制设置,老鼠通用成员之间的相关性和生物标记显著相关,但在人类很少有这样的情况18]。另一方面一些机制似乎是共享的,尽管这种异质性的缺乏。

令人惊讶的是答:muciniphila与高表达的临床炎症性肠病的症状取决于组织病理学。答:muciniphila是一种高粘多糖酶mucin-degrader活动(46),占1%以上的细菌细胞在人类粪便47]。细胞外囊泡的答:muciniphila防止DSS诱导小鼠炎症性肠病(48),其患病率却降低了各式各样的加州大学或CD患者(49]。然而,我们的研究结果的一个可能的解释是肠道炎症会导致更高的粘蛋白的生产,主要会退化答:muciniphila(50]。azoxymethane / DSS模型的结肠癌答:muciniphila数量的增加似乎也与结肠肿瘤(51]。的患病率Alphaproteobacteria被发现与组织病理学评分高,他们曾被报道在UC患者的粪便微生物群是非常普遍52),在IBD发病机制及其作用似乎与促炎的相关变化和通用失调(53]。

5。结论

这里我们报告12 p40-mab AdTr-colitis小鼠模型的治疗结肠炎导致通用和特定的转基因成分变化和成员与组织病理学变化和细胞因子的反应。此外,增加的比例梭菌属的成员的数量似乎与预防和衰减结肠炎症状有关。因此,我们的研究结果鼓励寻找生物标记基于通用和预防或纠正失调的潜在治疗炎症性肠病。

缩写

炎症性肠病:	炎症性肠病
加州大学:	溃疡性结肠炎
CD:	克罗恩氏病
12 p40-mab:	老鼠anti-mouse IL-12/23p40单克隆抗体
包含IHC:	免疫组织化学
戴:	疾病活动指数
MEICS:	小鼠内镜结肠炎严重程度的指标
通用汽车:	肠道微生物群
OTU:	操作分类单位
SCID:	重度联合免疫缺陷症
AdTr-colitis:	过继转移结肠炎。

利益冲突

彼得•过多的Kvist Bodil c . Søndergaard和托马斯·Lindebo河中沙洲为诺和诺德工作/ S。

作者的贡献

约书亚Castro-Mejia和Maja Jakesevic了同样的研究。约书亚Castro-Mejia和Maja Jakesevic起草和写论文的一部分。约书亚Castro-Mejia sequencing-libraries进行准备,qPCR实验和分析了高通量测序数据集。Bodil c Søndergaard和彼得·h·Kvist进行组织学和免疫组织化学实验。玛雅Jakesevic表现DGGE和收集了微生物样品。Łukasz Krych参与分子实验和高通量测序数据的预处理。拉尔斯·h·汉森进行DNA测序,帮助起草。托马斯·l·霍尔姆进行动物研究和支持临床化验包括细胞因子/趋化因子分析。丹尼斯·s·尼尔森和托马斯·l·阿克塞尔•k•汉森河中沙洲构思研究实验设计和起草的部分文章中写道。所有作者读了那篇论文,提供了重要的输入,通过论文的最终版本。

确认

作者感谢安德斯·汉森,卡米拉霜Sørensen,乐天Friis好技术在活的有机体内Juul援助和珍妮特执行罚款为组织学实验室工作。这项工作是来自哥本哈根大学的赠款支持卓越计划为跨学科研究项目“平静”(Josue Castro-Mejia) Villum基金会和丹麦战略研究委员会项目“Neomune”(Łukasz Krych)。

补充材料

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版权

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