搓澡的基因分型幽门螺杆菌从粪便DNA

摘要

幽门螺杆菌感染通常发生在儿童早期，是导致营养不良、胃炎、消化性溃疡病和胃癌的全球性原因。本研究检验了使用的可行性H、 幽门作为非侵入性流行病学研究的DNA来源。H、 幽门DNA进行化学回收，并使用生物素化特定寡核苷酸探针与来自28磁性捕获分离H、 幽门在接受医院调查的儿童粪便样本呈阳性H、 幽门感染，与家庭成员一起。多态DNA（RAPD）随机扩增随后用于区别各分离物。选择的粪便样品93％分型。父母，子女和兄弟姐妹的样品进行了比较和相似性决定的。系统发育分析表明，H、 幽门从粪便中获得的DNA可用于个体菌株的基因型，为研究这种微生物的家族内转移提供了手段。

1.介绍

地方性革兰氏阴性菌幽门螺杆菌世界上多达一半的人都在胃粘膜上定居[1]。虽然在许多情况下，它导致非特异性消化不良症状或根本没有，但它是公认的H、 幽门是十二指肠溃疡病的主要病因，并最终导致胃癌的发展[2]。全基因组的知识H、 幽门[3]使分离和基因型成为可能H、 幽门用于研究其分布和传播的殖民个体的DNA [4]。

虽然有很多基因分型方法，但一般都是在胃镜下活检或抽吸的胃DNA样本上进行。这些方法可用于确定传播途径和风险因素[4]，但抽样的侵入性的方法不适用于涉及幼童[流行病学研究五]。基因分型H、 幽门从粪便样本中获得的DNA提供了一种有吸引力的非侵入性替代方法。

而H、 幽门在大多数情况下，它要么难以培养，要么无法存活[6-8，而血清学通常根据存在或不存在的有机体(抗原)痕迹作出诊断。这就排除了对现有菌株的分析[4]。我们发表了非侵入性的方法，专为获得H、 幽门从人类粪便中[4使用有机提取DNA的方法。这是必要的显示净化H、 幽门粪便中提取的DNA是完整的基因组DNA，可用于基因分型，为非侵入性测定该微生物的传播途径提供了一种潜在的手段。

多态DNA (RAPD)的快速扩增已用于本地细菌爆发的流行病学研究[9]。一些人已经使用RAPD指纹对胃活检材料进行指纹识别[10，11或胃吸气[12，以调查传播H、 幽门，支撑搓澡的假说。这些研究表明，这是微生物体内序列多样性的较高水平;64个独立H、 幽门在一项研究中分离物是可区分的[10最近一项针对32例病例的研究表明，家庭成员之间有密切关系H、 幽门指纹识别模式(11]. 此前，RAPD分析证实儿童感染H、 幽门有菌株相同，他们的母亲，从母婴垂直传播一致[12]。RAPD具有很强的歧视性，因此在调查短期或局部暴发的疾病时很有用[10-12]。本文介绍了一种从人类粪便中提取和分离DNA并进行分子基因分型的方法。对从受感染儿童及其直系亲属获得的样本进行RAPD评估。

2.主题、材料和方法

2.1。主题

到英国格拉斯哥皇家儿童医院就诊的疑似儿童(16岁以下)尿素呼吸测试(UBT)H、 幽门感染进行了研究。那些有积极的UBT结果，与家庭成员一起，被要求提供粪便样本。这些被告知父母同意并且接受了粪便抗原分析，以确定后得到他们的H、 幽门状态[13]。本方法学研究选取了28份儿童及家庭成员粪便阳性样本(图)1)。在某些情况下，在HpSA分析后粪便不足，可以进行DNA提取和基因分型。

2.2。尿素呼吸试验

Duplicate fasting baseline breath samples were collected by exhaling through a straw into an exetainer (Labco, High Wycome, UK) before and 30 min and at 40 min after oral ingestion of 20 mls of 15% polycose (Abbott Laboratories, Dublin, Ireland), containing 100 mg¹³C尿素(99原子%过量;CK天然气公司，伯克郡，英国)。呼吸的丰富¹³C通过连续流同位素比质谱(20/20 PDZ Europa，克鲁，英国)测量。浓度计算为30分钟后的过量丰度¹³C尿素剂量超过基线读数。读数为40.0 ppm(超过基线的delta, 3.5%)¹³C）测定的诊断H、 幽门殖民统治(14]。

2.3。HpSA分析

粪便样品在-80℃直至分析冷冻。酶免疫测定（总理白金粪便抗原，经络Diagnostics公司，辛辛那提，USA）来确定存在或不存在H、 幽门抗原。这种血清学试验依赖于H、 幽门反-H、 幽门过氧化物酶结合多克隆抗体存在下的微孔抗体[13]。24℃孵育1小时后，洗涤去除未结合的物质，然后与基质孵育10分钟。加入硫酸终止液，使反应终止。用分光光度法测定了450nm处的吸光度。热生命科学，英国贝辛斯托克)[13]。

2.4条。完整性验证H、 幽门通过肠道通过后DNA

将之前采集的两个成人(一个阳性和一个阴性)的粪便标本进行离心提取DNA，然后分成5个1ml馏分(A到E)，以测定可培养细菌的数量和是否存在H、 幽门抗原。这些样品包括两个乳状层样品（D和E）和三个上层清液样品（A到C）。乳状层先前被证明含有大量的细菌细胞[7]。改良的Miles和Misra平板计数用于进行文化分析[4]。粪便部分用PBS进行连续稀释，20 uL的3个副本被放置在预先干燥的Wilkin-Chalgren厌氧琼脂板(Oxoid Ltd.， UK)上，在37℃厌氧气瓶中培养24小时(Beckton Dickinson UK Ltd.， UK)。的检测H、 幽门用HpSA酶免疫法检测抗原。

2.5。粪便DNA提取和聚合酶链反应

6克解冻后的粪便样本在室温下用磷酸盐缓冲生理盐水(0.01 M磷酸盐缓冲液，0.0027 M氯化钾，0.317 M氯化钠[pH 7.4] (Sigma-Aldrich，普尔，英国)匀浆2分钟，使用Stomacher 400 (Seward Medical，伦敦，英国)。将得到的20% (wt/vol)粪浆以20000×g离心30分钟(Heraeus Biofuge Stratos离心机);)浓缩粪便菌群[4]。在用塑料巴斯德移液管去除上清液后，乳状相边界被移到单独的2毫升eppendorf (Fisher Scientific UK, Leicester, UK)中，加入等量的Prepman Ultra (Applied Biosystems, Cheshire, UK)。该试剂是为从食品中分离PCR质量DNA而制造的，并根据制造商的说明使用。

样品在水浴中100℃煮沸10 min，使蛋白变性，裂解细菌细胞壁，冷却2 min，离心10 min (Heraeus Biofuge Stratos)，离心10 min使颗粒成粒。有机萃取使用苯酚:氯仿:Isoamylalcohol (PCI) 25: 24: 1 (Sigma-Aldrich,普尔,英国)是用来提取核酸,这涉及到相同体积的PCI和粪便上层清液的混合反演之前在20000×g离心5分钟(EBA 12离心机,Hettich Zentrifugen, Tuttlingen,德国)。将含有上水相的核酸转移到新鲜的2ml eppendorf管中，重复2次。PCI的痕迹最终以类似于上述程序的方式去除，但使用氯仿(Sigma Aldrich, Poole, UK)。用0.1体积的冰3m醋酸钠和两体积的100%乙醇(Sigma-Aldrich, Poole, UK)进行乙醇沉淀回收总核酸。混合后，冰孵育30分钟，16000×g离心15分钟(EBA 12离心机，DJB Labcare Ltd.， Newport Pagnell, UK)。去除上清后，样品风干30分钟后再于266进行复苏μTE buffer的Ls (Sigma-Aldrich，普尔，英国)。

RNA通过在37°C下与40 U的RNAse One（英国南安普顿普罗梅加）孵育1 h降解RNA，然后如前所述通过乙醇沉淀去除酶。用生物素化寡核苷酸探针对16SrRNA基因的一个特定区域进行基因捕获，去除污染的DNAH、 幽门螺杆菌，与所有独特的细菌物种一样，几乎没有等位基因的变异。这是非常特殊的H、 幽门基因高度多态性，平均遗传多样性为0.83，超过所有其他细菌物种[2]. 这涉及到特定捕获探针（5′生物素化探针：capC[5-GGG GAG TAC GGT CGC AAG ATT AAA ACT CAA AGG AAT a-3]）（Sigma Aldrich，Poole UK）[15]H、 幽门DNA随后过夜杂交。链亲和素包被的磁珠，然后用杂交的复杂孵育，以允许生物素 - 链霉亲和相互作用。H、 幽门通过电磁分离将DNA从可能干扰后续PCR的粪便菌群和抑制化合物中分离[4]。DNA样本保存在- 20℃直到分析。

2.6。RAPD分析

一个单一的任意引物PCR引物（1254），具有序列[5- CCGCAGCCAA-3] [10]（Sigma-Aldrich公司，普尔，UK）用于扩增分离的DNA片段。这使琼脂糖凝胶电泳带型的使用Quantity One软件（Bio-Rad实验室公司，赫默尔亨普斯特德，UK）分离物之间的视觉比较和摄影。使用的阳性对照所有实验纯化（H、 幽门DNA菌株NCTC 26695和阴性对照(粪便样本阴性H、 幽门HpSA)，处理相同的研究样本。所有样本，包括对照，都重复运行。

使用PTC-200 Peltier热循环器(MJ Research, Waltham, Massachusetts, USA)扩增基因片段。PCR扩增总共使用50μL反应体积，含1μL模板，1×缓冲液，3 mM MgCl₂，250的dNTP μM dATP, dTTP, dGTP, dCTP各，0.4μM primer and 1.0 U of taq DNA polymerase per reaction volume (Abgene Ltd., Epsom, UK). This was modified from the method previously described [10]。在以下条件下进行热循环:95℃15 min, 94℃5 min, 36℃5 min, 72℃5 min，重复4次，然后94℃1 min, 36℃1 min, 72℃2 min，重复30次。最后10分钟在72℃下完成前面描述的工作[10]。使用BioNumerics软件(Applied Maths NV, Sint-Martens-Latern, Belgium)利用骰子系数评估车道之间的相似性[16]RAPD遗传指纹分析H、 幽门通过凝胶电泳产生的菌株。RAPD patterns were normalised using a 0.1–1 kpb molecular size standard (Abgene Ltd., Epsom, UK), and UPGAMA cluster analysis was performed.

3.结果与讨论

3.1条。可培养细菌分析H、 幽门抗原

在H、 幽门成人受试者阴性，可培养菌量随分数密度的增加而增加，分数密度的平均值为8.25×10⁸CFU/mL粪便分数(SE 2.3×10)⁷)组分A（总CFU/mL的9.6%）的平均值为6.2×10⁹CFU/mL粪便分数(SE 3.6×10⁹)组分E（总CFU/mL的65.1%）。在H、 幽门阳性受试者，可培养菌量从平均4.7×10随分数密度的增加而增加⁶CFU/mL粪便分数(SE 2.5×10⁶)的分数(0.87%总CFU/mL)，平均值为6.8×10⁸ CFU/mL粪便分数（SE 2.6×10⁸)以E为分数(82.5%总CFU/mL) [4]。在两种情况下，可培养细菌的数量与比例的密度成正比。对于这两个个体，所有可培养细菌的大多数在分数E(图2)。

抗原仅在细菌粪便的乳脂层中被检测到H、 幽门殖民个体（平均OD₄₅₀(- < 0.10，模棱两可≥0.1 < 0.12，正≥0.12))在H、 幽门(图7.33)(见图7.33)，抗原载量随分数密度的增加而增加，分数a中平均总抗原为10.5%，分数E中平均总抗原为47.5%(见图7.33)2)表明H、 幽门完整的穿过内脏，因为最高H、 幽门在含有大部分可培养细菌的粪便部分发现抗原信号[4]。

3.2。RAPD PCR的检测限

A series of dilutions was made of a 16.16 ugs/mL stock DNA solution. This was then used for PCR amplification in duplicate, and a gel was run of the PCR products. The limit of detection was determined to be the dilution of the stock solution amounting to 8.08 ugs/mL, equivalent to 2.17 × 10e⁶细菌（图3)。

3.3。来自受试者样本的结果

28个中的26个H、 幽门经过RAPD分型的分离株产生可复制的带型，分型率为93%。在这些分离物中，(1254)引物产生的条带在所有存在电泳条带的情况下都具有高度的歧视性。没有两个样本是完全相同的，每个样本都在7的高值和1的低值之间变化。数字4使用定量- 1想象软件v4.5.0 (Bio-Rad Laboratories Ltd.)进行2%琼脂糖凝胶电泳显示带型。图中比较了有亲本和子女分离株的家系的RAPD电泳带型五。

所有电泳带的同源性都很低。在家系1中，母亲样本（分离株3）与儿童样本（分离株2和4）的相关性略高于父亲样本（分离株1），分别为60%和40%。家系2的样品（分离株5和6）具有65%的相似性，而在家系3中，来自母子的分离物（分离株7和8）具有60%的同源性。所有其他亲本和同胞样本的相似性小于50%。从父母粪便样本中比较分离物6。

来自家系1的菌株[1和3]的相似性为55%，而样本（菌株21和23）未能产生带型，无法与样本（菌株24和27）进行比较。兄弟姐妹之间的相似性是混合的（图7)。从家庭1分离出的分离株2和4的相似性为78%，而所有其他同胞样本(分离株6和16、9和10、14和25)的相似性低于50%。所有的单成员家庭分离株之间的相似性较低(图)8)。从该队列的单个不相关的部件分离物之间最接近的相似性分离物20和26，分离物18和22之间的60％之间的62％，和17株和28所有其它之间50％低于50％的相似性。

4.讨论

以前的研究已经表明，H、 幽门从粪便样本中提取的DNA可用于成功的基因分型H、 幽门DNA[4，15]。本文介绍了一种基因分型方法H、 幽门将完整的基因组DNA片段提取到感染个体的粪便中，采用RAPD的高度鉴别方法。我们已经证明了H、 幽门通过证明HpSA抗原检测在可培养细菌最多的离心部分是最大的，完整地通过肠道。因此，恢复的DNA的基因分型将是整个细菌基因组基因分型的有效代表，而不是片段，否则会扭曲分型结果。

RAPD已被证明是在疫情致病菌的流行病学研究非常有用的工具[16，17，允许的分子特征H、 幽门[18]。涉及前人的研究密切相关H、 幽门利用RAPD指纹技术，从胃活检中获得的菌株显示出了体内分散[11]. RAPD基因分型H、 幽门从粪便样本中提取的DNA可区分所有可分型的分离物，并给出独特的条带模式。

在我们的研究中，所有分离株之间的相似性都很低;两个NCTC 26695阳性控制通道相似度为90.9%，为获得的最大相似度。大多数分离株给出的相似度低于65%，无论捐赠者是否有血缘关系。然而，有趣的是，在家庭1中，两个兄弟样本给出了78%的相似性，这表明这些分离之间有某种程度的同源性。

令人失望的是，并不是所有的hpsa阳性粪便样本都有足够的容量来允许提取DNA。然而，28个分离株中只有2个不能提供任何类型的遗传指纹。一些分离株产生许多波段，而其他只有少数甚至只有一个。数量变化的一个结果是H、 幽门从每个样品中分离得到的结果是，它可能导致即使在克隆分离株中也存在不同强度的RAPD带大小。没有被Bionumerics软件检测到的较暗的波段可能会导致车道之间的相似性差异。在未来的研究中，可以通过使用更多的粪便材料和标准化的粪便H、 幽门在开始RAPD PCR之前提取DNA。

利用RAPD技术进行的研究表明，在水稻上存在着遗传变异的快速积累H、 幽门[17]。在较短期的流行病学研究中，感兴趣病原体内广泛的遗传变异表明，任何两个病人都不太可能被偶然产生相同电泳模式的菌株单独定植。因此，被具有相同带型的菌株感染的个体可能有共同的感染源[17]。源H、 幽门由于伦理和实践的限制，DNA仅限于粪便。在家庭流行病学研究中，从包括儿童在内的大量受试者身上获取胃物质既不允许，也不现实。

在流行病学研究中，鉴定克隆组内的DNA片段之间的细微差异对于追踪传播模式是必要的。区分不相关的隔离(歧视性能力)，以及明确地为每个被分析的隔离提供结果(类型性)，是任何类型系统中重要的性能标准[19]。在长期流行病学研究中，变异积累过快是一个明显的劣势，因为当所有克隆性被破坏时，它可能导致无法识别的电泳模式[17]。RAPD类型提供了一种基于家族分组在短时间内轻松生成可键入数据的方法。样本间很可能发生变异H、 幽门由于该物种的流行病性质，经历了相当大的基因突变和重组[20.]。

5.结论

这是对RAPD指纹和粪便结合的方法的首次描述H、 幽门利用基因捕获提取DNA。RAPD的结果是有希望的，因为93%的分离物都有遗传指纹。提取时使用大量粪便，并对提取的粪便进行标准化H、 幽门RAPD-PCR前DNA可提高灵敏度。这将有助于确认克隆分离株之间的相似性，因此，我们将在进一步的研究中推荐这种做法。但是，我们提供了证据H、 幽门从粪便样本中获得的DNA包含完整的基因组DNA，所述方法的发展为研究这种无处不在的微生物的体内传播提供了一个有前途的方法。

利益冲突

作者声明，本协议不存在利益冲突。

致谢

作者非常感谢克里斯汀·斯莱特和Janice麦吉尼斯他们与尿素呼气试验分析帮助。这项研究是由儿童研究基金会资助。

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