罗格列酮对PPAR表达的影响γ.，nf-κ..b，和tnf-α.在大鼠溃疡性结肠炎模型中

抽象的

目的．观察疾病活动性指数(DAI)和结肠黏膜损伤指数(CMDI)，检测结肠黏膜PPAR的表达γ.，nf-κ..b，和tnf-α.在具有溃疡性结肠炎（UC）的大鼠中，并研究Rosiglitazone在UC中的保护作用。方法．Sprague-Dawley（SD）大鼠分为三组：对照组，罗格列酮治疗组和UC模型组。在灌肠剂和Dai，CMDI和结肠表达后的治疗后7,14,21或35天处于处死大鼠PPAR的γ.，nf-κ..b，和tnf-α.被评估。结果．在UC模型组，DAI，CDMI和NF-的结肠表达κ..b和tnf-α.与对照组相比，在所有时间点都显著增加，但PPARγ.显著降低。此外，罗格列酮治疗组与UC模型组相比，DAI和CMDI在14、21和35天时间点显著降低;NF-在结肠中的表达κ..b和tnf-α.与所有时间点的UC型号组相比减少，但PPARγ.表达显着增加。结论．Rosiglitazone可以通过上调PPAR来缓解结肠粘膜炎症并对UC具有保护作用γ.NF-的表达和下调κ..b和tnf-α.表达式。

1.介绍

UC是肠炎的慢性炎症状况，其病因仍然未知。细胞因子是在UC的活性和慢性阶段进行的炎症途径的关键组分。

NF -κ..B是许多基因表达的一个关键调节因子，这些基因涉及肠道中的免疫和炎症反应[1］．NF -κ..B可以激活抗凋亡基因并抑制一些炎症细胞的凋亡，从而伸长和恶化的组织炎症损伤[2］．TNF-α.是涉及全身炎症的重要促炎细胞因子，刺激急性期反应[3.］．TNF-调控的改变α.,特别是肿瘤坏死因子-α.过度表达，已涉及与UC相关的各种症状。炎症、厌食和体重减轻都与TNF-水平升高有关α.表达 [4.］．

过氧化物酶体增殖物激活受体(ppar)是转录因子核激素受体超家族的成员。抗糖尿病药物噻唑烷二酮类(TZDs)是糖尿病的配体γ.PPARs亚型。高水平的PPARγ.蛋白由结肠上皮表达。最近的证据表明PPAR可能具有抗炎作用γ.配体，包括TZD，特别是在冒号中[5.］．PPAR治疗γ.已证明配体抑制炎症细胞因子产生，炎症细胞增殖[6.］．

我们通过灌肠进行了2,4,6-三硝基磺酸磺酸溶液（TNB）和乙醇的混合物溶液诱导的UC诱导的大鼠模型，并在这些大鼠用罗格列酮处理，一种TZDS，通过胃灌洗，结肠粘膜处理PPAR的表达γ.，nf-κ..b，和tnf-α.探讨罗格列酮对UC大鼠的保护作用。

2.方法

2.1。材料

大连医科大学的SPF实验室动物中心提供了重180-220克的健康雄性SD大鼠180-220克和4-8周的大鼠。TNB是从Sigma购买的。Rosiglitazone Malide片剂由Glaxosmithkline提供。PPAR.γ.，nf-κ..b，和tnf-α.多克隆抗体由BioWorld技术提供。MaxVision TM Plus Poly HRP（鼠标/兔子）IHC套件由北京中山市金桥生物科技有限公司提供底漆，DNA标记（DL 2000），Takara RNA聚合酶链反应（PCR）Kit3.0（AMV）试剂盒是来自大连，Takara有限公司

2.2。动物待遇

将72只SD大鼠随机分为三组：对照组，Rosiglitazone治疗组和UC模型组，每组2例。通过通过灌肠施用TNB（100mg / kg）和50％乙醇（0.25ml）的混合物溶液来建立UC的SD大鼠模型。对照组患有灌肠和胃灌洗，含生盐水。对于Rosiglitazone治疗组，TNB通过灌肠施用，Rosiglitazone通过胃灌洗（每天8mg / kg一次）给药。UC模型组经过TNBS灌肠，胃灌洗是盐水控制。在第7,14,21,21,21,21,21,25,5,21,21和35时处死所有群体的大鼠，每天在灌肠和结肠组织中每天服用6只大鼠，从肛门染色2.0-10.0厘米，用于他染色，RT-PCR和免疫组织化学分析。在实验前一周，将大鼠在通常受控的繁殖室中，在标准实验室食品和水中。大鼠按照国际接受的实验室使用原则维持。

２.３.疾病活动指数(DAI)和结肠黏膜损伤指数(CMDI)评分

称重大鼠并检查行为，粪便一致性，每天粪便中的总血液。分数分配如下：体重减少的百分比（0，无变化; 1,1-5％; 2,6-10％; 3,11-15％; 4，> 15％）;大便一致性（0，正常; 2，松散; 4，腹泻）;和粪便血液的存在（0，正常; 2，阳性隐匿性血液测试; 4，可见渗出）[7.］．DAI是根据这些分数的总和来计算的。

在指定的时间点处死大鼠，从盲肠到肛门切除整个结肠并纵向切开。宏观损伤评估使用经过验证的(CMDI)评分系统，稍加修改[8.］．数值评分分数如下：0，没有炎症;1，局部充血和水肿没有溃疡或粘膜表面的腐蚀;2，溃疡没有充满血;3，一个位点的溃疡和粘连;4，两种或更多种炎症和溃疡延伸的肿瘤延伸> 1厘米;5，溃疡延伸超过2厘米。

2.4。病理观察

将石蜡嵌入和福尔马林固定的结肠样品切成4-μ.米厚的部分，用于染色和病理观察。

2.5。PPAR.γ.，nf-κ..b，和tnf-α.mRNA表达

根据制造商的方案（Invitrogen）和逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）根据Takara RNA PCR Kit3.0（AMV）的说明，从结肠组织样品中从结肠组织样品中提取mRNA。使用针对每个基因特异的引物扩增每个样品的等量cDNA（表1）。在下列条件下使用热循环仪进行DNA扩增：用于PPARγ.，35循环在94℃下为30秒，在60℃下退火60秒，并在72℃下延伸60秒;对于NF-κ..B P65，35循环在94℃下的变性30秒，在59℃下退火30秒，并在72℃下延伸60秒;对于TNF-α.，35循环在94℃下为45s，在54℃下退火30秒，72℃的延伸60秒;为了β-Actin，35循环在94℃下为30秒，在62℃下退火30秒，72℃的延伸60秒。通过在琼脂糖凝胶电泳和溴化乙锭染色之后使用凝胶图像分析系统测量RT-PCR产物。

2.6。测量PPARγ.，nf-κ..b，和tnf-α.蛋白质表达

免疫组化根据Max Vision Kit议定书完成。图像分析软件（Image-Pro Plus 6.0）用于测量3,3'-二氨基苯并（DAB）染色后细胞质是棕褐色或棕色的阳性对照细胞的光密度。对于每个部分，在高功率显微镜（×400）下观察到阳性集成光学密度（IOD）和五个代表性视野的总面积。IOD和总面积的比例代表光密度的平均值，具有更高的比例，指示较高水平的蛋白质表达。

2.7。统计分析

数据显示正常分布，并表示为手段标准偏差。使用单向ANOVA分析不同实验组的反应。Spearman相关分析用于研究PPAR之间的关系γ.，nf-κ..b，和tnf-α.．被认为是统计学意义的。所有统计分析都是使用SPSS 19.0进行窗户进行的。

结果

3.1。傣族和CMDI的结果

UC模型组的DAI和CMDI显着高于对照组（）在所有的时间点。Rosiglitazone治疗组的DAI和CMDI在第14,21,21,21和35天显着减少，而不是UC模型组（；桌子2）。

3.2。轻微显微镜下的病理变化（他染色）

如图所示1，在对照组中完整结肠粘膜结构。在第14天的模型组的Lamina Propria中炎症中性粒细胞和淋巴细胞的渗透可以看到粘膜和粘膜缺陷。第14天在Rosiglitazone治疗组中缓解的粘膜炎症程度。再生上皮细胞覆盖了溃疡表面和粘膜倾向于完成。溃疡的碱填充有组织和疤痕。

3.3。RT-PCR的结果

在对照组中，PPAR的表达γ.与UC模型组相比，结肠粘膜中的mRNA显着更高（）但是nf-κ..b和tnf-α.表达明显较低（）。在Rosiglitazone治疗组，PPARγ.mRNA表达明显大于模型组在第7,14,21,21和35天（）但是nf-κ..b和tnf-α.表达显着减少（） （桌子3.）。

3.4。免疫组织化学的结果

在对照组中，PPAR的表达γ.UC模型组大鼠结肠黏膜蛋白含量显著高于UC模型组(）但是nf-κ..b和tnf-α.表达明显较低（）。在Rosiglitazone治疗组，PPARγ.蛋白质表达在第7,14,21,21天（）但是nf-κ..b和tnf-α.表达显着减少（） （桌子4.；数据2那3.和4.）。

3.5。PPAR的相关性γ.，nf-κ..b，和tnf-α.罗格列酮治疗组蛋白表达

相关性研究表明PPAR的表达γ.蛋白质与NF-的显着呈负相关κ..B蛋白质。相关因子为-0.881（）。

nf-κ..B蛋白表达与TNF-呈显著正相关α.．相关因子为0.943（）。

4。讨论

UC是肠道Crassum的慢性炎症状况，即病因仍然未知。细胞因子是在UC的活性和慢性阶段进行的炎症途径的关键组分。UC可能源于放肠粘膜免疫和促炎和抗炎细胞因子的微妙平衡分解结果。

NF -κ..B是许多参与肠道免疫和炎症反应的基因诱导表达的关键调节剂。NF -κ..B可以激活抗凋亡基因并抑制一些炎症细胞的凋亡，从而伸长和恶化的组织炎症损伤[2］．TNF-α.是一种重要的促炎细胞因子，参与全身炎症反应并刺激急性期反应。TNF-调控的改变α.与UC相关的各种症状有关炎症、厌食和体重减轻都与TNF-水平升高有关α.表达 [4.］．我们的结果表明，NF-的结肠粘膜表达κ..b和tnf-α.在UC模型组中显着高于对照组。我们证实，两种因素涉及在UC的发病机制中产生结肠粘膜炎症和溃疡。

PPAR.γ.主要在脂肪组织，肠和巨噬细胞中检测到。越来越多的证据表明PPARγ.在抑制炎症中发挥作用。PPAR的表达受损γ.据报道，在UC中的结肠上皮细胞和CROHN疾病（CD）中的肥大肠系膜脂肪组织增加[9.］．降低了PPAR的基因表达γ.在活动性UC患者的直肠活检中发现，其表达与内镜疾病活动的严重程度呈负相关[10.］．

我们的结果表明，PPAR的结肠粘膜表达γ.与UC模型组相比，对照组明显高于MRNA水平或蛋白质水平。证据表明PPARγ.在UC过程中起着重要的保护作用。PPAR的分子机制γ.调节炎症反应不完全明白。PPAR.γ.已被认为是通过减弱NF-κ..B活动[9.］．ricote等人。证明了PPAR.γ.通过拮抗AP-1，信号换能器和转录激活剂（Stat）和NF-通过拮抗InOS和MMP-9表达。κ..B通路(11.］．在最近的一篇论文中，表明，类似于PPAR的报告α., PPARγ.抑制NF -κ..B驱动的转录通过与P65和P50进行物理相互作用[12.］．

噻唑烷二酮（TZDS）的抗糖尿病药物是配体γ.PPARs亚型。以往的体外、体内和非对照人体研究表明PPAR具有潜在的抗炎作用γ.包括结肠tzd在内的配体[5.］．Pedersen和Brynskov发现罗格列酮(TZDs的一种)灌肠可改善受损的PPARγ.发炎结肠上皮的活性对活性溃疡性结肠炎患者具有有益的临床疗效[13.］．本研究结果显示，罗格列酮治疗组在第14、21、35天的DAI和CMDI较UC模型组明显降低，PPAR也较UC模型组明显降低γ.表达在第7,14,21,21和35天显着增加，但NF-κ..b和tnf-α.表达显著减少。我们证实罗格列酮可以通过改善结肠黏膜PPAR的表达来缓解UC症状以及黏膜炎症和溃疡γ.．

此外，我们使用Spearman相关分析来研究PPAR之间的关系γ.，nf-κ..b，和tnf-α.罗格列酮治疗组蛋白表达。相关研究表明，PPARγ.表达与NF-呈负相关κ..b . NF -κ..B蛋白表达与TNF-呈显著正相关α.．结果提示PPAR活性受损或表达减少γ.在UC结肠粘膜中被剥夺了NF-的抑制能力κ..B，导致了NF的高表达κ..b从细胞质形式转移到核，然后上调促炎因子的表达，例如TNF-α.．

总之，罗格列酮可以缓解结肠粘膜炎症反应，并通过上调PPAR具有对UC的保护作用γ.NF-在结肠中的表达与下调κ..b和tnf-α.表达式。

作者的贡献

茅于轼和唐汉铨对这部著作贡献相当。

致谢

作者感谢万景邹和龚俊王为掌握免疫组化的帮助。他们还感谢大连医科大学的SPF实验室动物中心。这项工作得到了大连医科大学第一家附属医院的补助金。

参考

1. S. K. Hegazy和M. el-batewy，“益生菌对促炎细胞因子和NF-的影响κ..溃疡性结肠炎中的B激活世界胃肠学杂志，第16卷，第5期。33, pp. 4145-4151, 2010。查看在：出版商网站|谷歌学术搜索
2. M.T.Bengoechea-Alonso，B.Pelacho，J.A.Osés-Prieto，E. Santiago，N.López-Moratalla，以及M.J.López-Zabalza，“NF-的监管”κ..B通过蛋白质磷酸酶2b和NO，通过蛋白激酶A活性，在人单核细胞中，“一氧化氮，第8卷，第2期1，页65-74,2003。查看在：出版商网站|谷歌学术搜索
3. R. M. Locksley，N. Killeen和M. J.Lenardo，“TNF和TNF受体超级美食：整合哺乳动物生物学”细胞，第104卷，第104号4，页487 - 501,2001。查看在：出版商网站|谷歌学术搜索
4. L. R.Ferguson，C.Huebner，I. Petermann等，“肿瘤坏死因子-α基因的单核苷酸多态性影响炎症性肠病风险”世界胃肠学杂志，卷。14，不。29，pp。4652-4661,2008。查看在：出版商网站|谷歌学术搜索
5. L. Dubuquoy, C. Rousseaux, X. Thuru et al.，“PPARγ.作为炎性肠病疾病的新治疗靶标，“肠道，卷。55，不。9，PP。1341-1349,2006。查看在：出版商网站|谷歌学术搜索
6. C. G. Su，X. Wen，S.T.Bailey等，“具有PPAR的结肠炎的新疗法 -γ.配体抑制上皮炎症反应，“临床研究杂志，第104卷，第104号4，pp。383-389,1999。查看在：谷歌学术搜索
7. S. N. Porter，G. S. Howarth和R. N. Butler，源自牛乳清的口头给药的生长因子提取物抑制了菌落大鼠的呼吸乙烷，“斯堪的纳维亚胃肠学杂志，卷。33，不。9，pp。967-974,1998。查看在：出版商网站|谷歌学术搜索
8. L. A. Dieleman，M.J.H.J.Palmen，H.Akol等，“葡聚糖硫酸钠钠（DSS）诱导的慢性实验性结肠炎的特征在于Th1和Th2细胞因子，”临床和实验免疫学，卷。114，没有。3，pp。385-391,998。查看在：出版商网站|谷歌学术搜索
9. L. Dubuquoy，E.Åjansson，S. Deeb等，“过氧化物酶体增殖物激活受体的表达受损”γ.在溃疡性结肠炎中，“胃肠病学，卷。124，没有。5，pp。1265-1276，2003。查看在：出版商网站|谷歌学术搜索
10. J. K. Yamamoto-Furusho，A.Peñaloza-Coronel，F.Sánchez-muñoz，R.Barreto-Zuñiga，A. Dominguez-Lopez，“过氧化物组织增殖物激活的受体-γ（PPAR-γ.）表达在活性溃疡性结肠炎的患者中下调，“炎症性肠病疾病，第十七卷，第二期2, pp. 680-681, 2011。查看在：出版商网站|谷歌学术搜索
11. M. C.IC.I.LI，T.M.Wayson，C.J.Kelly和C.K.玻璃，“过氧化物酶体增殖物激活的受体 -γ.是巨噬细胞激活的负调节因子，“自然第391期1998年。查看在：出版商网站|谷歌学术搜索
12. S.W.Chung，B. Y.Kang，S.Seung Hyun Kim等人，“氧化低密度脂蛋白抑制了通过过氧化物体增殖物激活的受体之间的直接相互作用在脂多二二二二二乘糖激活的小鼠巨噬细胞中抑制白细胞介素-12的产生。γ.和核因子 -κ..B。”生物化学杂志，卷。275，没有。42，pp。32681-32687，2000。查看在：谷歌学术搜索
13. G. Pedersen和J. Brynskov，“局部罗格列酮治疗通过恢复过氧化物酶体增殖物激活的受体来改善溃疡性结肠炎γ.活动”,美国胃肠病学杂志，卷。105，没有。7，PP。1595-1603,2010。查看在：出版商网站|谷歌学术搜索

版权

版权所有©2012 Jing-Wei Mao等。这是分布下的开放式访问文章创意公共归因许可证，允许在任何媒介上不受限制地使用、传播和复制，但必须正确引用原作。