在门诊生活在南京，中国沙波病毒感染的分子多样性（2011- 2013年）

摘要

目的。目的了解急性肠胃炎门诊患者中萨波病毒的分子多样性。方法。从门诊患者标本临床诊断为急性胃肠炎，通过实时PCR检测;RT-PCR然后进行至VP1序列的AMPLIFY一部分。PCR产物克隆到pGEM-T Easy载体和双向测序。所有序列编辑和分析。系统进化树;画成与MEGA 5.0软件。结果。2011年和2013年期间，16札如病毒阳性病例是由实时PCR证实。该感染者从两个在2011年和六个在2012年增加至八个在2013年的大部分是儿童和老人（15，93.75％）和单感染（15，93.75％）。16实时阳性的样本，14个样品具有的PCR产物，并表明不存在与四种基因型中，两个GI.2在2011年，三个GI.2，和一个GI GI一个基因型组的14个核酸序列的分析数据。1在2012年和一个GI.2，三个GI.1，二GI.3和两个GI.5在2013年。结论。我们的数据证实了2011 - 2013年南京地区GI基因群和GI.2基因型的持续存在，以及在门诊胃肠炎患者中陆续出现不同基因型。

1.介绍

人杯状病毒(HuCV)由诺罗病毒(NoVs)和萨病毒(SaV)组成;它们是引起非细菌性急性胃肠炎的重要病原体[1-3]。在先前的研究中我们的实验室表明，HuCV已成为南京非细菌性急性胃肠炎的主要病原菌2012年后，2013年取代轮状病毒为主要病原[4]。

HuCV是杯状病毒科的成员，具有7.5 ~ 7.7 kb的正感RNA单链基因组，内含2 ~ 3个开放阅读框(open reading frames, ORFs)。NoVs有三个orf;ORF2编码基因组中序列变异程度最高的主要衣壳蛋白(VP1)。SaV对VP1有两个ORFs和ORF1编码，也具有高度的序列可变性。VP1是最重要的具有多样性的蛋白质。我们分析了2010 - 2013年南京地区75株NoVs, II基因群的菌株多样性，发现了新的gi .4亚群(2012 Sydney/AU)在种群中逐渐取代之前的gi .4病毒(2006b)的进化证据。其他学者也对sapovirus的菌株多样性进行了研究，发现单一基因型在一个地区连续存在，在其他国家或地区胃肠炎患者体内基因组多样性的sapovirus菌株连续出现[五，6]。然而，很少有人知道在南京，中国循环基因型或札如病毒的genomical多样性。

为了解南京市散发病例中sapovirus的基因组多样性，我们对南京市疾病预防控制中心2011年4月- 2013年10月收集的散发sapovirus标本进行了分析。

2。材料和方法

2.1。实时rt - pcr

如在先前的论文中描述提取病毒RNA [4]。对人sapovirus的检测，引物和探针定位于RNA聚合酶的保守区域[7]，这是在25中使用 μL在ABI 7500 FSAT SDS中使用Invitrogen Superscript III一步q-RT-PCR系统的反应量，如之前报道所述[4];扩增结果确定，如在相同的报告[4]。

2.2。RT-PCR和札幌病毒的测序

的14株的VP1基因的5'端的358至364个核苷酸（nt）的区域用引物组S1和S2使用Invitrogen的SuperScript III一步法RT-PCR系统（Invitrogen公司，Carlsbad，CA放大。， 美国）。正向引物S1（5'-TA GTG TTT ATG GAR GAG GGY-3'）和反向引物S2（5'-CGG TCA RCY AAV STA CCB CC-3'）靶向位置5159到的参考菌株X86560.1 5516，沙波病毒曼彻斯特。The reaction was conducted with an initial RT step at 50°C for 30 mins, followed by PCR activation at 94°C for 2 mins and then 35 cycles of amplification (15 s at 94°C, 30 s at 48°C, and 30 s at 68°C) and a final extension step for 5 mins at 68°C in a GeneAmp PCR system 9700 thermal cycler (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). The RT-PCR products were purified, cloned, and sequenced as described in a previous report [4];一个方向的测序完全覆盖了另一个方向。

2.3。序列编辑与分析

本研究中生成的所有序列都按照之前的报告进行了编辑和分析[4]。系统发育树是用软件MEGA 5.0 [绘制8]。就大型分析而言，邻近连接法[9]作为统计方法;bootstrap分析测试了10000个重复[10]。的进化距离分别使用木村2参数法[计算11]和在每个站点的碱基取代的数量的单元。翻译的氨基酸序列在MEGA 5.0（可在使用Clustal W法算法对准：http://mega.software.informer.com/5.0/)。进化树用树视图显示软件（可在http://softadvice.informer.com/Treeview_32_Free_Download.html)。

2.4。GenBank BLAST搜索其他SaV GI, GII, GIV和GV序列

从我们的与已经在全球范围检测到的参考序列比较研究GI.1序列，GI.2序列和GI.3序列，GenBank登录一个BLAST搜索用在本研究中（BLAST生成的VP1序列的相应部分进行;http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）12，13]。从NCBI网站健康医学全国学院（美国国家图书馆的参考序列;http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)被选中绘制系统进化树;它们是Sapovirus- manchester (X86560)、Sapovirus Parkville (U73124)和系统发育树中显示的其他病毒。

2.5。核苷酸序列加入编号

在这项研究中确定的VP1序列提交GenBank，已分配登录号，KM282587-KM282600。

3.结果

3.1。单基因群和门诊患者南京2011-2013 SAV中的不同基因型的连续外观

2011年和2013年之间，南京市疾病预防中心和预防分别证实2，图6和8沙波病毒通过实时RT-PCR阳性病例。对于这些阳性病例中，大部分（15，93.75％）为单一感染和仅1例（6.25％）与轮状病毒共感染。有儿童15例（93.75％）和老年人，其中包括13名儿童年龄小于5岁和2名成人年龄超过60周岁;有18到60岁之间的成年人的1例（6.25％）。16实时阳性的样本中，从14个标本获得的PCR产物，并测定核酸序列。其中14株，有与四种基因型，其中四个GI.1，六个GI.2，二GI.3和两个GI.5一个基因型组GI。世界上只有一个基因型，二GI.2在2011年只有2个基因型，三个GI.2，并在2012年到2013年一个GI.1，有四种基因型，一个GI.2，三个GI.1，二GI.3和两个GI.5。

3.2。SAV株间的系统发育关系

The phylogenetic analysis using the 358 bp to 364 bp nucleic acid sequences of 14 strains of HSVs showed different genotype diversity during different years and wide distribution of the same genogroup GI. For example, the 5 GI.2 strains from 2011 to 2013 in Nanjing had nucleotide identity level of 98%–100% between each other, 94%–100% compared to those of 15 GI.2 reference strains, and 94%–96% compared to two reference strains U95644.1∣Sapporo virus-Houston/90 and U73124∣Sapporo virus-Parkville. However, 4 GI.2 strains of 2011 and 2012 had nucleotide identity level of 99%-100% compared to outbreak strains from Japan, AB518056.1∣Sapovirus Hu/Oshima1/2009/JP, AB894245.1∣Sapovirus Hu/Ishigaki/35/2012, and AB894247.1∣Sapovirus Hu/Ishigaki/37/2012, outbreak strains from Taiwan, EU124657.1∣Sapporo virus Hu/SaV/9-5/Taipei/07/TW, and sporadic strains from Brazil, AB614356.1∣Sapovirus Hu/G1.2/BR-DF01/BRA/2009 and KF924388.1∣Sapovirus Hu/G1.2/VIG-AM-111209/BRA/2010; and 1 GI.2 strain of 2013 had nucleotide identity level of 99% compared to outbreak strains from Hungary, FJ844411.5∣Sapovirus Hu/G1.2/Kecskemet/HUN3739/2008/HUN. The 4 GI.1 strains of 2012 and 2013 had nucleotide identity level of 96%–99% compared to those of 17 GI.1 reference strains and 98-99% compared to three strains, AJ251991.1∣Human calicivirus strain Hu/SLV/Lyon/30388/98/F (98%), HM195198.1∣Sapovirus Hu/GII.1/Jimei/Xiamen/2010/CHN (99%), and AY646854.2∣Sapovirus Chanthaburi-74/Thailand (98%). Another example, the GI.3 strains of 2013 had nucleotide identity level of 90%–99% compared to 3 GI.3 reference strains, 99% compared to outbreak strain AB518057.1∣Sapovirus Hu/Oshima8/2009/JP, and 90%-91% compared to other three reference strains. For the 2 GI.5 strains of 2013, they had nucleotide identity level of 99% between each other, and 98% compared to strain AB253740.2∣Sapovirus Hu/Yokote1/06/JP, and 97% compared to strain DQ366345.1∣Sapovirus Hu/Ehime643/March 2000 (Figure1)。

3.3。SAV中GI基因型的分子多样性南京

Sapovirus ii基因型在2011年、2012年和2013年持续存在。对南京菌株的替代特异性定位为S406T(图)2(红色)，根据札幌病毒- houston /90的参考序列位置。2013年ii基因型似乎存在累积变异，至少比其他参考菌株多一种替代(图)图2（a）)。2013年，更多的基因型合并，更多的基因替代。此外，除其他菌株存在10个替换外，南京3菌株在S113T处还有2个替换位点(图)图2（b）在红色）和V116A（图图2（b）根据参考菌株Hu/SLV/Stockholm/318/97/SE序列的位置。南京G1.1基因型无特异性替代;但P1817S有四个替代(图)图2（c），粉红色)，S1819A(图图2（c），蓝色），S1831T（图图2（c）在红色），V1834A（图图2（c）在绿色）在其它菌株明显存在的，像一个累积，根据该基因组札幌病毒曼彻斯特的位置。南京G1.5基因型位于S1831T（图的取代图2（d）(红色部分)，根据胡/Ehime643/March/2000 Sapovirus的参考序列定位。gi3基因型间的差异似乎大于其他基因型间的差异。综上所述，在14株南京萨波病毒中，S对T有一个特定的替代，位于底部第4个氨基酸处(图)2， 红色的）。

3.4。HSVS的保守或变异位点

不同人类sapovirus基因群中是否存在保守或变异位点?为了回答这个问题，我们进一步将14条序列与GI、GII、GIV和GV四个基因组的其他序列进行比较。保存的两组位点标记为box。第一组对所有hsv均保守，包括四个长度超过两个氨基酸的位点，如方框所示为“VFEMEG”、“ATG”、“NPYT”和“AGWGG”。另一组保存在同一基因组中。GI基因型分别为“IQSN”、“RTFAWNDRMP”和“SLHPNI”，见方框。可变位点用颜色标记。所有基因群的变异位点在10 ~ 30之间，不仅GI基因群存在差异，GIV、GV、GII基因群之间也存在差异，如图所示3。

4.讨论

我们以往的研究[4]表明，轮状病毒和HuCV每年在南京占门诊大多数病原体，大约百分之九十2010年至2013年;HuCV取代轮状病毒如在2013年的主要病原体对于通过HuCV诱导的情况下，大多数是由基因型组II的NoVs引起的;少数被SAV引起的。我们的研究结果还表明进化证据的新GII.4子簇（2012年悉尼/ AU），在人口（2006年b）逐渐移位以前GII.4病毒的出现[4]。在本研究中，我们进一步分析了SaV感染，发现大多数病例为儿童和老年人的单次感染。这些结果与其他国家或地区相似[五-7]。南京地区仅发现一个GI基因群;然而，基因型从2011年的唯一的GI.2到2012年的两个GI.2和GI.1，到2013年的四个GI.2、GI.1、GI.3和GI.5。这一发现提示了GI基因群和GI.2基因型在南京地区的持续存在，与日本其他报道的某些基因型在一个地区存在较长时间，以及胃肠炎患者中存在连续出现的基因组多样性SaV菌株一致[五，6]。

我们的结果与那些从类似的研究是一致的。虽然感染的SAV中的比NoVs的很少见，在SAV中被广泛分布。SAV中的南京门诊患者感染病例均完全16 2011至2013年，包括在2011年2从358案件，6从310箱子2011期间，和从8375案件2013年期间HSVS的14株在本文中分析了南京不得不从日本，巴西，匈牙利和中国其他城市相比其他参考株菌株高核苷酸的身份。2006年至2007年在中国九个省份调查发现，在六个地区10级SAV中的菌株，在广西一个GI.1，在海南一个GI.1，在山西一个GI.1，二GI.1和一个GI.3河北，一个GI.1在吉林一个GI.3，和一个GI.1和一个GII.3在上海[14]。其他的研究表明，2009年和2010年[中有GI.1，GI.2和GII.1杭州15];GI.2和GII深圳在2011年[16];2011年至2013年在上海的gi1、gi2和GII.3 [17]。进一步的研究来更好地理解SAV中的地理分布[18]。

尽管在SAV有限的研究相比NoVs，还有利用基因分型取得了一定的进展显著[19]及住院和门诊病人[之间的流行病学差异20]。SAV衣壳序列已经被分析的切割位点的鉴定或蛋白水解加工[21，22]。为了理解在南京SAV株的氨基酸变化，氨基酸进行了比较，所述参考菌株和在南京菌株中发现的不同的氨基酸取代的翻译的119-121的氨基酸序列。此外，保守的和变化的位点，GI基因型组内或在四个基因小组，GI，GII，GIV，和GV进行分析。无论这些替代都参与了抗原变化或病毒健身主机和无论从主机未被识别的病毒需要进一步调查。此外，保守或更改网站是否有专门的抗原特异性也需要进一步研究。

相互竞争的利益

作者宣称，他们没有竞争的利益。

作者的贡献

洪莹参加了命名，排序，分析，以及纸张书写;梦佳巧促成实时PCR;宣王促成实时PCR和样品处理;闵荷有助于RT-PCR和核酸分离;立民施促成RT-PCR和核酸分离;国相携参加指定和分析;喜莹津参加指定和分析。

致谢

这项工作是财务支持的南京医学科学技术发展基金会授予作为张(QRX11127),和支持的关键项目医疗科技发展基金会、南京卫生部授予作为张(赠款ZKX09033和YKK15182),部分支持的基金会摘要郭象谢(2011 bak21b05 ZDX12006),和支持的部分基础Hei-ying金(81273944号,30973837,201402041,和BK20151081)。

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