1.介绍
的负担
幽门螺杆菌(H. pylori) 在治疗上提出了巨大的挑战[
1 ,
2 ]。临床管理的
幽门螺旋杆菌 感染似乎坚韧，因为生物体生活在一个环境中不容易接触到许多药物，抗生素耐药性和患者依从性差[压倒性的存在
3. ]。清除胃内的微生物，可显著缓解与病原体有关的疾病[
2 ,
4 ]。目前用于根除的选择方案包括使用联合疗法:质子泵抑制剂(PPI)或铋化合物和两种抗生素，最常见的是克拉霉素、甲硝唑和/或阿莫西林[
5 ]。
克拉霉素目前仍然是可用的最有效的抗生素
幽门螺旋杆菌 与其他分子相比，最小抑制浓度非常低[
6 ]。在多次治疗失败后，氟喹诺酮类药物如环丙沙星已被纳入治疗方案，喹诺酮类三联疗法已被证明对患者是高效的[
3. ,
7 ]。然而,
幽门螺旋杆菌 会对这些化合物产生抗药性，从而危及治疗的成功[
3. ,
8 ]。特别是对克拉霉素的耐药性
幽门螺旋杆菌 分离菌被认为是发展中国家治疗失败的主要原因[
6 ]。生物体被称为其广泛的遗传多样性而变化地理[
9 ，因此，抗菌药物的敏感性在人口统计学上也有所不同。初治患者耐药高，根除治疗不成功患者耐药更高[
8 ]。耐克拉霉素已与降低到50S细菌核糖体亚基大环内酯类的结合[
6 ,
10 ]。大量研究表明，23S rRNA V结构域编码的肽转移酶区域的点突变导致了生物对克拉霉素的抗性[
4 ]。这些突变能够抑制克拉霉素与核糖体亚基之间的结合，而核糖体亚基专门用于抗生素相关蛋白的合成。与克拉霉素耐药相关的突变通常发生在rRNA的A2143C和A2142C位点上，而A2142C位点的替换则较少发生[
6 ,
11 ,
12 ]。全球不同地区的研究描述了不同的突变类型，其中有A2115G、G2141A、T2117C、T2182C、T2289C、G22-4A、C2245T和C2611A [
6 ]。A2115G、G2141A、T2117C、T2289C除出现频率低外，临床相关性尚不明确[
6 ,
7 ]。喹诺酮类发挥它们的抗微生物作用通过影响DNA促旋酶，唯一已知的靶酶中的A亚基
幽门螺旋杆菌 (
7 ,
13 ]。抗性与变异在gyr87和gyr91轨迹或完全不存在野生型位点的关联。上轨迹91发现可能的突变是D91N，D91G，D91Y，和D91A以及N87H，N87I，N87K，N87Y或上位置87找到
3. ,
13 ,
14 ]。
电阻的
幽门螺旋杆菌 目前，临床细菌学实验室普遍采用标准方法测定抗生素，如盘扩散法、微液稀释法或Etest [
15 ,
16 ]。这些表型方法在区分易感菌株和耐药菌株方面是有效的，但只能在几天后才能得到结果(考虑到这一点)
幽门螺旋杆菌 3-7天左右的需求增长），不给见解存在突变的类型，它可能是流行病学和临床意义。传统上，将突变使用分子分型方案，例如PCR限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）和测序检测
4 ,
11 ,
12 ,
17 ]。在文献中，但是，没有知识对发生在克拉霉素耐药株的密码子2146至2147年[突变的缺乏
18 ]。一种基于pcr的杂交方法(Hain生命科学，Nehren，德国)使用一条设计用于检测
幽门螺旋杆菌 和在2146 - 2147密码子突变(A2146G、A2146C A2147G)在23个s rRNA在克拉霉素耐药隔离和突变基因密码子87年和91年(N87K、D91N D91G和D91Y)是与耐氟喹诺酮类被使用和验证研究Cambau et al。
18 在法国)。这种反向杂交试验提供了一步检测的存在
幽门螺杆菌, 它的抗菌概况，和突变相关的克拉霉素和氟喹诺酮。因此，我们寻求使用这个分析来调查存在
幽门螺旋杆菌 以及与这些抗生素相关的突变，以验证其有效性
幽门螺旋杆菌 由于我们之前的研究报道了南非东开普省的高患病率，因此在该环境中的相关研究[
2 ,
16 ]。
2.材料和方法
2.1。细菌菌株和最低抑菌浓度
本研究在无大环内酯和氟喹诺酮类抗生素治疗史的上消化道内镜检查患者中，培养阳性标本168/254例(66.1%)。从50名男性和28名女性分离出的阳性菌株中，有78株用于进一步调查。每个消化不良患者的胃窦和胃粘膜活检标本。活组织切片立即放入含有0.2 g/L半胱氨酸和20%甘油的无菌bijou瓶中，在采集后2小时内以冰的形式运送到实验室培养[
2 ]。
活组织切片在无菌条件下均质，在BHI肉汤中加入0.2 g/L半胱氨酸和20%甘油，并以新鲜制备的哥伦比亚琼脂为基质(Oxoid，贝辛斯托克，英格兰)，补充7%的羊血(Oxoid，英格兰)和Skirrow的补充物(Oxoid，英格兰);培养基中还加入甲氧苄氨嘧啶(2.5 mg)、万古霉素(5 mg)、头孢磺啶(2.5 mg)和两性霉素(2.5 mg)。所有的平板在37℃的微嗜气条件下孵育3-5天(5%-6%)
O
2
，10％
有限公司
2
，80％-85％
N
2
）（Anaerocult，贝辛斯托克，英格兰）。菌株鉴定根据菌落形态和积极的氧化酶，脲酶，过氧化氢酶试验，并通过确认的放大
GLMM 基因如先前报道[
2 ]。经确认的分离株悬浮在20%甘油中，并保存在−80℃的冰箱中(日本三洋)，直到进行基因分型。
幽门螺旋杆菌 所有实验均纳入参考菌株NCTC 11638。本研究获得了福特黑尔大学研究伦理委员会和东开普省卫生部的批准(方案编号EcDoH-Res 0002)。
如前所述，确定克拉霉素和环丙沙星的最低抑菌浓度(MIC) [
16 ]。对于抗生素的MIC值分别为0.0625-256
μ 克/ mL的环丙沙星和0.125-256
μ 克/ mL的克拉霉素。
2.2。PCR方法
采用QIAamp组织试剂盒(Qiagen DNA提取试剂盒，SA)严格按照厂家建议提取78株菌株的DNA。使用热启动DNA聚合酶(Hain life - cience, Nehren, Germany)对细菌DNA进行扩增。本研究使用生物素化引物，并在扩增试剂盒中提供。引物采用GenBank登录号NC_009151的基因序列设计。单一混合物的聚合酶链反应最终体积为50
μ 升含有35
μ 1μl引物/核苷酸混合物（PNM），5
μ 微升10x聚合酶温育缓冲液，2
μ L为1.5 mM MgCl2 ，3
μ L核酸酶游离水(Hain Lifescience, Nehren，德国)0.2
μ L热电偶启动Taq DNA聚合酶（1-2单位被加入每个管中），和5
μ 微升DNA模板。PCR使用热循环仪（应用生物系统公司，SA）进行。The amplification cycles consisted of an initial hot start of 95°C for 15 min, initial denaturation of target DNA at 95°C for 5 min, denaturation at 95°C for 30 sec and 58°C for 2 min, primer annealing at 95°C for 25 sec, 53°C for 40 sec, and 70°C for 40 sec, and extension at 70°C for 8 min. All reactions were performed through 32 cycles (Hain Lifescience, Nehren, Germany).
2.3。基因型HelicoDR分析
隔离物的确认为
幽门螺杆菌, 使用基因型HelicoDR试剂盒(Hain Lifescience, Nehren, Germany)对克拉霉素和氟喹诺酮进行抗菌药敏感性和突变分析。根据制造商的说明，该工具包使用混合托盘和TwinCubator (Hain Lifescience, Nehren，德国)进行反向混合。简单地说,20
μ 将扩增后的DNA变性后加入到带生物素化的探针中，通过酶联免疫吸附法(ELISA)检测基质结合物和底物。使用4个gyr87野生型探针(gyr87WT1-gyr87WT4)和1个突变型探针(gyr87MUT)、1个野生型探针(gyr91WT1)和3个突变型探针(gyr91MUT1-gyr91MUT3)分别检测87和91位氟喹诺酮耐药。对于克拉霉素，使用1个野生型探针(23SWT)和3个突变型探针(23SMUT1-23SMUT3)检测耐药。在条带上，分别指定共轭控制(CC)、扩增控制(AC)和
幽门螺旋杆菌 (惠普)。当其中一个WT探针与gyr91WT和23SWT染色均为阳性，且未形成突变带时，解释为对各自的抗生素敏感。在CC和AC处出现条带意味着共轭控制和放大控制在正确的框架内，而在HP处提示存在
幽门螺旋杆菌 根据制造商的说明书(Hain Lifescience, Nehren, Germany)。
2.4。统计分析
Epi信息版本2000(疾病控制和预防中心，亚特兰大，GA。用于统计分析。采用卡方检验或菲舍尔精确检验来检验在at时，男性和女性的药敏/抗性值是否有显著差异
P
值<0.05。基因型HelicoDR试剂盒检测，克拉霉素和氟喹诺酮耐药的灵敏度和特异性分别如先前所描述，计算[
18 ]。
3.结果
3.1。< /斜体> <斜体>幽门螺杆菌菌株
在这项研究中，254分之168（66.1％）的标本呈阳性反应
幽门螺旋杆菌 通过培养和聚合酶链反应/反向杂交试验(基因型HelicoDR)证实。168株中的78株用于进一步的调查
。
3.2。抗菌药物敏感性和突变分析
78株对氟喹诺酮敏感的有70株(89.7%)，耐药的有8株(10.3%)。对克拉霉素，66/78(84.6%)为易感，12/78(15.4%)为耐药。克拉霉素耐药性检测的敏感性和特异性分别为98%和100%，氟喹诺酮耐药性检测的敏感性和特异性分别为89%和93%。
78株菌株中，女性28株(35.9%)，男性50株(64.1%)。女性和男性克拉霉素耐药患病率分别为32.1%(9/28)和6%(3/50)，氟喹诺酮耐药患病率分别为17.9%和6%。在这项调查中，女性与男性相比，耐药分离株的患病率更高。使用克拉霉素的男女在统计学上有显著差异(
P
=
0.006
)，但氟喹诺酮(
P
=
0.127
)。
描述了根据试剂盒设计的用于检测克拉霉素和氟喹诺酮耐药的突变体。表中总结了在17个菌株中观察到的突变
1 。
表1
与克拉霉素和氟喹诺酮类药物相关的突变。
突变株
独立数
突变的等位基因一个
指定
氨基酸改变
麦克风(µg /毫升)
245年,一个
1
23 smut3
A2147G
256
245 c
1
23 smut3
A2147G
32
247年,一个
2
23 smut3
gyr 87 WT
A2147G
256
247 c
1
没有
gyr 87 WT
N87K
8
249A
1
没有
gyr 87 WT
N87K
32
249C
1
没有
gyr 87 WT
N87K
16
252年,一个
2
没有
gyr 87 WT
23 smut3
N87K
32
252 c
4
没有
gyr 87 WT
gyr 91 WT
23 smut2
23 smut3
N87K
32
253 c
1
没有
gyr 87 WT
N87K
16
254年,一个
1
23 smut3
A2147G
256
119A
1
23 smut3
A2147G
32
275年,一个
1
23 smut3
A2147G
128
305A
1
23 smut3
A2147G
64
305C
1
23 smut3
A2147G
128
369年,一个
1
没有
gyr 87 WT
N87K
16
436C
1
23 smut3
A2147G
256
499 c
1
23 smut3
A2147G
64
一个 识别不同的突变被赋予一个等位基因名称（标识），其表示在核苷酸（nt）的在一个基因和基因产物对应的氨基酸变化的特定变化。
三种菌株有2个或多个突变与突变的（4）中发生252C的最高数目。与克拉霉素耐药相关A2147G突变是在这项研究中最常见的突变类型，而A2146C和D91N是最少。的17株的研究十二且具A2147G突变（表
2 )。
表2
克拉霉素和氟喹诺酮类药物突变的分布当中17株。
突变
菌株总数
%的菌株与每种突变类型
A2147G
12
70.5（12/17）
A2146C
1
5.8 (1/17)
N87K
8
47.05（8/17）
D91N
1
5.8 (1/17)
突变类型的总数
22
A2146C突变的频率非常低的发生在17株（5.8％）的仅一个（252C）。克拉霉素对这些突变体的MIC（A2147G和A2146C）介于32至256
μ 克/毫升。
发现对氟喹诺酮耐药的8株的，所有（100％）具有与氟喹诺酮相关N87K突变。没有指定突变在使用这个试验五种菌株（247C，253C，369A，249A，249C和）作为发现有完全不存在的促旋酶87的野生型指示的突变（表示为N87K突变）。另外，在1（5.8％）中检测到与氟喹诺酮抗性相关的D91N 17株同时D91Y，并用氟喹诺酮抗性相关联的其他指定的突变都没有发现。最小抑制浓度为氟喹诺酮（247C，253C，369A，249A，249C和）（表
1 ），从8范围
μ 32 g / mL
μ 克/毫升。克拉霉素和氟喹诺酮突变株(252A和252C)的MIC为32
μ g/mL, 247A为256
μ 克/毫升。
4.讨论
克拉霉素和氟喹诺酮类是目前选择的治疗为三重组合疗法中使用的药物
幽门螺旋杆菌 感染(
6 ]。抗这些药物的出现，并提出了挑战。不同的研究在世界各地已上报克拉霉素，氟喹诺酮类[阻力
8 ,
12 ,
13 ,
19 ]。高电阻率对这些抗生素，负担
幽门螺旋杆菌 感染及其相关疾病，加上快速诊断和管理患者的困难[
16 需要确定抗生素谱和相关突变，克拉霉素和氟喹诺酮才能
幽门螺旋杆菌 从东开普省分离的菌株已知有高流行率
幽门螺旋杆菌 - 相关并发症[
2 ,
16 使用]基因型HelicoDR测定。
幽门螺旋杆菌 在168/254份(66.1%)的标本中检出。克拉霉素作为一种有效的抗生素在世界范围内被广泛使用
幽门螺旋杆菌 (
4 ,
17 ]。然而，克拉霉素耐药已越来越多地在一些研究报道[
12 ,
17 ]。这导致了新的治疗方法的引入，比如氟喹诺酮类药物，它似乎带来了巨大的希望，但不幸的是，对它们的耐药性正在出现[
7 ,
13 ]。耐药性的存在往往与根除治疗的失败有关[
20. ]。本研究发现克拉霉素和氟喹诺酮的耐药率适中，分别为15.38%和10.26%。这一结果证实了Kim等人的发现[
12 ]谁报告给具有一定范围的7.6％克拉霉素在韩国18.6％的阻力。像克拉霉素大环内酯类抗生素是昂贵的;然而，交叉耐药性与使用其它较便宜的大环内酯类联可以负责该电阻。值得说明的是，克拉霉素敏感和耐药株已经从病人身上分离出无接触史大环内酯类[事实
21 ]。因此，当务之急是指导经验性治疗自克拉霉素的施用可以被选择用于电阻。
本研究报道的对氟喹诺酮的中等耐药率为10.26%，这与Wang等人的研究结果有关[。
13 ]谁报15.6％，环丙沙星耐药他们在加拿大阿尔伯塔省的研究。但是，对氟喹诺酮类一般较低电阻已经相对于其他抗生素的报道。例如，在我们以前的研究[
16 ，所有菌株都对环丙沙星敏感，而不是目前研究中普遍报道的对氟喹诺酮的10.26%耐药性。我们可能会将其与菌株的差异以及两项研究中使用的方法(表型与分子)联系起来。此外，基因型HelicoDR分析中的条带通常是针对氟喹诺酮类药物设计的。洪等人[
3. 也记录了5.7%的菌株对环丙沙星的耐药性，Kohanteb等[
22 在他们的研究报告的4.7％。来自比利时，法国，意大利和德国分离株具有较高的耐药率对环丙沙星或左氧氟沙星16.8％和23％之间。范围
3. ,
23 ]。此外，更高的耐药率(环丙沙星:33.8%;左氧氟沙星:21.5%)在日本发现[
19 ]。这些电阻的不同速率可以归因于地理区域和药物使用方面的差异[
9 ]。
在本研究中，男性的抗生素耐药率高于女性，克拉霉素(
P
=
0.006
)，但不适用氟喹诺酮。重要的是，这项研究招募的男性比女性多，这可以解释观察到的差异。值得注意的是，对克拉霉素(12)和氟喹诺酮(8)耐药的菌株数量几乎相同，这表明这些抗生素作为药物选择的适宜性可能接近
幽门螺旋杆菌 在我们的环境中进行的治疗证实了我们先前的发现[
16 ]。
研究了与这些抗生素耐药性相关的突变。3个菌株有2个或2个以上的突变，其中252C突变数量最多(表)
1 )。我们观察到，每个菌株的突变次数越多，该菌株的MIC值越高。本研究中对A2147G突变克拉霉素耐药菌株的MIC值在32 ~ 256之间
μ 克/毫升。株252A和252C有32 MIC
μ 分别为g/mL, 247A中MIC为256
μ 克/毫升;他们都拥有多个突变;247C和253C具有8 MIC值
μ 克/ mL和16
μ 克/毫升（表
1 ）， 分别。这些变化可能是由于应变多样性。
氟喹诺酮作用通过抑制DNA促旋酶，拓扑异构酶，以及与细菌DNA复制的干扰;由于拓扑异构酶未找到
幽门螺旋杆菌 基因组，变异
的gyrA 编码DNA酶的基因被认为是导致氟喹诺酮类耐药的主要原因[
7 ]
。 密码子N87和D91被认为是最重要的目标位点结合环丙沙星[
3. ,
13 ]。该N87H，N87I，N87K和N87Y以及D91G，D91N，并D91Y突变
的gyrA 有没有对氟喹诺酮耐药的报道
幽门螺旋杆菌 压力(
3. ]。在这项研究中所用的试验旨在描绘N87K，D91N，D91G和D91Y已屡有报道。然而，N87K和D91N突变与本研究中发现，氟喹诺酮相关的唯一突变。N87K是最常见的突变（8/17; 47.05％）与氟喹诺酮我们的菌株之间相关联，而D91N在一个菌株（表发现
2 )。
我们的发现与Wang等人的一致。[
13 ]和Hung等人[
3. 他们分别在他们的研究中报告了这些突变的存在。此外，它证实了这一事实，即这些突变是最常见的突变[
3. ,
24 ]。在八种菌株中发现了N87K。本研究未发现D91Y和D91G突变。这与Garcia等人的发现相矛盾。[
14 世卫组织分别报告了在6个和7个菌株中存在这些突变。然而，在其巨大的样本量中仅发生5个和2个菌株可能意味着普遍低的发生率。
克拉霉素的作用通过抑制蛋白质的合成通过结合于已经在的23S rRNA基因的残基A2058和A2059已经显示23S rRNA基因的肽酰转移酶环
大肠杆菌 。当突变在这些残基发生时，克拉霉素对核糖体的结合亲和力降低，导致克拉霉素耐药[
11 ,
21 ]。本研究中使用的试验旨在针对与克拉霉素耐药菌株相关的A2147G、A2146G和A2146C的存在[
18 ];与经常报道的A2142G和A2143G相比，A2147G、A2146G和A2146C突变的文献资料较少[
6 ,
7 ]与克拉霉素耐药相关联[
12 ]。
本研究报道的17株耐药菌株中有12株(70.5%)出现A2147G突变(表)
1 和
2 )。这与Cambau等人的研究结果一致。[
18 他们报告在他们的菌株中A2147G突变的高流行率。A2147G突变的高发生率表明它在我们的本地菌株中出现的频率很高，而A2146C在17个菌株中只出现了一个(252C)突变。本研究观察到的检测克拉霉素和氟喹诺酮耐药的敏感性和特异性与Cambau等人的研究结果一致
。 (
18 ，尽管他们专门使用左氧氟沙星，它也是氟喹诺酮的一种。他们报告的克拉霉素值为94%和99%，左氧氟沙星值为87%和99%。
综上所述，本研究显示了对氟喹诺酮和克拉霉素的中等耐药率，A2147G和N87K分别是与克拉霉素和氟喹诺酮相关的主要突变。然而，连续监测氟喹诺酮和克拉霉素耐药性
幽门螺旋杆菌 因此，在这方面指导经验治疗是有意义的。