减少表示酸性亚硫酸盐测序确定独特的DNA Hypermethylated基因在非裔美国人结肠癌的发展

文摘

背景和目的。许多研究把重点放在了甲基化在结直肠癌的目标的决心。然而,很少有分析了渐进序列中的甲基化最终从正常到腺瘤和恶性肿瘤。这是至关重要的特别是在人口如非洲美国人通常显示恶性肿瘤的诊断和早期肿瘤的标记为谁是必要的。我们旨在确定甲基化目标路径中使用减少结肠癌病人在非裔美国人表示酸性亚硫酸盐测序(rrb)。方法。基因组DNA从新鲜冷冻分离组织的不同患者结肠病变:正常,管状腺瘤,tubulovillous腺瘤,五个癌症。rrb进行这些DNA样本确定甲基化。对齐、映射和证实了CpG甲基化分析。优惠hypermethylated途径测定使用创新路径分析(IPA)。结果。我们确定了hypermethylated CpG网站在接下来的基因:L3MBTL1、NKX6-2 PREX1、TRAF7 PRDM14,NEFMCpG网站的数量是14日,17日,10日,16日6日和6日,分别在两两分析正常和腺瘤,腺瘤与癌症和正常和癌症。异丙醇上述hypermethylated基因映射到Wnt /β连环蛋白,PI3k / AKT、VEGF和JAK / STAT3信号通路。结论。这项工作提供了洞察小说差论文认定甲基化网站在结直肠致癌作用。基因功能分析小说的目标需要确认他们的角色在他们的致癌途径有关。

1。背景

结直肠癌(CRC)是最常见的胃肠道癌症在美国(1]。这是一个恶性肿瘤死亡率的主要原因(2]。CRC是通过不同的分子机制和途径,导致不同的临床和病理结果。CRC更频繁地发生在非洲裔美国人(AAs)相比其他种族在美国(1,3,4]。这种差异的原因包括环境因素以及基因特定的倾向(1]。现在普遍认识到,除了基因突变,特别是异常的DNA甲基化是表观遗传机制参与几乎CRC的每一步发展和进展。

DNA甲基化是表观遗传事件的最重要的一个被认为发生在早期阶段致癌的转换(5]。CpG岛,甲基化的目标,包括短的CpG富裕地区,往往与基因的启动子区域(6]。在肿瘤细胞中,有一个适度的全球消耗的胞嘧啶甲基化,但相当大的收购相关的异常甲基化在一定促销员的CpG岛(7]。这个异常的启动子甲基化通常导致表观遗传沉默基因表达的7]。

CpG岛在基因的异常甲基化促进剂和/或第一其实/ intronic地区是公认的表观遗传事件导致相应的肿瘤抑制基因的转录沉默CRC和其他癌症。无论肿瘤抑制基因的生物methylation-induced沉默的后果,这后生蚀变构成分子签名可以作为有前途的生物标记物早期检测(3,8]。许多基因的异常甲基化沉默CRC(APC, p16INK4a分子,TIMP3);这样的基因有可能成为有用的生物标志物结直肠肿瘤的早期检测3,8- - - - - -10]。结肠病变的早期发现是最有效的方法来降低CRC发病率和死亡率(11]。因此,分子研究旨在识别CRC-specific甲基化标记可能对更好的理解提供有用的见解CRC进展(12,13]。

大多数结肠直肠癌起源于腺瘤息肉(14]。结直肠癌的发展是伴随着特定的命令事件驱动”Adenoma-Carcinoma序列。“在平均14个基因的甲基化是恶性肿瘤的形成和减少所需变化只满足良性肿瘤发生[15]。尽管根据优先序列,基因的改变发生变化的总积累而不是他们的订单负责肿瘤进展和行为。

DNA甲基化可以目标基因在不同阶段和不同的细胞通路。CHFR启动子甲基化(检查点与叉头和无名指域)被发现与生存相关,被认为是肿瘤复发的独立预测指标。IGFBP3(胰岛素样生长因子结合蛋白3)和CD109 DNA甲基化与恶化阶段II CRC的生存。肿瘤抑制基因(次数)等SOCS3, TFAP2E,CDH4也被报告为DNA甲基化目标的基因表达沉默在CRC肿瘤(16- - - - - -19]。

在这项研究中,我们调查了独特的DNA甲基化目标正常,腺瘤和癌标本的非裔美国人使用减少表示酸性亚硫酸盐测序检测新型DNA甲基化目标的路径癌症。

2。材料和方法

2.1。病人和组织样本

样本来自非裔美国人(AA)病人在霍华德大学医院(嗯)接受结肠镜检查和/或手术切除结肠病变(表1)。所有样品都是由一个专家分析胃肠道的病理学家哈病理学和保持冷冻直到用于DNA提取。样品由血液样本,正常结肠组织,一个管状腺瘤,tubulovillous腺瘤,5癌症。这些癌症包括选择基因甲基化在癌症的阶段。临床、人口、和病理标本(表数据收集1)。从所有参与者获得知情同意。这项研究是霍华德大学制度审查委员会批准(IRB 06-MED-39)。

2.2。DNA提取

从新鲜冷冻组织提取基因组DNA。样本中均质裂解缓冲组成的100毫米Tris-HCl (pH值8.5),5毫米EDTA,氯化钠0.2% SDS, 200毫米。蛋白酶K是300年刚添加的最终浓度μ克/毫升。样本孵化一夜之间在55°C,确保基因组DNA完全分离从任何DNA结合蛋白质。消化后,使用试剂盒基因组DNA提取的基因组DNA提取工具包(日耳曼敦,CA),根据制造商的说明(AllPrep试剂盒包)。DNA、质量和数量进行评估使用NanoDrop分光光度计和0.8%琼脂糖凝胶电泳。

2.3。EpiQuest图书馆建设

EpiQuest图书馆准备根据Zymo研究协议(欧文,CA)。200 - 500 ng基因组DNA的消化与内60单位Taq我和30个单位Msp我按顺序(伊普斯维奇,妈,美国)。Size-selectedTaq我msp我片段(40 - 120个基点和120 - 350个基点)被填平和3′终端扩展,提取与Zymo研究(ZR) DNA清洁和集中器™5套(欧文,CA)。结扎preannealed适配器包含5′-methyl-cytosine使用Illumina公司执行的DNA制备设备和协议(CA)圣地亚哥。纯化适配器的结扎碎片是bisulfite-treated使用EZDNA Methylation-Direct™工具包(欧文,CA)。制备规模PCR进行。DNA清洁和Concentrator-purified PCR产品受到最终大小选择4% NuSieve 3: 1琼脂糖凝胶。SYBR-green-stained凝胶片含有130 - 210个基点adaptor-ligated碎片或210 - 460 bp的大小被切除。图书馆材料从凝胶(Zymoclean中恢复过来™DNA凝胶回收试剂盒,欧文、钙、美国)和测序Illumina公司HiSeq基因组分析仪(CA)圣地亚哥。

2.4。EpiQuest序列比对和数据分析

顺序读取从bisulfite-treated EpiQuest库被确定使用标准Illumina公司base-calling软件,然后分析了使用Zymo研究专利分析管道根据制造商的建议(美国CA Zymo研究)。剩余胞核嘧啶(Cs)在每个读第一次转换为胸腺嘧啶(t),与每一个这样的转化为后续分析指出。一个参考序列数据库是由50个基点每个计算预测的目的Msp我taq我在40 - 350个基点片段大小范围。Cs在每一个片段都转换为Ts;转换读取对齐到改造参考。不匹配的数量在诱导对齐不改变的阅读和参考之间的数,忽略了在不改变的情况下,T匹配一个C在不改变的参考阅读。对于一个给定的阅读,最好的校准一直如果第二好的对齐两个不匹配;否则,阅读和nonunique丢弃。每个采样胞嘧啶的甲基化水平估计随着读取报告数量的C除以总数量的读取报告一个C或t .确切概率法以及用于每个CpG网站都有至少5读取。此外,基因启动子的身体,为每个CpG CpG岛添加注释。软件管道是在Python中实现的。

2.5。亚硫酸氢转换和多路放大

样品受到使用EZ DNA Methylation-Direct亚硫酸氢钠治疗™工具包(欧文,CA)。目标放大通过Fluidigm 48, 48访问数组使用Zymo研究的针对性的测序服务协议。示例加载、收获和池进行根据制造商的协议。甲基化分析数据从AA患者与正常相比候选人外周血标本以及正常结直肠组织。之间的两两DNA甲基化分析结直肠管状腺瘤等肿瘤样本tubulovillous腺瘤,肿瘤与正常组织样本(血液和正常的结肠)。

2.6。条码/拾音PCR

扩增子池为每个样品被稀释1:100,然后放大使用条形码adaptor-linkers收到Fluidigm根据制造商的协议(Fluidigm,旧金山,CA)。使用DNA反应是清理干净,Concentrator-5,产品被浓度和混合的规范化。测序、对齐、变性和数据分析库,稀释,和测序Illumina公司MiSeq根据制造商的协议(CA)圣地亚哥。序列是150 -基地paired-end跑。排列的顺序读取和分析如上所述。

2.7。路径分析

进一步分析了利用聪明才智通路分析(IPA)软件。出来“上游监管机构分析”预测上游监管机构通过结合定向甲基化变化从我们rrb methylation-sequencing目标和知识从之前的实验报告之间的因果效应分子如次数和致癌基因,编译出来的知识库。上游监管机构分析计算得分基于边缘的失调的下游分子和油气上下游的现有证据的一致性关系,对于每一个上游调节器已知的因果影响至少4(激活和抑制上/下)特异表达基因/成绩单。分别得分< 0 > 0,表明上游的显著抑制和激活状态调节器,不管这些分子的表达水平。看到(http://pages.ingenuity.com/rs/ingenuity/images/0812%20upstream_regulator_analysis_whitepaper.pdf)。网络生成算法链接分子根据实验观察交互和基于他们的互联性。总的来说,与其他网络成员之间的互动越多,更多的中央一个分子将在一个网络。

3所示。结果

3.1。rrb全球甲基化分析揭示了候选基因

从9 AA rrb测序数据样本得到如上所述和分析以成对的方式来确定不同甲基化CpG网站与结直肠肿瘤的相关性。这个分析显示增加DNA甲基化从正常到癌症平均速率范围从0.09 (L3MBTL1)到0.27 (PRDM14)(表2)。

rrb分析导致一系列不同的基因甲基化在正常,管状腺瘤,tubulovillous腺瘤、结直肠肿瘤样本(表2)。这些基因(L3MBTL1、NKX6-2 PREX1、TRAF7 PRDM14,NEFM)在肿瘤与正常组织相比,甲基化显著()。

rrb结果L3MBTL1(NM_032107)显示在启动子区域甲基化CpG网站22日在肿瘤样本。中央人民政府网站中没有一个是甲基化在正常,管状腺瘤,tubulovillous腺瘤(表样本2和3)。

至于NKX6-237 (NM_177400),我们发现在启动子区域甲基化CpG网站在肿瘤样本,而这些CpG位点被发现甲基化在正常,管状腺瘤,tubulovillous腺瘤(表样本2和3)。

为PREX1基因(NM_020820),我们确定启动子区域甲基化CpG 27个地方肿瘤样本和6甲基化CpG网站tubulovillous腺瘤样本。这些CpG网站被甲基化在正常和管状腺瘤(表样本2和3)。

TRAF7(NM_032271)微分17 CpG甲基化网站显示肿瘤样本,尽管这些甲基化在正常,管状腺瘤,tubulovillous腺瘤(表样本2和3)。

的PRDM14(NM_024504)基因甲基化在28 CpG网站显示这个基因的启动子区域内肿瘤样本,而没有一个被发现的甲基化在正常,管状腺瘤,tubulovillous腺瘤(表样本2和3)。

最后确定标记在这个研究NEFM(NM_005382) 12被确定在基因的甲基化CpG网站发起人地区肿瘤样本,虽然没有发现CpG位点甲基化在正常,管状腺瘤,tubulovillous腺瘤(表样本2和3)。甲基化CpG网站和其确切位置的基因是描绘在图上方1。

3.2。创新途径分析

hypermethylated标记分析的潜在生物功能(s)使用这个软件。L3MBTL1、NKX6-2 PREX1,TRAF7, PRDM14,NEFM被映射到Wnt /β连环蛋白P53, TGF -βPI3k / AKT、VEGF NF-kβ河马,P38 MAPK和JAK / STAT3信号通路(表4)(图2)。

3.3。通路分析差异甲基化的基因

上游和下游监管机构运行分析识别了监管机构(表6串扰4),即MMP3,GCG,HDAC1和AKT1,DKG4,年代MAD2所影响的L3MBTL1,NKX6-2,PREX1,PRDM14,NEFM,分别。内源性和外源性分子都包括在这个分析中。所有重要的监管机构被归类为转录因子显示在表中4。所有其他监管机构类型可以在图中找到2。明显特异表达的分子按其功能或参与病理生理过程。

3.4。分子参与IPA-Function特异表达的网络

下列细胞功能已经通过甲基化可能受到影响的确认(图6甲基化目标2)。

细胞凋亡反应。L3MBTL1、PREX1 TRAF7 PRDM14,NEFM是细胞凋亡反应的一部分,因为他们与P53交互,河马和P38 MAPK通路。

增殖反应。L3MBTL1、PREX1 TRAF7,NEFM一部分的扩散反应与TGF -β和河马通路。

炎症反应。PREX1, TRAF7,NEFM是炎症反应的一部分,因为他们与NF-k互动β途径。

4所示。讨论

许多方法被用来检测人体组织中的DNA甲基化的状态。大多数这些方法依赖的preknowledge分析甲基化目标等一种,p16和其他已知基因在结肠肿瘤转变。在此,我们使用减少表示酸性亚硫酸盐测序(rrb)建立微分DNA甲基化在结直肠癌的道路目标。rrb单基分辨率和检测CpG位点基因体内以及基因间区域,CpG岛和nonisland序列,通过高度敏感的测序汇集亚硫酸氢钠改性CpG序列(20.]。这种技术的实现在我们的研究导致了几个潜在的标记的识别,选择基于不同组合的分析样本(正常和腺瘤、腺瘤和癌和正常和癌症)。我们确定具体的CpG网站L3MBTL1、NKX6-2 PREX1、TRAF7 PRDM14,NEFM主要是甲基化在癌症标本而不是其他结肠病变;发现这些基因也参与许多重要通路与肿瘤相关的转换。

L3MBTL1基因位于染色体20 12是一个肿瘤抑制基因。众所周知作为染色质转录抑制因子,激活主要在生殖系干细胞(21]。这个基因,属于polycomb组(PcG)蛋白,结合一些甲基化赖氨酸H1b, H3和H4,阻止DNA序列访问转录(21]。曾庆红等人发现高水平的L3MBTL1甲基化是稍微乳腺癌死亡风险升高,和甲基化L3MBTL1在乳腺癌患者可以减少通过体育锻炼积极与总生存期(21]。异丙醇分析映射这个基因在Wnt /网络β连环蛋白P53, TGF -βVEGF, P38 MAPK和JAK / STAT3。在我们的研究中,这个标记的甲基化是在癌症但不是腺瘤样本符合通路通过异丙醇参与的类型分析。据我们所知,这是第一个暗示这个基因在结直肠癌。如果发现任何肿瘤出现前的病变,这种基因的甲基化应该指向高度致癌的病变,需要解决和监控积极由于其含义与主要癌症通路,包括VEGF指向以及转移的影响NKX6-2基因位于染色体上,称为预后标记。先前的研究表明,NKX6-2在膀胱肿瘤和hypomethylated hypermethylated正常白细胞(22]。另一项研究表明,DNA甲基化的NKX6-2的一个特点是CIMP在肾脏癌形成的早期阶段23]。NKX6-2也被确定为第二和第三阶段肺腺癌的生物标志物,在那里hypomethylated II期和hypermethylated III期(24]。575年中央人民政府网站从538−−上游的NKX6-2在SP1的结合位点,SP3, Egr-1(图1 (b))[25]。SP1报道作为转录激活而SP3充当一个激活和抑制因子,根据细胞和组织类型(25]。DNA甲基化与启动子区域的转录沉默,通过阻止特定转录因子的结合或通过招聘甲基CpG结合蛋白(25]。Egr-1和SP1作为积极的监管机构NKX6-2;这可能说明这些转录因子的影响NKX6-2基因(26]。异丙醇在Wnt /映射这个基因β连环蛋白和P38 MAPK信号通路。我们在这里报告的第一个暗示这个基因的甲基化肠癌致癌作用。hypermethylated的影响NKX6-2基因在膀胱癌,肾癌,肺腺癌,这是符合我们的结果在结直肠癌标本。

TRAF7是一些蛋白质的E3泛素连接酶位于染色体16 p。的差别表明,对这些基因的研究TRAF7是乳腺癌发展与不良预后相关27]。异丙醇在Wnt /网络映射这个基因β连环蛋白P53, TGF -βPI3K / AKT、VEGF NF-kβ河马,P38 MAPK和JAK / STAT3信号通路。在这里,我们表明,甲基化的TRAF7与癌症有关,而不是肿瘤出现前的标本。据我们所知这是第一次这基因被认为是一种独特的基因CRC患者。hypermethylated的影响TRAF7乳腺癌基因被报道与我们的结果是一致的,这在结直肠致癌基因起着重要的作用。

PRDM14包含一个公关领域,可能是一套的导数域,这是参与组蛋白尾巴上的赖氨酸残基的甲基化,并影响染色质结构和基因表达28]。一项回顾性研究表明了这一点PRDM14经常在乳腺癌,其超表达常常是与基因扩增(28]。我们在这里报告,这个基因可能也是一个甲基化在结直肠癌的目标。目前在二氧化硅的研究也表明,DNA甲基化的CpG位点位于620−−627英国石油公司上游启动子的转录起始站点PRDM14可能影响该基因的表达(29日]。CpG网站620−−627位于NFY的结合位点可以绑定(图1 (e))[30.]。核转录因子Y (NFY)是一种蛋白质形成一个高度保守的转录因子基因的启动子区域。先前的研究表明,NFY扮演着一个重要的角色在基因表达的调控及其参与各种类型的癌症肿瘤转移和乳腺癌进展已经指出[30.]。此外,NFY似乎调节细胞周期和细胞死亡相关基因的表达,表明其对肿瘤细胞增殖的贡献(30.]。异丙醇映射这个基因网络内的河马和P38 MAPK信号通路。的异常甲基化的影响PRDM14乳腺癌基因被报道与我们的结果是一致的,这种基因的甲基化在许多癌症中扮演一个重要的角色。

NEFM基因位于染色体8 p和hypermethylated在肾细胞癌31日]。异丙醇在Wnt /网络映射这个基因β连环蛋白P53, TGF -βPI3K / AKT NF-kβ、P38 MAPK和JAK / STAT3信号通路。据我们所知这是第一次NEFM在结直肠癌报道作为甲基化目标。hypermethylated的影响NEFM在肾癌基因已经被报道,这与我们的结果是一致的基因在结直肠致癌作用中起着重要的作用。我们意识到这项研究的局限性,如样本量,主要是由于高成本与rrb相关联的方法。随着技术变得更容易和成本效益,我们计划大研究验证报告发现。

总之,我们在这里报告6个新的不同的CpG甲基化目标(L3MBTL1、NKX6-2 PREX1、TRAF7 PRDM14,NEFM)与CRC非洲裔美国人。这些标记被发现参与的主要致癌途径和可能是一个潜在的兴趣CRC标记非洲裔美国人。

相互竞争的利益

作者宣称没有利益冲突。

确认

这个项目是支持由国家研究所(部分)人群健康状况及风险下的美国国立卫生研究院的奖项。G12MD007597。这个项目的部分资金也来自联邦基金(批准号UL1TR000101,以前医学转化UL1RR031975)从国家中心(NCATS),国立卫生研究院(NIH),通过临床与转化科学奖励计划。

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