抗生素抗性的分子检测的南非株幽门螺杆菌

摘要

快速诊断和治疗幽门螺杆菌(幽门螺旋杆菌)提出了挑战。我们的目的是调查…的存在幽门螺旋杆菌，易感性的空间，以努力来验证在基因型HelicoDR测定的有效性相关的突变幽门螺旋杆菌在我们的环境中打字。利用Qiagen DNA提取试剂盒对254个活检标本进行培养，并从78个阳性培养物中提取DNA。采用采用反向杂交的Helico DR基因型来确认幽门螺旋杆菌，判定其易感性抗微生物剂，和突变赋予对克拉霉素和氟喹诺酮类耐药的检测。所述生物体是从由培养标本的二百五十四分之一百六十八（66.1％）分离。用于进一步调查78株，78分之12（15.38％）是耐克拉霉素而78分之66（84.61％）是敏感。对于氟喹诺酮，78分之70（89.74％）的菌株，而图8（10.26％）为耐药在易感。在17株与A2147G为最普遍观察到的突变;A2146C和D91N是最少。反向杂交测定法是在确认的存在下容易且快速的技术幽门螺旋杆菌，其抗菌的空间，相关的突变。关于这个实验的适宜性分析幽门螺旋杆菌打字在其他地区保证。

1.介绍

的负担幽门螺杆菌(H. pylori)在治疗上提出了巨大的挑战[1,2]。临床管理的幽门螺旋杆菌感染似乎坚韧，因为生物体生活在一个环境中不容易接触到许多药物，抗生素耐药性和患者依从性差[压倒性的存在3.]。清除胃内的微生物，可显著缓解与病原体有关的疾病[2,4]。消除采用选择的方案目前涉及使用组合疗法的：质子泵抑制剂（PPI）或铋化合物和两种抗生素最常克拉霉素和甲硝唑和/或阿莫西林[5]。

克拉霉素目前仍然是可用的最有效的抗生素幽门螺旋杆菌与其他分子相比，最小抑制浓度非常低[6]。例如氟喹诺酮如环丙沙星已在重复治疗失败和喹诺酮类三联疗法后的治疗方案被结合已被证明是非常有效的对患者[3.,7]。然而，幽门螺旋杆菌可以成为这些化合物，其危害的处理[成功耐3.,8]。特别是对克拉霉素的耐药性幽门螺旋杆菌分离被认为是治疗失败的发展中国家的主要原因[6]。生物体被称为其广泛的遗传多样性而变化地理[9，因此，抗菌药物的敏感性在人口统计学上也有所不同。初治患者耐药高，根除治疗不成功患者耐药更高[8]。耐克拉霉素已与降低到50S细菌核糖体亚基大环内酯类的结合[6,10]。大量研究表明，23S rRNA V结构域编码的肽转移酶区域的点突变导致了生物对克拉霉素的抗性[4]。这些突变能够抑制克拉霉素与核糖体亚基之间的结合，而核糖体亚基专门用于抗生素相关蛋白的合成。与克拉霉素耐药相关的突变通常发生在rRNA的A2143C和A2142C位点上，而A2142C位点的替换则较少发生[6,11,12]。不同的突变类型已经从世界不同地区的研究当中哪些是A2115G，G2141A，T2117C，T2182C，T2289C，G22-4A，C2245T和C2611A [描述6]。A2115G、G2141A、T2117C、T2289C除出现频率低外，临床相关性尚不明确[6,7]。喹诺酮类发挥它们的抗微生物作用通过影响DNA促旋酶，唯一已知的靶酶中的A亚基幽门螺旋杆菌(7,13]。抗性与变异在gyr87和gyr91轨迹或完全不存在野生型位点的关联。上轨迹91发现可能的突变是D91N，D91G，D91Y，和D91A以及N87H，N87I，N87K，N87Y或上位置87找到3.,13,14]。

电阻的幽门螺旋杆菌抗生素是目前在临床实验室细菌学通过标准方法，如磁盘扩散，微量肉汤稀释法或Etest法[广泛确定15,16]。这些表型方法在区分易感菌株和耐药菌株方面是有效的，但只能在几天后才能得到结果(考虑到这一点)幽门螺旋杆菌3-7天左右的需求增长），不给见解存在突变的类型，它可能是流行病学和临床意义。传统上，将突变使用分子分型方案，例如PCR限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）和测序检测4,11,12,17]。在文献中，但是，没有知识对发生在克拉霉素耐药株的密码子2146至2147年[突变的缺乏18]。一种基于pcr的杂交方法(Hain生命科学，Nehren，德国)使用一条设计用于检测幽门螺旋杆菌和在在克拉霉素耐药株及突变23S rRNA基因，其与氟喹诺酮的抗性相关的密码子2146至2147年（A2146G，A2146C和A2147G）在密码子87和91（N87K，D91N，D91G和D91Y）突变使用和验证在由Cambau等人的研究报告。(18在法国)。这种反向杂交试验提供了一步检测的存在幽门螺旋杆菌，其抗菌的空间，突变相关克拉霉素和氟喹诺酮类药物。因此，我们试图采用使用这种分析，调查的存在幽门螺旋杆菌而相关的基因突变对这些抗生素在努力来验证其有效性幽门螺旋杆菌由于我们之前的研究报道了南非东开普省的高患病率，因此在该环境中的相关研究[2,16]。

2.材料与方法

2.1。细菌菌株和最低抑菌浓度

本研究在无大环内酯和氟喹诺酮类抗生素治疗史的上消化道内镜检查患者中，培养阳性标本168/254例(66.1%)。从50名男性和28名女性分离出的阳性菌株中，有78株用于进一步调查。每个消化不良患者的胃窦和胃粘膜活检标本。活组织切片立即放入含有0.2 g/L半胱氨酸和20%甘油的无菌bijou瓶中，在采集后2小时内以冰的形式运送到实验室培养[2]。

活组织切片在无菌条件下均质，在BHI肉汤中加入0.2 g/L半胱氨酸和20%甘油，并以新鲜制备的哥伦比亚琼脂为基质(Oxoid，贝辛斯托克，英格兰)，补充7%的羊血(Oxoid，英格兰)和Skirrow的补充物(Oxoid，英格兰);培养基中还加入甲氧苄氨嘧啶(2.5 mg)、万古霉素(5 mg)、头孢磺啶(2.5 mg)和两性霉素(2.5 mg)。所有的平板在37℃的微嗜气条件下孵育3-5天(5%-6%)，10％，80％-85％）（Anaerocult，贝辛斯托克，英格兰）。菌株鉴定根据菌落形态和积极的氧化酶，脲酶，过氧化氢酶试验，并通过确认的放大GLMM基因如先前报道[2]。经确认的分离株悬浮在20%甘油中，并保存在−80℃的冰箱中(日本三洋)，直到进行基因分型。幽门螺旋杆菌所有实验均纳入参考菌株NCTC 11638。本研究获得了福特黑尔大学研究伦理委员会和东开普省卫生部的批准(方案编号EcDoH-Res 0002)。

如前所述，确定克拉霉素和环丙沙星的最低抑菌浓度(MIC) [16]。对于抗生素的MIC值分别为0.0625-256 μ克/ mL的环丙沙星和0.125-256 μ克/ mL的克拉霉素。

2.2。PCR方法

DNA使用按照制造商的建议密切的QIAamp组织试剂盒（Qiagen DNA提取试剂盒，SA）78个株提取的。细菌DNA的扩增是使用热启动DNA聚合酶（海恩Lifescience公司，内仁，德国）进行。生物素标记的引物用于这项研究，并在扩增试剂盒提供。引物利用GenBank登录号NC_009151的基因序列设计。用于单个混合物聚合酶链反应为50的最终体积 μ升含有35 μ1μl引物/核苷酸混合物（PNM），5 μ微升10x聚合酶温育缓冲液，2 μL of 1.5 mM MgCl₂，3 μ升不含核酸酶的水（海因Lifescience公司，内仁，德国）0.2 μL热电偶启动Taq DNA聚合酶（1-2单位被加入每个管中），和5 μ微升DNA模板。PCR使用热循环仪（应用生物系统公司，SA）进行。The amplification cycles consisted of an initial hot start of 95°C for 15 min, initial denaturation of target DNA at 95°C for 5 min, denaturation at 95°C for 30 sec and 58°C for 2 min, primer annealing at 95°C for 25 sec, 53°C for 40 sec, and 70°C for 40 sec, and extension at 70°C for 8 min. All reactions were performed through 32 cycles (Hain Lifescience, Nehren, Germany).

2.3。基因型HelicoDR分析

隔离物的确认为幽门螺旋杆菌，使用基因型HelicoDR试剂盒(Hain Lifescience, Nehren, Germany)对克拉霉素和氟喹诺酮进行抗菌药敏感性和突变分析。根据制造商的说明，该工具包使用混合托盘和TwinCubator (Hain Lifescience, Nehren，德国)进行反向混合。简单地说,20μ扩增的DNA的L的变性，并加入到在带材上的生物素化的探针和通过酶联免疫吸附测定（ELISA）在加入底物缀合物和底物中检测到了所形成的杂合体。四个gyr87野生型探针（gyr87WT1-gyr87WT4）和一个突变型探针（gyr87MUT），一个野生型探针（gyr91WT1）和三个突变体探针（gyr91MUT1-gyr91MUT3）用于在位置87和91，分别检测氟喹诺酮抗性。克拉霉素，一个野生型探针（23SWT）和三个突变体探针（23SMUT1-23SMUT3）用于检测电阻。在带材，被指定缀合物控制（CC），放大控制（AC）和幽门螺旋杆菌（生命值）。当WT探针之一染色与gyr91WT以及23SWT以及形成无突变带正在一起，结果被解释为敏感于相应抗生素。在CC和AC一个条带的存在意味着共轭控制和放大控制是在正确的帧，而在HP隐含的存在幽门螺旋杆菌根据制造商的说明书(Hain Lifescience, Nehren, Germany)。

2.4。统计分析

Epi信息版本2000(疾病控制和预防中心，亚特兰大，GA。用于统计分析。采用卡方检验或菲舍尔精确检验来检验在at时，男性和女性的药敏/抗性值是否有显著差异值<0.05。基因型HelicoDR试剂盒检测，克拉霉素和氟喹诺酮耐药的灵敏度和特异性分别如先前所描述，计算[18]。

3.结果

3.1。幽门螺杆菌株

在这项研究中，254分之168（66.1％）的标本呈阳性反应幽门螺旋杆菌通过培养和使用聚合酶链式反应/反向杂交测定法（基因型HelicoDR）证实。七八168株用于进一步调查。

3.2。抗菌药物敏感性和突变分析

而8（10.3％）有抗药性的菌株78的七（89.7％）是易受氟喹诺酮。克拉霉素，78分之66（84.6％）是敏感和78分之12（15.4％）为抗性的。检测电阻的灵敏度和特异性分别为98％和克拉霉素和89％和93％的氟喹诺酮100％。

78株菌株中，女性28株(35.9%)，男性50株(64.1%)。女性和男性克拉霉素耐药患病率分别为32.1%(9/28)和6%(3/50)，氟喹诺酮耐药患病率分别为17.9%和6%。在这项调查中，女性与男性相比，耐药分离株的患病率更高。使用克拉霉素的男女在统计学上有显著差异(），虽然氟无统计学显著（)。

描述了根据试剂盒设计的用于检测克拉霉素和氟喹诺酮耐药的突变体。表中总结了在17个菌株中观察到的突变1。

三种菌株有2个或多个突变与突变的（4）中发生252C的最高数目。与克拉霉素耐药相关A2147G突变是在这项研究中最常见的突变类型，而A2146C和D91N是最少。的17株的研究十二且具A2147G突变（表2)。

A2146C突变的频率非常低的发生在17株（5.8％）的仅一个（252C）。克拉霉素对这些突变体的MIC（A2147G和A2146C）介于32至256 μ克/毫升。

发现对氟喹诺酮耐药的8株的，所有（100％）具有与氟喹诺酮相关N87K突变。没有指定突变在使用这个试验五种菌株（247C，253C，369A，249A，249C和）作为发现有完全不存在的促旋酶87的野生型指示的突变（表示为N87K突变）。另外，在1（5.8％）中检测到与氟喹诺酮抗性相关的D91N 17株同时D91Y，并用氟喹诺酮抗性相关联的其他指定的突变都没有发现。最小抑制浓度为氟喹诺酮（247C，253C，369A，249A，249C和）（表1），从8范围 μ克/ mL至32 μ克/毫升。有两种克拉霉素，氟喹诺酮类药物突变株（252A和252C）有MIC 32 μg/mL, 247A为256μ克/毫升。

4.讨论

克拉霉素和氟喹诺酮类是目前选择的治疗为三重组合疗法中使用的药物幽门螺旋杆菌感染 [6]。抗这些药物的出现，并提出了挑战。不同的研究在世界各地已上报克拉霉素，氟喹诺酮类[阻力8,12,13,19]。高电阻率对这些抗生素，负担幽门螺旋杆菌感染及其相关疾病，加上快速诊断和管理患者的困难[16需要确定抗生素谱和相关突变，克拉霉素和氟喹诺酮才能幽门螺旋杆菌从东开普省分离的菌株已知有高流行率幽门螺旋杆菌- 相关并发症[2,16使用]基因型HelicoDR测定。

幽门螺旋杆菌在168/254份(66.1%)的标本中检出。克拉霉素作为一种有效的抗生素在世界范围内被广泛使用幽门螺旋杆菌(4,17]。然而，在一些研究中对克拉霉素耐药的报道越来越多[12,17]。这导致了引进新的治疗方法，如这看似是提供了很大的希望，但不幸的是它们阻力新兴[氟喹诺酮类7,13]。耐药性的存在往往与根除治疗的失败有关[20]。这项研究的调查结果显示阻力适中率克拉霉素和氟喹诺酮类药物与分别为15.38％和10.26％，百分比。这一结果证实了Kim等人的发现。(12]谁报告给具有一定范围的7.6％克拉霉素在韩国18.6％的阻力。像克拉霉素大环内酯类抗生素是昂贵的;然而，交叉耐药性与使用其它较便宜的大环内酯类联可以负责该电阻。值得说明的是，克拉霉素敏感和耐药株已经从病人身上分离出无接触史大环内酯类[事实21]。因此，当务之急是指导经验性治疗自克拉霉素的施用可以被选择用于电阻。

本研究报道的对氟喹诺酮的中等耐药率为10.26%，这与Wang等人的研究结果有关[。13]谁报15.6％，环丙沙星耐药他们在加拿大阿尔伯塔省的研究。但是，对氟喹诺酮类一般较低电阻已经相对于其他抗生素的报道。例如，在我们以前的研究[16]，所有菌株都对环丙沙星而不是在10.26％的电阻通常报道的在目前的研究氟喹诺酮。我们可能会涉及到这个菌株中的差异，以及在这两项研究中所用的方法（表型与分子）。另外，在基因型HelicoDR测定条带被设计成通常靶向氟喹诺酮类。洪等人。(3.]还记载5.7％电阻其菌株对环丙沙星和Kohanteb等。(22在他们的研究报告的4.7％。来自比利时，法国，意大利和德国分离株具有较高的耐药率对环丙沙星或左氧氟沙星16.8％和23％之间。范围3.,23]。此外，更高的耐药率(环丙沙星:33.8%;左氧氟沙星:21.5%)在日本发现[19]。这些电阻的不同速率可以归因于地理区域和药物使用方面的差异[9]。

抗生素耐药性的患病率男性高于女性在这项研究中达到了克拉霉素统计显著差异性（)，但不适用氟喹诺酮。重要的是，这项研究招募的男性比女性多，这可以解释观察到的差异。值得注意的是，对克拉霉素(12)和氟喹诺酮(8)耐药的菌株数量几乎相同，这表明这些抗生素作为药物选择的适宜性可能接近幽门螺旋杆菌治疗在我们的环境中证实我们先前的发现[16]。

与抗性相关对这些抗生素的突变进行了调查。三个菌株显示2点或更多的突变与252C发生的突变的最高数目（表1)。我们观察到，每个菌株的突变次数越多，该菌株的MIC值越高。本研究中对A2147G突变克拉霉素耐药菌株的MIC值在32 ~ 256之间μ克/毫升。菌株252A和252C的MIC为32μ分别为g/mL, 247A中MIC为256μ克/毫升;他们都拥有多个突变;247C和253C具有8 MIC值 μg / mL和16μ克/毫升（表1）， 分别。这些变化可能是由于应变多样性。

氟喹诺酮作用通过抑制DNA促旋酶，拓扑异构酶，以及与细菌DNA复制的干扰;由于拓扑异构酶未找到幽门螺旋杆菌基因组，在突变的gyrA编码DNA酶的基因被认为是导致氟喹诺酮类耐药的主要原因[7]。密码子N87和D91被认为是最重要的目标位点结合环丙沙星[3.,13]。该N87H，N87I，N87K和N87Y以及D91G，D91N，并D91Y突变的gyrA有报道喹诺酮抗性幽门螺旋杆菌株[3.]。本实验使用的分析方法被设计用来描述经常报道的N87K、D91N、D91G和D91Y。然而，N87K和D91N突变是本研究中发现的唯一与氟喹诺酮相关的突变。N87K是最常见的突变(8/17;在我们的菌株中发现了47.05%的氟喹诺酮，而在一个菌株中发现了D91N2)。

我们的发现与那些Wang等人的线。(13]和Hung等人[3.]谁分别报道了这些突变在他们的研究中存在。此外，它证实了一个事实，这些突变是最经常发现突变[3.,24]。在八种菌株中发现了N87K。本研究未发现D91Y和D91G突变。这与Garcia等人的发现相矛盾。[14世卫组织分别报告了在6个和7个菌株中存在这些突变。然而，在其巨大的样本量中仅发生5个和2个菌株可能意味着普遍低的发生率。

克拉霉素的作用通过抑制蛋白质的合成通过结合于已经在的23S rRNA基因的残基A2058和A2059已经显示23S rRNA基因的肽酰转移酶环大肠杆菌。当突变在这些残基发生时，克拉霉素对核糖体的结合亲和力降低，导致克拉霉素耐药[11,21]。在此研究中使用的测定法设计为靶向A2147G，A2146G的存在，并用克拉霉素耐药菌株有关[A2146C18];与经常报道的A2142G和A2143G相比，A2147G、A2146G和A2146C突变的文献资料较少[6,7]与克拉霉素耐药相关联[12]。

本研究报道的17株耐药菌株中有12株(70.5%)出现A2147G突变(表)1和2)。这与Cambau等人的研究结果一致。[18]谁报告A2147G突变的高患病率的菌株之间。A2147G突变的发生率较高表明其在高频当中研究了17株，而不是发生在一个（252C）A2146C我们当地的菌株。的灵敏度和检测到克拉霉素和氟喹诺酮抗性特异性在我们目前的研究确证观察到那些Cambau等人的。(18]，尽管它们专门用于左氧氟沙星，这也是氟喹诺酮的成员。它们分别报道的94％和99％克拉霉素和87％和99％值的左氧氟沙星。

总之，这项研究揭示性的适度速度氟喹诺酮类和克拉霉素，具有A2147G和N87K是分别克拉霉素，氟喹诺酮类，相关的主要突变。然而，氟喹诺酮类和克拉霉素耐药的连续监测中幽门螺旋杆菌因此，在这方面的相关指导经验性治疗。

伦理批准

该研究得到了健康的东开普省部（协议编号EcDoH-RES 0002）和黑尔堡，爱丽丝，南非大学的研究伦理委员会。

利益冲突

作者宣称，他们没有利益冲突。

致谢

本研究获得了南非国家研究基金会(NRF)的资助(赠款参考UID 69816);南非黑尔堡大学戈万·姆贝基研究与发展中心。我们感谢Hain生命科学，南非，为提供扩增和基因型HelicoDR试剂盒。

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