选择性诱导改变Coccidians接种和预防肠炎

文摘

Microbiomic消化道菌群是关键,我们的健康和疾病的状态。抗生素影响胃肠道,控制微生物的组成,将平衡从健康到疾病状态。球虫病引起的胃肠道炎症。抗生素添加剂污染动物产品,进入食物链,被人类可能过敏,抗生素耐药性和神秘的副作用。定意研究诱导非病原的免疫原性生物预防疾病和废除抗生素在食用动物中的使用和副作用的人。不同种类的Coccidia被用作模型。不成熟的生物治疗与串行净化过程发展阶段之前获得改变菌株。小鸡收到口头填喂法与连续低剂量的免疫正常或改变生物体或虚假的治疗和挑战有高传染性生物体正常比较致病性和免疫原性。成熟诱导形式的改变大肠tenella和大肠necatrix缺乏“孢囊的发育阶段,包含免费的子孢子。相比之下,e .最大值进展正常形式或不成熟。动物收到修改形式大大保护了更高的体重增加和抗体滴度对挑战感染相比,那些获得正常的生物()。这是第一个报告诱导选择防护改变生物体可能的预防措施减少抗生素在食用动物中的使用。

1。介绍

microbiomic植物生活在消化道中起着举足轻重的作用在我们的健康和疾病。最近的调查一直关注药物的使用特别影响消化道的抗生素,可以控制微生物组成和平衡从健康到疾病状态转移(1]。

近几十年来相关的严重患病率的增加ige [2)和non-IgE-mediated食物过敏和配合的上升在家禽和家畜抗生素补充。例如,神经胶质瘤的发展一直与高架IgE和可能的食物过敏。此外,神经胶质瘤患者显示显著的积极青霉素皮肤试验和高血嗜酸性粒细胞计数比nonglioma对照组(3]。这些发现表明一个错综复杂的联系在神经胶质瘤进展和可能的状态组合食物和抗生素过敏的患者。

抗生素耐药性的增加创造了一个复杂的公共健康面临的困境。事实上,使用抗生素对感染了难题,因为高剂量可能促进抗生素耐药性的进化比治疗感染。另一方面,抗生素的组合和长时间的治疗能促进严重的伤害(4]。此外,次优的剂量的抗生素使用最近建议不得足够足以消灭病原体。

同时,当前消费者的意识对于抗生素残留家禽产品和抗生素抗性病原微生物的污染引起了关注和建议减少使用抗生素作为生长促进剂在牲畜在美国5)和全球。

球虫病是一种昂贵的传染病导致发病率和病死率在畜禽产业。到目前为止,没有安全预防和保护性疫苗或实际可用的(6]。Coccidians主机定义apicomplexan生物只导致胃肠道炎症并发症和人与动物的腹泻。相比之下,弓形虫,另一个相关的成员Apicomplexa intraintestinal (coccidian形式)和extraintestinal阶段,是世界性的和感染动物和人体内的每一个器官和细胞(7]。球虫病是一种重大疾病相关食物的动物。直接损失是由于发病率减少球虫病导致体重增加和鸡蛋生产以及影响肉的品质饲料转化率下降,吸收不良,消化不良,进一步导致死亡率(8]。艾美球虫属感染诱发动物梭菌的感染和坏死肠炎(9]。常见的预防实践包括开始的使用剂量的抗生素添加剂为家禽和牲畜饲料污染鸡蛋、牛奶和肉类生产。抗生素进入食物链和可能的过敏,被人吸收的抗生素耐药性(10)和其他难以捉摸的副作用。例如,使用磺酰胺anticoccidial遇到了耐药菌株的出现(11]。球虫病的估计年度成本仅在肉鸡生产已增加了两倍(3.5亿美元)的近几十年在美国12,13)主要是由于anticoccidial药物用于控制感染。虽然连续药物在饲料有效对抗疾病暴发,有几个缺点包括顺序发展的耐药性和副作用的消费者需要不断的寻找新的和有效的化合物和疫苗接种。动物的物种,从感染中恢复发展特定免疫诱导的生物体或活疫苗。Coccivac的可行的疫苗接种,不同病原的混合种鸟类的艾美球虫属,已被用于在1/2世纪在美国(14]。这种活疫苗导致贫困饲料转化率(1),(2)需要长时间进化免疫针对疾病,(3)引入感染的可能性,(4)和困难的管理和管理羊群。其他实验疫苗的减毒株包括串行通道大肠tenella到小鸡胚胎绒毛膜尿囊的(15被发现是无效的。因为他们发现在一个世纪前(16),艾美球虫属有被描述为生物四个封装孢囊,每个包含两个传染性生物体称为“子孢子。”

本研究的目的是介绍不致病的但免疫原性生物预防疾病和废除在食用动物中的使用抗生素的副作用的消费者。利用净化过程,改变大肠tenella和大肠necatrix免费引起进化8子孢子孢囊的形成。概念证明,这些改变致病生物体都低于正常生物但同样产生免疫性的正常形式。这个调查报告的形成改变了生物体偶然和依赖于生物的物种,而据报道他们的免疫原性与正常生物使用的鸟类作为模型,以保证未来的调查。

2。材料和方法

2.1。道德

这次调查是根据批准的指导方针和生物安全制度和机构的动物保健和使用委员会(IACUC)。

2.2。动物

刚特定无菌(SPF)天生的白来航鸡小鸡从家禽科学获得和保持Coccidia-free无菌室,在日常消毒wire-floor笼子,并提供饲料和水随意。鸟儿是识别和标记一条腿乐队重之前,期间,在研究结束的。体重增加/减少接种之前被减去初始重量计算的重量后获得/失去了挑战和之前终止研究。

2.3。卵囊的制备

形成孢子卵囊的e . tenella e . necatrix和e .最大值最初来自礼来公司和公司(印第安纳波利斯,)。新鲜的文化是从盲肠或捐赠动物的肠道准备一周后口服接种。内容是均质和unsporulated生物体(卵囊)被筛分离碎片和离心机在400×g和沉积物加入2.5%水重铬酸钾(σ,圣路易斯,密苏里州)获得正常形成孢子卵囊。为了获得改变卵囊,匀浆含有unsporulated卵囊2.5%次氯酸钠溶液进一步清理和冲洗蒸馏水(2 x)。匀浆是离心10分钟400×g在饱和盐溶液(9:1 v.v)然后在蒸馏水冲洗。卵囊被2.5%的水重铬酸钾溶液中培养提高孢子形成。生物枚举使用血细胞计数器和稀释在磷酸缓冲盐(PBS)根据每个实验之前口头填喂法直接进入动物的作物。正常对照组接受虚假的(PBS)治疗。

2.4。感染

在2 - 6周的年龄,通过作物和动物接种240年,2400年和24000年形成孢子卵囊正常或改变应变一三剂根据实验设计为期两周的间隔。隔离受感染的鸟类都被关在笼子里在一个单独的房间,提供食物和水没有限制地。挑战接种后一周,动物被颈椎脱位称重和人道使安乐死立即紧随其后打开胸部和心脏风险。不同的器官包括段盲肠和肠子都被立即删除幻灯片涂片准备检测的生物。盲肠的病变是得分从0到+ 5根据感染的严重程度(8),简要如下:0 =正常粘膜和消极的盲肠的/肠道涂片。1 =没有可检测病理但生物涂片检测。2 =分散在粘膜瘀斑,生物出现在涂片和盲肠的正常/肠内容。3 =局部炎症和粘膜增厚、孤立的腔中发现出血。4 =多病灶的炎症和增厚腔粘膜和广泛的出血,很少或根本没有粪便的内容。5 =放大盲肠/肠血或者砍掉了粘膜和垂死的动物尸体。

2.5。卵囊孢子形成

生物的生长和孢子形成通过显微镜检查确定。代表样本检验和形成孢子卵囊的比例决定每4 h。孢子形成时实现> 90%的生物孢子形成来实现。

2.6。反艾美球虫属由ELISA抗体检测

酶联免疫吸附测定(ELISA)进行使用可溶性抗原的卵囊大肠tenella根据(8,17]。从肱静脉血液被收集到注射器从活的动物和血清5分钟后离心分离。每个血清样本热灭活56°C使用和稀释前30分钟在双重的增量。过氧化物结合链兔子anti-chicken免疫球蛋白(接头实验室、西切斯特、PA)分发到每个microwell涂有11μ克的抗原和孵化o-phenylenediamine(伊士曼柯达公司,罗彻斯特,纽约)。光密度(OD)记录在490 nm ELISA读者(弗吉尼亚州亚历山德里亚DYnatech实验室Inc .)。

2.7。致病性和免疫原性

大肠tenella生物被用作一个模型比较正常和改变生物体的免疫原性和致病性。口服填喂法为作物240,然后2400正常或改变生物的卵囊为期两周的间隔进行3个近交白来航鸡小鸡。然后动物挑战感染性(24000)高剂量的正常大肠tenella。一周每次接种后,每组6个动物体重和外观和健康状况记录。然后从肱静脉血液样本收集和动物人道使安乐死的颈椎错位和心脏暴露组织标本收获紧随其后。

2.8。冰冻切片

卵囊离心机在20% (W / V)牛血清白蛋白(BSA)和15% (W / V)蔗糖。丸是固定2滴/毫升的25%戊二醛。他们在液氮速冻18块被分组μ米在低温恒温器设置。卵囊是嵌入式安装代理保护卵囊在粉碎切片过程。部分被苏木精和伊红染色。

2.9。统计分析

结果表示为均值±SEM,除非另有说明。数据进行评估并采取适当的事后利用方差分析测试。统计学意义是。

3所示。结果

3.1。在体外孢子形成和卵囊描述

正常的卵囊大肠tenella开始细胞分裂和孢子形成16 - 20 h在外部环境的四个内部sporoblasts形式。28 h后四个孢囊是成熟和子孢子的发展是在38 h(数据完成1(一)- - - - - -1 (f))。相比之下,改变卵囊发起部门大约12 h后比正常卵囊(28 h)。矛盾的是,生物开始蓬勃发展成新成立的自由子孢子在36 h形状没有前孢囊形成和孢子形成竣工后44 h(数字2(一个)- - - - - -2 (d)),也就是说,总6 h与正常的卵囊比预期更长的时间。大于95%的加工生物发展成为改变形式。改变生物体的圆形椭圆形(25 - 35μm×22.5到27.5μ米),每个包含八个香蕉状态自由子孢子(12.5 -14μm×2.5μ米)。虽然一致性的测量与范式,孢囊的例外是缺乏。

3.2。影响卵囊的储存寿命

储存在4°C时改变生物体为3个月;免费的子孢子卵囊内然后开始退化(图2 (e))。相比之下,正常的卵囊保存子孢子和孢囊的外观没有明显退化的迹象/ 1年复一年地存储在4°C。这个建立的具体保护实体提供的寿命和传染性子孢子孢囊。

3.3。改变了其他物种的卵囊艾美球虫属

试图确定是否平行与其他相关coccidian生物发育发生改变。同样,改变的卵囊e . necatrix另一个致病Coccidia,诱导利用同样的方法描述大肠tenella生物。同样的,改变大肠necatrix卵囊包含八个自由形成子孢子和缺乏sporocystic结构(图2 (f))。相比之下,当另一个物种,e .最大值处理类似的过程,生物体没有完成孢子形成过程或简单地转化为正常形成孢子卵囊(数字2 (g)和2 (h))。

3.4。卵囊和免疫

为了研究生物体的免疫原性,每个有天生的动物从低剂量升级240(表12400(表),然后2)正常或改变生物体的为期两周的间隔。的动物对待改变应变都深刻地会导致体重增加和大大提高抗体滴度与正常相比血清免疫生物()。过去两周后免疫剂量(2400正常或改变形式),剩下的动物都是挑战与高剂量的正常生物(表240003)。因此,这些动物只收到了挑战剂量(24000正常卵囊)大幅度减肥(相比发达腹泻带血)和免疫的。病理病变是得分中度严重发炎增厚肠粘膜和粘膜中发现出血腔相比那些免疫动物(、表3)。

所有未受感染的动物如预期是血清抗体阴性。免疫组与改变或正常形式显示没有高滴度抗体阳性病理损伤和发达的免疫相比,改变了正常的生物。的主要区别与动物免疫接种组表达水平改变了生物体获得更多的重量,在总体健康状况比之前那些动物免疫正常生物(表3,)。

4所示。讨论

肠道菌群的庞大人口的主要作用是防止传染性微生物病原体的入侵和殖民(1- - - - - -18]。包括短期使用抗生素会破坏传播的共生的微生物容易失调。最重要的共生的微生物群似乎当建立在生命早期(19]。因此,以前的标准如剖腹产与自然分娩和母乳喂养可能不再被视为主要的焦点。因此,抗生素的注意力一直集中在可以控制微生物组成(19),健康和疾病之间的平衡。

非传染性和炎症并发症如过敏疾病影响了数以百万计的人。食物过敏在西化的社会已经大幅增加主要是由于生活方式和饮食。迄今为止,过敏特别食物相关的过敏的发病机制仍然以某种方式难以捉摸(20.]。这正值高潮ige食物过敏的患病率在孩子尚未解决的与可能的环境(2)和/或营养风险的参与。此外,发现一个深远的关系大环内酯物的使用抗生素和哮喘之间发展在欧洲的孩子(三十六个月)多中心前瞻性试验。有一个明确的使用大环内酯物之间的相关性在生命的第一年和喘息三岁的孩子,独立于呼吸道感染(21]。与此同时,盛行的氟喹诺酮类和大环内酯物抵抗病原体包括弯曲杆菌在家禽和猪行业(22)由于滥用引发了警钟之虞者,碌碌无为的这些人类抗生素的治疗。

环境因素的影响之间的联系已经证明了发展慢性炎性疾病如克罗恩病和溃疡性疾病。这些启示包括儿童暴露在不同的营养元素(23]。范例包括食品蛋白质诱导小肠结肠炎综合症(FPIES)作为non-IgE-mediated儿童过敏引起的症状严重的呕吐、腹泻,和酸中毒几小时后食用膳食蛋白质、鸡肉、火鸡、蛋清和牛奶24]。事实上,鸡蛋是报道的频繁触发FPIES [25]。在婴儿散发病例,non-IgE-mediated过敏症已经指出转向典型ige牛奶过敏(26]。T细胞的激活可能是也可能不是在FPIES [27),而机制(s)使(s) FPIES仍然是个谜。

抗生素的使用有一个快速和主要影响腔内细菌社区之后,长期影响微生物种群结构和调节宿主免疫(28]。最近的研究强调mucosal-associated共生的细菌形成保护屏障,防止食物过敏敏化。在活的有机体内和在体外研究支持利用口服活生物疗法(如。益生元)调节腔的微生物和对食物过敏的病人诱导28]。

在回顾性病例对照试验(2004 - 2013),神经胶质瘤患者()有深刻的积极(IgE)青霉素皮肤试验和高血嗜酸性粒细胞计数比匹配控制(),一个可能的神经胶质瘤和食物过敏之间的联系(3]。然而,β内酰胺抗生素,青霉素(如阿莫西林和双氯西林)和头孢菌素(如头孢唑啉和头孢噻肟)经常用于动物。滥用和非法使用这些抗生素(29日)以及食品中发现大环内酯类动物产品可导致细菌耐药性和过敏。例如,四环素,最常见的一种抗生素用于家禽、沉积和仍在骨骼和食物链传递给潜在的人类健康风险无论实施监控的撤军时间(30.]。Diclazuril是另一个抗菌经常用于家禽业防止coccidial感染。我们最近报道diclazuril单一疗法或结合atovaquone有效预防先天性和孕产妇弓形体病(7,31日,32]。结合抗生素治疗最有效地保护幼崽对严重multiorgan炎症反应和降低病死率和候选人diclazuril mono或联合治疗的一个有吸引力的antitoxoplasmosis人类。

抗生素耐药病原体引起的广泛利用开始抗生素喂养家禽(5和牲畜。最近消费者意识对于家禽产品中抗生素残留的污染和抗生素抗性病原微生物创造了伟大的问题和建议,以减少使用抗生素作为生长促进剂在牲畜在美国5]。选择预防措施,需要消除或减少使用抗生素在畜禽产业。

在这项研究中,改变生物体不同于正常的卵囊,因为它们缺乏孢囊,尽管每个包含八个免费的子孢子。改变生物体产生大幅降低相比,免疫缺陷动物致病性正常卵囊(未发表的数据),而保护这些生物引起的免疫活性的近亲交配的动物引起的不少于那些正常的形式。实际上,动物接种改变生物体获得更多的重量,并演示了最小的病理症状由于感染和诱导抗体滴度高相比,那些获得正常的形式。一个世纪后的原始发现eimerians,可再生的方法改变感染性形式noninfective的介绍了这里。之前的研究使用辐照改变生物的致病性(33,34]或诱导抗性的基因选择鸟类主机(35]。的质粒pcDNA3-1E的肌内注射E。acervulina据报道,在鸡是安全的36]。同时,E。tenellaEtMic2 (microneme蛋白质)显示在细胞表面年代。酵母用口头作为活疫苗据报道,防止挑战通过降低损伤分数和粪便卵囊感染鸟类和刺激肱先天免疫(37]。我们审问的过程表明,机械化学的蚀变发育阶段前孢子形成理性会导致改变生物体的形成(E。tenella和E。necatrix)有能力对严重感染和预防接种腔的炎症。

据报道,正常生物保护内部结构长达25年的重铬酸钾(2.5%38]。当前的研究证明了孢囊对保护传染性和长寿,有保护作用,改变生物缺乏孢囊及其结构实体退化后3个月。的三个不同物种艾美球虫属测试在这个调查(E。tenella,E。necatrix,E。maxima在类似的方式)都没有反应改变过程。而E。tenella和E。necatrix两个同样遵循程序异常生物的形成,E。maxima未能处理改变形成且没有明显的解释这种可变性。有一些差异在这些物种的生命周期。E。maxima形态也有点大于两个物种。然而,这可能有很少或没有影响发育行为差异观察到这里。

总的来说,这份报告可能通知医学界大量不必要的抗生素使用和残留在动物产品和球虫病的预防可能的进步比抗生素的使用其他方法,因此减少抗生素污染的机会消费动物产品和腔的微生物群的变化和食物过敏的患病率在人类的后果。

5。结论

这是第一个报告诱导选择防护coccidian改变生物体可能的预防措施减少抗生素在食用动物中的使用。改变生物体和随后的保护性免疫产生对严重感染需要进一步调查。

相互竞争的利益

作者宣称没有利益冲突。

确认

支持资助是由国立卫生研究院:NIDCR-DE019177 NCCAM-AT1490。

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