pcr检测和基因分型的幽门螺杆菌在巴西患者内镜活检样本

文摘

幽门螺杆菌(幽门螺旋杆菌)被认为是第二个最常见感染人。精确的诊断是重要的治疗患者胃肠道症状说明。本研究分析了一种分子生物学方法的有效性(PCR)比较结果与组织学和快速尿素酶试验。PCR检测和基因分型的幽门螺旋杆菌urease-C基因和从患者获得的模式进行了研究。141年131名患者的活检样本进行评估。59石蜡切片样本阳性幽门螺旋杆菌根据组织学检查。其中,59/12(20.3%)使用PCR扩增。82个样本的新鲜的活组织检查,64是积极的幽门螺旋杆菌根据快速尿素酶试验(78%);有一个协议与PCR的100%。六十积极幽门螺旋杆菌样本的基因(58新鲜活检和样品2的石蜡切片样本)使用两个限制性内切酶。观察到的模式进行了分析与计算程序生物1 d;11与酶模式HhaI和12模式与酶MboI被发现。然而,它是不可能找到一个特定的基因型之间的显著相关性和消化疾病。因此,未来的研究应该进行确认统计上显著的基因型和胃肠道症状之间的关系。

1。介绍

的幽门螺杆菌(H。幽门)感染是目前在全世界流行高患病率(60%)在南美等发展中地区。感染引起慢性胃炎、胃及十二指肠溃疡,胃腺癌,mucosa-associated淋巴组织(1- - - - - -6]。H。幽门与一些自身免疫性疾病,包括特发性血小板减少性紫癜(ITP)、干燥综合征、系统性硬化(7),甲状腺机能亢进(8),和自身免疫性胰腺炎(9]。由于本协会的自身免疫性疾病,我们假设H。幽门可能诱发系统性免疫变化。虽然seroprevalence幽门螺旋杆菌可能在正常人群,少数发展消化性溃疡(10,11]。一些可能性可以证明这个数据:在宿主基因差异的环境因素和菌株。

现在可以使用各种测试来诊断幽门螺旋杆菌感染。胃组织的组织学检查、细菌培养、快速尿素酶试验、DNA探针的使用和PCR分析,当用于测试胃组织,都需要检查。相比之下,呼吸测试,血清学,胃液PCR和N的尿排泄¹⁵氨是侵入性的测试,不需要检查。PCR提供高敏感性和特异性的检测技术幽门螺旋杆菌虽然这种技术的精度变化很大(12]。这项工作的目的是分析的有效性PCR检测的分子生物学方法幽门螺旋杆菌患者的胃肠道症状,比较结果与组织学和快速尿素酶试验和使用PCR-RFLP技术来检测幽门螺旋杆菌亚型在内镜活检样本来自巴西的病人。

2。材料和方法

2.1。病人

141个样本收集从131年几个患者诊断消化道疾病。其中,99名患者参与这项研究有胃炎,29日有溃疡,5有胃炎和溃疡,3有食管炎,和5有其他胃肠疾病。患者平均48岁;他们的年龄从4到90岁。81名男性和50名女性(表1)。所有患者的内窥镜检查提交Gastrocentro(消化道研究中心),大学医院,SP,巴西坎皮纳斯州立大学获得了知情同意和协议后经医院伦理委员会批准。

2.2。方法

用于检测的方法幽门螺旋杆菌聚合酶链反应(PCR)和PCR-RFLP基因分型。他们选择以检测细菌及其亚型在内镜活检的新鲜组织和石蜡组织。新鲜的活检样本保存在生理血清0.9%直到DNA提取。至少两个,5 - 10毫米,丝带的石蜡收集石蜡组织。新鲜的活组织检查,至少有两个片段被收集。

2.2.1。DNA Extraction-Gastric石蜡切片

DNA提取的内镜活检系在随后石蜡戴维斯描述的方法et al ., 199513),做了一些调整。

至少两个,5 - 10毫米,丝带的石蜡被放置在一个1.5毫升埃普多夫管。一毫升的二甲苯添加到样本。他们动摇,允许休息3 - 5分钟,然后离心5分钟,丢弃之后二甲苯。三洗后在100%,95%,70%乙醇,样本分别在室温下干燥。接下来,解决方案中的材料是resuspended蛋白酶K, 50毫米三,0.5% SDS,无菌水。430年μL(苯酚被添加到样品,均质和离心机30分钟14000 RPM。上层清液含有DNA被转移到一个新的管和430年μL苯酚/氯仿(1:1)被添加在14000 RPM,再次离心5分钟。氯仿/异戊基乙醇(24:1)添加到上层清液,均质和离心机30分钟14000 RPM。之后的75年μ醋酸铵和750 LμL 100%,乙醇样本倒几次和孵化隔夜−20°C。在12000转离心30分钟后−4°C,浮在表面的被丢弃。500年沉淀仔细洗了μL(冷冻70%乙醇,立即丢弃。材料在室温下干燥,resuspended解决方案包含50毫升无菌水,三羟甲基氨基甲烷(pH值8.0)液10米,1毫升的EDTA和存储−20°C,直到它的使用。

2.2.2。DNA提取:新鲜的活组织检查

首先,一个新的3 - 7毫米活检部分是放置在一个与190年1.5毫升无菌管μL盐酸三的解决方案,包含0.1 (pH值7.5)和SDS的1%。其次,10μL蛋白酶K是(10毫克/毫升)添加到解决方案。样本浸渍和孵化隔夜55°C。200年之后,μL苯酚和200μL氯仿和异戊醇(24:1)补充道。解决方案被均质和离心机一分钟。接下来,上层清液被删除了,200μL氯仿/异戊醇的添加,均质,离心机1分钟。接下来,上层清液又删除了,25岁μL(醋酸钠3米和900μL 100%乙醇的−20°C添加;涡流混合物后孵化30分钟−70°C。样品在15000 RPM离心机15分钟。浮在表面的被丢弃。最后,DNA resuspended 25μL蒸馏和无菌水。(14]。

2.2.3。PCR扩增的幽门螺旋杆菌

随后的聚合酶链反应的方法描述Saiki和上校15),做了一些调整。

为每个放大反应,0.5到0.7μL的DNA在调查中被使用,反应总额的20.0μl反应缓冲区包含50 mM氯化钾,10毫米Tris-HCL pH值8.4,2.5毫米MgCL₂,2.0 pmol每个“入门”,200μ每个deoxynucleotide M三磷酸(dATP, dCTP dGTP, dTTP), 2.5单位的Taq (Gibco-BRL),和足够的水给20.0的总量μl反应混合物是覆盖着100年μL矿物油和管被放置在一个DNA热循环(优秀)。

随后的反应被发现是最优的。样本加热到94°C 60年代变性DNA,冷却到57°C 90年代允许DNA引物和再退火,然后加热到72°C的120年代底漆扩展。通过最后的周期,伸展期是7分钟。共40个循环进行。放大产品被直接探测到凝胶分析。5μL的反应混合物受到与2%琼脂糖电泳minigel, DNA是可视化使用紫外荧光与溴化乙锭染色后。分子量标记包含在每个凝胶。820碱基对乐队被当样本使用引物P1和P2检测放大幽门螺旋杆菌(表1和图1)。

2.2.4。pcr限制性内切酶片段长度多态性打字的幽门螺杆菌(RFLP)

放大后被证实,PCR产品提交与限制性内切酶消化HhaI和MboI碎片Urease-C [16]。

产生的碎片被提交到1000年2%的琼脂糖凝胶电泳(Gibco-BRL)和溴化乙锭染色,可视化在紫外线照射下,宝丽来拍摄系统。被发现的模式进行比较和分析与计算程序生物1 d (Restriction-PCR-RFLP-Restriction片段长度多态性分析),99年版(Vilber Loumart)(数据2和3)。

大约10μL的放大产品被用于消化过程也包含2.0μ相应的酶。水被添加到20.0μL和混合物放置在37°C浴过夜。

2.2.5。自动测序

使用这个程序执行自动测序Abi棱镜,型号377,3.4版本,100年Abi, 3.2版。DNA测序允许识别的研究区域(引物P1和P2)。图1显示了自动测序,序列的证明幽门螺杆菌。

3所示。结果

共有141名内镜活检样本131名患者进行了研究幽门螺旋杆菌感染和PCR结果与脲酶和组织学检查。82/64(78%)的新鲜样本有一个积极的脲酶试验幽门螺旋杆菌。PCR试验检测到的所有64份阳性样本确定的脲酶试验(100%)(表2)。

59石蜡切片,通过组织学检查发现是积极的,提交到DNA提取过程和β球蛋白PCR来证明质量和样本中提取DNA的存在。只有14/59(23.7%)样本阳性β球蛋白基因,但在两个幽门螺旋杆菌不是由PCR放大,即使他们有一个积极的组织学测试(表吗3)。其他45个样品,是不可能使用PCR检测DNAβ球蛋白,主要是因为低数量的石蜡样品和/或由于反应是抑制由于石蜡和xilol提取过程。没有受到污染和样本测试两次。

141份新鲜内镜活检样本中,58测试使用RFLP技术检测不同幽门螺旋杆菌strainswith的限制性内切酶HhaI和MboI。所有58样品显示积极为β球蛋白和PCR幽门螺旋杆菌基因。从获得的产品幽门螺旋杆菌通过直接PCR扩增基因820个碱基对。十一消化模式HhaI和十二个MboI(表中被发现4)。最常见的模式是HhaI-3 12.58 (18.3%), HhaI-4 14.58 (23.3%), MboI-2 13.58(21.7%),和MboI-4 15.58 (23.3%)。中位数年龄为45,39岁,39岁,和57个,分别在每个检测模式。在本研究的患者最常见的疾病是胃炎和溃疡。

4所示。讨论

胃癌是一种肿瘤,导致大多数的死亡不仅在巴西,世界各地。造成癌症的类型幽门螺旋杆菌可能与胃慢性。菌株之间的差异程度的毒性导致罹患胃疾病的风险增加(17]。

的幽门螺旋杆菌感染是分布在一个世界性的方式,主要是成年人口的发展中国家的社会经济水平低。排放感染率与细菌毒力和特定主机的内在因素,主要对免疫系统(18]。

应该注意到,粪口传播的路线似乎是在感染的患病率,最大的问题H。幽门一个严重的公共卫生问题在发达国家和发展中国家19]。

本研究分析了分子生物学方法的有效性PCR的检测幽门螺旋杆菌患者的胃肠道症状,比较它与组织学和快速尿素酶试验。

聚合酶链反应(PCR)的诊断幽门螺旋杆菌是一个非常敏感的和特定的方法(20.),提供快速和安全的诊断。许多研究结果表明,PCR的灵敏度是接近文化测试(21),但对于验证根除幽门螺旋杆菌PCR可以明显优越的有效性22,23]。其他的研究中使用的方法来区分不同的幽门螺旋杆菌亚型已经PCR-RFLP [24),通过与限制性内切酶分析PCR产物产生不同大小的碎片和消化配置文件是决定性的定义菌株。使用的限制性内切酶HhaI和MboI Urease-C区域(16]。极端程度的变化观察到的菌株幽门螺旋杆菌成为一个重要的科学关注的焦点,研究人员认识到重大的影响,这一现象可以在几个研究领域,如疫苗的发展,抗菌药物耐药性的发展,和宿植病原体相互作用的研究25,26]。考虑到10 - 20%的人感染幽门螺旋杆菌发展明显的疾病,血统的可靠识别可能是非常有益的27]。之前的研究使用几个技术特征幽门螺旋杆菌作为一个高度可变的物种提供了无数的血统,每一个与自己的不同的基因型28- - - - - -31日]。

的基因分型幽门螺旋杆菌是描述最重要的致病基因型和最常见的压力。此信息可以用于临床和流行病研究。即使许多感染是临床沉默,机体感染幽门螺旋杆菌提出了增加发病率和死亡率(5,32,33]。

在目前的研究中我们标准化PCR和物质从新鲜内镜活检样本获得的病人参加Gastrocentro(消化道研究中心),由医学院。一些胃活检样本中收集的石蜡和一些没有。对DNA提取技术的标准化的石蜡切片样本,发现了一些困难,因为样品含有少量的组织碎片和许多石蜡样品没有放大β球蛋白基因,表明退化DNA质量差或抑制。

使用PCR相比,因为它是更具体的和更快的其他方法;聚合酶链反应的产物可以用限制性内切酶处理来验证幽门螺旋杆菌菌株。此外,从PCR、DNA测序可以验证突变,没有其他技术就是这样做的能力。

作为内部控制的反应是用于所有样品(人类β球蛋白基因),也许活检阳性样品幽门螺旋杆菌,我们有100%的PCR扩增。然而,在一些石蜡样品,β球蛋白没有放大,表明低效的DNA提取的样品。

的效率幽门螺旋杆菌检测PCR在新鲜样品优于石蜡样品。我们怀疑PCR抑制可能发生由于用于DNA提取方法从石蜡或样本不足的事实。

DNA的提取从新鲜样品有极好的结果。在82分析样本,64是积极的和18负,100%赞同PCR。

在目前的研究中,我们使用了PCR-RFLP分化的方法幽门螺旋杆菌菌株从胃活检标本获得来自巴西的病人。使用这种方法,我们观察到12和11个生产模式,分别由两个限制性内切酶MboI和HhaI从58标本来自胃活检。两个样本的石蜡切片,58 nonfastened胃活检(表的样本1)。

这些数据表明,使用pcr PCR-RFLP可能是有用的作为一个快速的具体识别过程幽门螺旋杆菌血统在胃活检标本16]。基因分型分析的若干协议提出了区分临床孤立的血统幽门螺旋杆菌(34- - - - - -38]。几个引物对输入的检测和描述幽门螺旋杆菌是基于放大的尿素34],尿素+ ureB [35[],ureC基因36,38]。这些结果表明脲酶基因在临床的多样性幽门螺旋杆菌样本。李等人。16]发现3、11、6种模式是由19个临床孤立的样本,分别由限制性内切酶消化HhaI, MboI和AluI。Foxall et al。35)发现了10个不同的模式是由22个临床孤立样本,限制性内切酶HaeIII消化的PCR产物2.4 Kb被放大的尿素和ureB基因。洛佩兹et al。37)发现的模式生成的消化的PCR产物HaeIII酶,从尿素和ureB一样不同的标准HaeIII。Akopyanz et al。28)发现18MboI和27HaeIIIRFLP模式,由尿素和ureB基因PCR产品放大2.4 Kb的60幽门螺旋杆菌血统,杰出的44个独立团体模式。每个孤立的组没有不同于其他的RFLP分析尿素和ureB产品,但不同MboI1.7 Kb ureC消化和保险人的段。这样一个事实表明PCR-RFLP分析ureC基因可以产生大量的rflp标准。

几项研究已经证实,PCR-RFLP ureC基因的分析就可以区分临床孤立幽门螺旋杆菌。用限制性内切酶,摩尔et al。38]分析了1.1 Kb部分ureC“PCR基因放大的21个临床孤立幽门螺旋杆菌。样本与酶消化后分成四组HindIII,而血统被分成15组后消化的酶AluI和PvuI。藤本et al。36]证明了消化的820个基点幽门螺旋杆菌ureC与限制性内切酶基因HhaI,MboI,和MseI导致10、10和11种不同的模式,分别。Dooley et al。3)三种类型的酶用于PCR产品1.179个基点的一部分幽门螺旋杆菌ureC基因。11、10和6消化模式产生的HhaI MboI,和AluI酶,分别。

在我们的研究中,我们使用两种类型的限制性内切酶放大产品820 pb的幽门螺旋杆菌ureC基因。我们获得11和12种不同的模式,分别从58临床孤立样本进行了研究。我们的研究结果表明,PCR-RFLP的这一部分的分析幽门螺旋杆菌ureC基因是一种可靠的方法,和在这一领域,基因分型的PCR可以用于流行病研究和孤立的分化幽门螺杆菌链。

这项研究还显示高水平的遗传多样性孤立的不同幽门螺旋杆菌积极的病人在巴西进行了研究。

使用计算程序获得的基因分型模式比较生物1 d。我们发现11模式HhaI酶和12模式MboI酶。少量的研究样本的原因是由于这样的事实,是不可能建立一个重要的标准具体消化疾病和基因型之间的统计相关性。

我们相信的基因分型幽门螺旋杆菌可以促进微生物的特点的研究,促进检测致病性或不致病的病毒株,反过来,提供一个更好的理解一些细菌毒力因子,使用引起的疾病。

4.1。统计数据

协议是百分比计算比较幽门螺旋杆菌基因型获得直接PCR进行胃活检,从PCR获得基因型的DNA提取石蜡和新鲜的样品,以及组织学和脲酶测试。

利益冲突

作者声明没有冲突。

承认

作者感谢病人同意参与这项研究。

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