抗血管内皮生长因子的影响在剖腹大鼠粘连形成的发展：实验研究

抽象

目标本研究确定了单剂量贝伐珠单抗对大鼠盲肠磨损模型黏附形成的影响。贝伐珠单抗是一种专门针对血管内皮生长因子(VEGF)的抗血管生成重组单克隆抗体。方法。Thirty female Wistar albino rats (200–224 g) were divided into three groups. All rats underwent laparotomy at which time cecal wall abrasion and abdominal wall injuries were induced. Group I (control) underwent only the abrasion procedure; Groups II and III received saline or bevacizumab intraperitoneally, respectively, following the abrasion. The rats were killed on postoperative day 7, and the severity of adhesions was evaluated, together with histopathological fibrosis parameters and immunohistochemical staining to identify the VEGF receptor.结果。各组粘连严重程度的平均评分为,和分别;III组的评分明显低于I组(）和II（)。在组织病理学评估，平均纤维化评分在第三组是显著比分数在组I（）和II（)。III组粘附区VEGF染色明显低于I组(）和II（)。结论。贝伐单抗减少粘连形成通过阻断VEGF受体占有率以下大鼠剖腹手术。

1.简介

术后粘连形成是腹部手术患者的一个重要临床问题[1,2]。腹膜粘连是指发生在腹膜腔内任何表面之间的病理性纤维带[2]。这些粘连可由感染、炎症、缺血和手术损伤引起，是骨盆疼痛、不孕和肠梗阻的主要原因。形成粘连倾向的机制及其位点特异性尚不清楚[2- - - - - -4]。腹腔内粘连被认为开发局部缺血和外伤的肠或腹膜[浆膜表面的结果4- - - - - -6]。腹膜损伤后，血管通透性在血管供应受损区域增加;这之后是炎性细胞的渗出，最终导致形成纤维蛋白基质的，连接两个受伤腹膜表面形成血纤维蛋白条带[6,7]。

纤维蛋白条带形成后，纤维蛋白溶解将条带分解成更小的分子，作为纤维蛋白降解产物[7,8]。如果纤维蛋白溶解系统受到抑制，粘连不能完全溶解，纤维蛋白条带就会持续存在[8]。形成粘连的组织是巨噬细胞、红细胞、成纤维细胞、神经纤维和内皮细胞的小血管通道的混合物。巨噬细胞在这种情况下发挥着重要作用，它们合成并释放生长因子，而生长因子具有有丝分裂、趋化和血管生成作用[1,9]。

血管生成，开发新血管的过程，就是炎症和创伤修复的基本过程。血管生成是由位于细胞外基质，其作为因素的贮存器可在创伤后或其它生理条件下被释放调节因子导通或截止[10]。人的腹膜毛细血管和小动脉内皮细胞表达血管内皮生长因子(VEGF)和血管生成因子，调节蛋白水解酶及其抑制剂。

由于VEGF在凝血，纤溶和血管生成活动的关键作用，它被认为是腹膜粘连的发展的关键因子[1,10,11]。我们假设血管生成抑制剂贝伐珠单抗可以通过增加VEGF水平减少腹膜粘连，并研究了贝伐珠单抗对腹膜粘连的影响。

2。材料和方法

2.1。协议

这项研究是在大学的Firat，医药，埃拉泽，土耳其系的实验动物饲养和研究实验室进行的，当地伦理委员会的批准后。所有实验操作均符合健康指南的实验室动物的护理和使用的国家机构。

2.2。动物

Thirty female Wistar albino rats (11–12 weeks of age, weighing 200–224 g) were acclimatized for 1 week before the experiments. The animals were kept in individual cages, housed at constant room temperature, and given standard rat chow. Only water was provided in the 12 h preceding the experiments.

2.3。实验组

大鼠采用随机分配的软件版本随机区组随机分为三组。1.00。研究人员被蒙蔽的治疗，盐水和对照组。在I组（对照组），仅磨损进行。在第II组，进行磨损和0.9％NaCl的腹腔内给药。我n Group III, abrasion was performed and 2.5 mg/kg bevacizumab (Avastin, 25 mg/mL, Roche, Basel, Switzerland) was administered intraperitoneally.

2.4。实验设计

All rats were anesthetized with a combination of 5 mg/kg intramuscular xylazine (Bayer, Istanbul, Turkey) and 30 mg/kg ketamine hydrochloride (Parke-Davis, Istanbul, Turkey). All animals breathed spontaneously throughout the procedures. The mid-abdominal area was shaved and prepared with povidone-iodine as antiseptic. A 3 cm midline incision was made and the cecum was exteriorized. A 1-2 cm²盲肠部位用纱布绷带刷8到10次，然后再刷1厘米²在右侧腹壁相对的盲肠腹膜损伤也通过刷涂生产。腹部切口用连续3-0丝线缝合。只有水给所有术后第一天的动物;标准大鼠饲料和水，提供在随后几天。

在术后第7天，如前所述，对大鼠进行麻醉，并对前腹壁进行再次剖腹手术，将前腹壁向后缩至u形切口，以提供最大的暴露，而不损伤擦伤部位。

2.5。附着力评估和附着力严重度评分

评估各器官与腹壁之间以及各器官之间的粘连。两名对该研究不知情的外科医生(不是外科团队的成员)分别对粘连进行评分，并对每只大鼠进行一致评分。粘连类型按Evans等方法评分[12]，其中0级为无粘连，I级为粘连自发分离，II级为粘连牵引分离，III级为粘连快速剥离分离(表)1,数据1(一)- - - - - -1 (d))。

2.6。纤维化评分

粘连用的密合性的表面去除，并且所切除的粘附标本固定在甲醛。脱水后，用石蜡包埋。的n, 5 mm cross-sections were prepared, stained with hematoxylin and eosin (H&E), and evaluated under a light microscope at a magnification of ×100. The adhesions were categorized as histopathological Grades 0–III based on the presence and extent of fibrosis [1,4- - - - - -6]。所有的评估都是由一位经验丰富的病理学家进行的，他对各组都是盲的。级0被定义为无纤维化，I级为轻微纤维化，II级作为中间纤维化和III级为严重纤维化（表2)。

2.7。免疫组织化学（IHC）染色程序

粘连用的粘接面切除。的粘附组织放置在10％甲醛两种VEGF（Neomarkers公司，准备使用; Neomarkers公司公司，弗里蒙特，CA，USA）受体水平测量和IHC分析。在固定几个小时后，活检标本石蜡包埋，和5 μ将m片切下，置于显微镜载玻片上。组织用IHC染色来鉴定VEGF受体。所有的评估都是由一位经验丰富的病理学家进行的，他对各组都是盲的。在粘附组织中发现染色细胞的区域评估VEGF抗体IHC染色的严重程度和密度。0:未染色(阴性)，1 =怀疑，2:轻度，3:中度，4:强阳性(图)2(一个)- - - - - -图2（d）)[9]。

2.8。主要和次要端点

本实验研究的主要终点是宏观黏附评分，即黏附严重程度评分的总和。次要终点是显微镜fi纤维化分级，从粘合模型区域提取。

2.9。统计分析

采用SPSS 17.0的Windows（SPSS公司，Chicago，IL，USA）分析数据。百分比与学生进行比较t-检验，非参数值采用皮尔逊卡方检验。的P所给的值是双面的;被认为是意义的极限。

3.结果

总共30只大鼠进行操作。有没有伤口裂开;在第二组2，一个在第三组：三只动物开发的腹壁切口疝。

3.1。粘连严重程度评分

统计学比较显示，贝伐珠单抗组(III组)与I组(）和II（），而组I和II之间没有观察到差异（)。三组和统计分析的附着力得分列于表3.。各组间的统计学差异也见图3.。

3.2。组织病理学纤维化评分

纤维化评分Ⅲ族较显著少在组I（）和II（)，而纤维化评分在I组和II组间无显著差异()。纤维化评分及统计分析见表4。各组间的统计学差异也见图4。

3.3。免疫组化染色VEGF

该VEGF染色Ⅲ族粘合区域的是显著低于在组I（）和II（)，而I、II组间差异无统计学意义()。VEGF染色评分及统计分析见表5。各组间的统计学差异也见图5。

4。讨论

腹部和盆腔粘连是发病的主要原因，导致腹部和盆腔疼痛、不孕症和小肠梗阻。它们造成了30-41%的肠道阻塞[13]。此外，导致输卵管机械堵塞盆腔粘连是不育的重要原因[14,15]。尽管技术的进步，术后腹膜粘连继续构成显著的问题，并保持沮丧的来源谁经历了剖腹手术的患者[16]。

各种模型已经发展到实验诱导术后腹膜粘连，包括本地腹膜切除，局部缺血性损伤，引入异物进入腹膜腔，热损伤，以及细菌污染[4]。开腹手术中任何手或手术器械操作均构成机械创伤，是术后腹膜粘连最常见的原因[4,5]。我们使用盲肠磨损模型因为它模拟了在剖腹手术中发生的机械损伤。

腹膜粘连是伤口正常愈合的结果，术后腹膜粘连最常见于术后7 ~ 15天。四项类似的，先前发表的研究使用了针对VEGF的物种特异性抗体;在这些研究中，试验周期(再剖开)限制为7天和30天[1,3.,9]。我们的研究是与人源化抗体进行，在一个物种，其中大量的文献表明，在老鼠和人类贝伐单抗效果相似。我们的随访期为7天，和粘合成熟过程可以通过再吸收循环贝伐单抗，因为它保持在循环中不超过6周[受到影响1]。

对有效的防粘连装置的研究已经持续了几十年。多种方法、材料和药物已被评估其防止腹腔内腹膜粘连的能力，包括各种外科手术、微创和腹腔镜技术、针对纤维蛋白形成的药物以及液体、凝胶和固体，这些物质可以在间皮表面之间形成机械屏障[3.- - - - - -6]。

许多动物和临床研究已经测试了多种制剂，以防止腹腔内粘连的形成。这些药物包括葡聚糖、蜂蜜、白藜芦醇、透明质酸皮质类固醇、生理盐水、重组组织纤溶酶原激活剂、抑肽酶、阿托伐他汀、奥曲肽、肝素、非甾体类炎症药物、替诺昔康、丝裂霉素、西地那非、维生素E、褪黑素和β葡聚糖(1,3.- - - - - -7]。的附着防止障碍，如由透明质酸钠，聚乙二醇，纤维蛋白密封剂，氧化再生纤维素，膨体聚四氟乙烯，和羧甲基纤维素的可生物再吸收膜腹内施用，可以减少术后粘连，通过一些动物模型和临床研究[如证明1,4- - - - - -6]。其中一些药物已被证明可以减少粘连的数量和质量，但没有一种是普遍有效的，它们的作用方式还不为人所知[8,17]。

本研究调查贝伐单抗，抗VEGF的单克隆抗体的效果，在防止腹膜粘连。粘连采用Evans等人的方法进行分级。[12]。腹膜粘连的强度与对照相比，和0.9％NaCl组（在贝伐单抗组显着减少)。

腹腔内粘连形成是一个复杂的过程，涉及到多种因素，包括血细胞和基质成分和血管生成的增殖。从理论上讲，血管生成应在腹腔内粘连的发展具有重要的作用，因为早期的新生血管形成的相关因素与粘连形成的程度。

间皮和血管内皮细胞中的腹膜的血管，这提供腹膜粘连，表达VEGF和成纤维细胞生长因子-2（FGF-2），这表明这些细胞因子在期间粘连形成介导的血管生成腹膜作用[9]。

人的腹膜毛细血管和动脉内皮细胞表达VEGF和其他血管生成因子，这些因子可能调节蛋白水解酶及其抑制剂。VEGF是腹膜粘连的关键细胞因子，在血管生成的诱导中起重要作用;它也是一种内皮细胞特异性有丝分裂原[10,18- - - - - -20.]。

VEGF是一种强有力的血管生成细胞因子，参与粘连的形成;也许它的作用是诱导新血管的发展，为手术引起的组织损伤供给区[21]。它还直接参与组织修复，包括早期炎症反应和通过成纤维细胞功能的创伤修复和重塑[22]。VEGF在促进所需的随后的细胞迁移和增殖的富含纤维蛋白的基质沉积的中心作用似乎使其在腹膜粘连的形成的关键剂〔22]。卡希尔等人[23]表明，它是在术后粘连形成的早期发病机制集中参与和肥大细胞似乎是负责的操作后早期浪涌腹膜VEGF水平。

贝伐珠单抗是一种重组人源化单克隆抗体，可结合VEGF的所有生物活性亚型，并抑制该细胞因子与其受体VEGFR-1和-2的结合[24- - - - - -27]。它中和了VEGF的生物学作用，包括内皮细胞有丝分裂形成，血管通透性增强，促进血管生成。在小鼠模型中，抗vegf抗体被证明可以阻止人类肿瘤异种移植的生长，并减少转移瘤的大小和数量[18,28]。

VEGF似乎在早期形成腹腔术后粘连的重要作用。它被释放到腹腔手术后，受伤的血管。贝伐单抗中和VEGF并阻断其信号转导通过两个VEGFR-1和VEGFR-2，由VEGF诱导的细胞增殖的抑制和腹膜粘连的中和抗体[调制所证明29,30.]。在肿瘤进程的治疗选择性，抗血管生成抑制剂的作用可以被扩展为包括非附着策略[29]。

在我们的模型中，使用贝伐珠单抗后，在切除的粘连表面和纤维蛋白组织中，VEGF受体水平和血管生成下降，这在组织病理学检查中显示。贝伐珠单抗的应用减少了血管生成，这可能与粘附形成的减少有关。贝伐珠单抗减少了损伤组织中的VEGF受体计数。因此，贝伐珠单抗通过结合和阻断VEGF受体降低了粘连的形成。这一结果可能为该药物在高危患者剖腹手术后防止粘连形成提供了新的应用前景。

我们的结论是贝伐珠单抗实验性地防止了术后粘连的形成。然而，还需要更多的研究和临床试验来调查和验证它的长期效果，并建立一个安全的使用方案。

缩写

VEGF:	血管内皮生长因子
FGF-2:	成纤维细胞生长因子2。

作者的贡献

M.巴什布，N. Bulbuller，R. Ayten和C. Camci执行的外科手术。S.布卢特，M.巴什布和Z Arikanoglu促成写文学的纸和审查，以及进行全面的文献检索。I. H. Ozercan provied的病理信息。

利益冲突

作者声明，他们没有利益冲突。

致谢

作者感谢巴肯特大学家庭医学部的Ergun Oksuz提供的统计分析。这项实验研究作为海报出现在国际外科医生、胃肠病学家和肿瘤学家协会第18届国际研究生课程(肝胃肠病学，2008年10月;55 (Suppl1): A386 P454)。

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