是ERCP术后胰腺炎遗传易感并发症？

抽象

背景/目标。胰腺炎仍然是ERCP最常见的并发症。ercp后胰腺炎的历史是新发胰腺炎的独立危险因素，提示遗传背景。丝氨酸蛋白酶抑制剂Kazal type 1 (SPINK 1)基因N34S突变可能下调胰腺炎发生的阈值。本研究的目的是评估这种突变在ercp后胰腺炎患者中的存在。方法。期间的四年中，30例ERCP术后胰腺炎进入研究。患者和程序数据的收集，重点危险因素胰腺炎。采集血样用于N34S突变的SPINK 1个基因存在遗传测试。DNA提取后，我们使用等位基因特异性聚合酶链反应作为N34S突变的初始筛选方法，并且为了确认结果，并确定杂合子和纯合子基因型状态，我们使用限制性片段长度多态性（RFLP） 方法。结果。30个病人中没有一个被发现携带N34S突变，与两种应用的方法。患者有两种已知危险因素的平均值。结论。SPINK1 N34S突变似乎在ercp后胰腺炎中没有作用，但需要更大规模的研究来证实我们的结果。

1.介绍

胰腺炎仍然是ERCP最常见的并发症，据报道发生率为2% - 9% [1]。虽然80%的病例是轻微的，但相当数量的患者可能发展为严重的胰腺炎，这意味着额外的发病率和死亡风险。尽管有新的诊断工具的发展，ERCP仍然是一个广泛使用的程序，所以ERCP后胰腺炎是一个具有重大影响的问题。

到目前为止，只有在高危患者中使用胰支架才成为降低ercp后胰腺炎风险的一种被广泛接受的做法[2]。然而，这项技术成本高昂，并不能广泛应用，所以谁是高危患者的问题仍然很清楚。

一些研究和荟萃分析帮助我们认识到，把一个人在高风险ERCP术后胰腺炎的发展特殊因素[3.- - - - - -10]。在这些因素中特别感兴趣的礼物后ERCP的历史胰腺炎作为ERCP术后胰腺炎的新一集的独立危险因素。看来，有些人在这个特殊的复杂遗传易感易感性。

遗传因素，如阳离子胰蛋白酶原和CFTR基因的突变，在某些类型的慢性胰腺炎的发展中起着因果作用[11]。突变在另一种基因，其编码的丝氨酸蛋白酶抑制剂的Kazal型1（SPINK 1），已发现作用互补其他遗传或环境因素引起胰腺炎12- - - - - -14]。

本研究的目的是研究SPINK 1基因突变在ercp后胰腺炎发生过程中的可能作用，并与一般人群进行比较，检查这些突变在这一特定组患者中的发生率。

2.患者和方法

为了这个目的，研究在两个高量的中心（超过200 ERCPs /每个Y）中的溶液进行的。2005年和2008年的岁之间，每个“ERCP案”的数据，以根据标准协议收集。患者数据，包括人口，既往史和程序的指示，在ERCP前收集。程序的数据，包括在插管困难（在乳头尝试次数），使用预切割的，胰管导管及混浊，检测，括约肌切开术的结果，以及所有其它治疗操纵在该过程的时间被记录下来。All patients were followed up at least for 24 hours to monitor the development of complications after ERCP. Patients that developed post-ERCP pancreatitis, according to the widely accepted criteria (new onset of pancreatic-type abdominal pain, lasting at least for 24 hours, associated with a 3-fold increase in serum amylase in the same period) entered the study, after an inform consent was obtained. Exclusion criteria from the study were the presence of chronic pancreatitis and the refusal of consent. From the patients that entered, the study blood samples were collected for genetic analysis of SPINK1 gene. Patients were monitored during their hospitalization, and severity of pancreatitis was classified according to the consensus criteria [15]。

3.突变分析

使用全血DNA分离试剂盒(Qiagen GmbH, Germany)按照已建立的方法从外周血白细胞中提取基因组DNA。用紫外可见分光光度计测定DNA溶液浓度。为了确定N34S SPINK1突变可能是ercp后胰腺炎的危险因素，我们采用以下方法。根据先前的报道，我们使用等位基因特异性聚合酶链反应作为N34S突变的初步筛选方法[16]。为了确认结果并确定等位和纯合性基因型状态，我们采用了前面所述的限制性片段长度多态性(RFLP)方法，稍作修改[17]。

3.1。Allele-Specific PCR

简单地说，200 ng的基因组DNA相当于50 ngμL反应，含67 mM三- hcl (pH 8.8)， 16 mM (NH)₄)₂所以₄， 0.01% Tween-20, 2mm MgCl₂,250年μM dNTPs, 3.0 U Taq DNA聚合酶(Bioron International, Germany)，正义、反义、突变引物100 ng(见表)1)。以上PCR反应采用以下循环条件:94℃变性5分钟，94℃变性30秒，59℃变性30秒，72℃变性30秒，35个循环，72℃延伸5分钟。PCR产物在2%琼脂糖凝胶上电泳，溴化乙稀染色以获得紫外可见。当存在N34S突变时，该等位基因特异性PCR产生两个片段(285 bp和195 bp)，野生型产生一个285 bp的片段。数字1概述用等位基因特异性PCR获得的结果。

3.2。RFLP分析

我们用于RFLP分析的引物设计（通过Threadgold等人）到SPINK1基因的外显子3放大，基于公开的核苷酸序列（GenBank，NM-003122）。这些引物（见表1）引入一个PstⅠ位在携带N34S变体序列内切酶限制性位点，和一个内切核酸酶BsrDI在野生型序列的限制性位点。聚合酶链反应在一50执行 μL反应体积，使用100ng基因组DNA模板，0.5 U Pfu DNA聚合酶(Promega，德国)，2mm MgCl₂,200年μM dNTPs (Fermentas Life Sciences, Lithuania), and 10 pmol of each primer. The cycling conditions we used for the RFLP method were as follows: an initial denaturation step at 94°C for 5 minutes, followed by 35 cycles at 94°C for 30 seconds, 60°C for 30 seconds, and 72°C for 1 minute. Then, the PCR products were digested with restriction endonucleases PstI and BsrDI. Twenty microliters of the PCR product was added to 10 U PstI (Fermentas Life Sciences, Lithuania), 1x digest buffer (Fermentas Life Sciences, Lithuania), and 1x bovine serum albumin (BSA) (Fermentas Life Sciences, Lithuania) to a final volume of 50 μ在37℃下孵育1小时。BsrDI消化在50分完成μL反应，包括20μL PCR product, 10 U BsrDI (Fermentas Life Sciences, Lithuania), 1x digest buffer (Fermentas Life Sciences, Lithuania) and 1x bovine serum albumin (BSA) (Fermentas Life Sciences, Lithuania) and incubation at 55°C for one hour. Heat inactivation of the digestion reaction was performed for both digestions at 80°C for 15 minutes. The digestion products analysed by agarose gel electrophoresis using a 3% (w/v) precast agarose gels (Biorad Laboratories Inc., USA), 1X TAE buffer, and 0.5 mg/ml ethidium bromide. The undigested PCR products were 0320 bp in length. After digestion with PstI restriction endonuclease, a product of 286 bp obtained from mutant sequences. After digestion with BsrDI, a product of 286 bp obtained from wild-type sequences. Heterozygote samples produced both products of 320 bp and 286 bp after digestion with either endonuclease. To validate the RFLP analysis further, the BsrDI digestions was performed alternatively at 37°C overnight. The results obtained were identical in both experiments. An overview of results obtained with the RFLP methods are provided by Figure2。

4.结果

从2005年到2008年，1162名患者接受了1247次手术，主要是为了治疗。34例(2.7%)发生胰腺炎。从这些人中，最终有30名患者进入研究。在剩下的4人中，1人患有慢性胰腺炎，3人拒绝同意。30例患者中，21例(70%)为女性，9例(30%)为男性，平均年龄63岁(STDEV 13)。根据Cotton标准对胰腺炎进行分类[15], as mild in 17 patients (57%), moderate in 10 patients (33%), and severe in 3 patients (10%). We did not detect the N34S mutation among our study group with both methods of, allele-specific PCR and RLFP. Patients had an average of 2 risk factors/per pt. None of the patients in our group fulfilled the criteria of SOD, and we did not have patients with prior history of post-ERCP pancreatitis. The distribution of the remaining risk factors is presented in Table2。平均数的导丝穿过进入胰管是2,47（STDEV 3,46）。

5.讨论

SPINK 1是一个6,5 KDa的蛋白质，由79个氨基酸组成，包括一个23个氨基酸的信号肽。它在胰腺腺泡细胞中合成，其核心作用是保护胰腺免受过早激活的胰蛋白酶的伤害。据估计，SPINK 1能够抑制胰腺内高达20%的胰蛋白酶，但SPINK/胰蛋白酶比率可能会因腺体炎症状态而变化。SPINK 1蛋白编码自5号染色体上的一个基因，大约7.5 Kb长，包含4个外显子。N34S突变，由c引起。101A > G transition in exon 3, was firstly reported by Chen et al. in 2000 [12]。然而，N34S突变和胰腺炎之间的关系有两种随后的研究变得十分明显。最初Witt等人。发现该突变用“特发性”慢性胰腺炎的强缔，并且它们进一步推测，这些突变导致该疾病以常染色体隐性方式[13]。然而，Pfutzer等人在另一项重大研究中指出，这些突变也存在于约2%的健康人群中，它们不是自身引起疾病，而是通过降低其他遗传或环境因素导致的胰腺炎的阈值来改变疾病[14]。世界各地的一些研究已经证实SPINK 1突变和特发性慢性胰腺炎之间的关联，并因此其他小组调查这些突变在其它类型的慢性胰腺炎的作用。所以SPINK发现1个突变为与热带胰腺炎和在较小程度上与酒精慢性胰腺炎相关联18- - - - - -25]。此外，最近的一项研究显示，这些突变可能在急性胰腺炎的反复发作中起作用[26]。

ercp后胰腺炎是一种急性胰腺炎，与任何其他类型的急性胰腺炎具有相同的病理生理特征。正如我们所知，ercp后胰腺炎的历史使患者处于ercp后新发胰腺炎的高风险，独立于其他已知因素。这意味着在这种并发症中，有些人可能具有遗传易感性。如前所述，N34S突变可能与另一个因素起互补作用，如ERCP期间对腺体的刺激导致胰腺炎的发展。Lempinen等发现ercp后胰腺炎患者的SPINK 1水平明显高于非胰腺炎患者，这是炎症诱导酶的合成和分泌的结果[27]。SPINK1基因突变可能下调酶的保护作用，以对抗ERCP操作对腺体造成的刺激。

尽管采用了这种合乎逻辑的方法，我们的研究并没有揭示ercp后胰腺炎患者中这种特殊的突变。相比之下，患者只有两种已知危险因素的平均值。本研究的局限性在于体积小，缺乏大量ercp后胰腺炎的病例。此外，关于我国SPINK1突变发生率的数据缺乏，也许我们的种族来源代表了这些突变负担较低的人口。然而，有些人比其他人更容易受到感染，而不受其他危险因素的影响，这一事实强烈暗示了未知遗传因素的作用。需要进行大型多中心研究来评估这一假设，检查SPINK 1或其他相关基因中是否存在这种或其他突变，以提取更安全的结果。

结论根据我们的数据，我们还没有得到N34S SPINK 1突变在ercp后胰腺炎中发挥作用的任何线索，但需要进一步的研究来证实我们的结果。

利益冲突

作者声明，本协议不存在利益冲突。

致谢

提交人要感谢他们对这项研究的免疫学教授George Kyriazis、他的同事Hosam Abu Uda先生和Olga Christopolou夫人以及最后对George Tatsios教授的支持。

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