儿童（年龄不超过16岁）参加皇家病童医院（格拉斯哥，英国）尿素呼气试验（UBT）的怀疑 幽门螺旋杆菌感染进行了研究。那些有积极的UBT结果，与家庭成员一起，被要求提供粪便样本。这些被告知父母同意并且接受了粪便抗原分析，以确定后得到他们的 幽门螺旋杆菌状态 [ 13]。本方法学研究选取了28份儿童及家庭成员粪便阳性样本(图) 1)。在某些情况下，大便不足是粪便抗原分析，以允许提取DNA和基因分型后可用。

Duplicate fasting baseline breath samples were collected by exhaling through a straw into an exetainer (Labco, High Wycome, UK) before and 30 min and at 40 min after oral ingestion of 20 mls of 15% polycose (Abbott Laboratories, Dublin, Ireland), containing 100 mg¹³丙脲（99原子％过量; CK天然气，伯克斯，UK）。呼吸的丰度¹³C通过连续流同位素比质谱(20/20 PDZ Europa，克鲁，英国)测量。浓度计算为30分钟后的过量丰度¹³C尿素剂量超过基线读数。读数为40.0 ppm(超过基线的delta, 3.5%)¹³C）测定的诊断 幽门螺旋杆菌定植[ 14]。

粪便样品在-80℃直至分析冷冻。酶免疫测定（总理白金粪便抗原，经络Diagnostics公司，辛辛那提，USA）来确定存在或不存在 幽门螺旋杆菌抗原。这种血清学试验依赖于 幽门螺旋杆菌以抗 幽门螺旋杆菌关于微孔抗体的过氧化物酶缀合的多克隆抗体的存在[ 13]。Incubation for 1 h at 24°C was followed by washing to remove unbound material then incubation with substrate for 10 min. The reaction was terminated by the addition of sulphuric acid stop solution. Absorbance was measured spectrophotometrically at 450 nm (Multiscan Acent; Thermo Life Sciences, Basingstoke, UK) [ 13]。

Faecal samples previously collected from two adults (one positive and one negative) were treated as for DNA extraction by centrifugation and then divided into five 1 mL fractions (A to E) to determine quantities of culturable bacteria and the presence of 幽门螺旋杆菌抗原。这些包括两个样品的来自奶油层（d和E）和上述（A至C）的上清液三个样品。似乳油层以前已经证明含有细菌细胞的浓缩质量[ 7]。改良的Miles和Misra平板计数用于进行文化分析[ 4]。The faecal fractions were serially diluted in PBS, and 20 uL volumes were plated in triplicate onto predried Wilkin-Chalgren anaerobic agar plates (Oxoid Ltd., UK) and incubated at 37°C for 24 hr in an anaerobic gas jar (Beckton Dickinson UK Ltd., UK). The detection of 幽门螺旋杆菌用HpSA酶免疫法检测抗原。

Six grams of defrosted faecal sample were homogenised for 2 min at room temperature with phosphate-buffered-saline (0.01 M phosphate buffer, 0.0027 M potassium chloride, 0.317 M sodium chloride [pH 7.4] (Sigma-Aldrich, Poole, UK) using a Stomacher 400 (Seward Medical, London, UK). The resultant 20% (wt/vol) faecal slurry was centrifuged at 20,000 ×g for 30 min (Heraeus Biofuge Stratos centrifuge; Kendro Laboratory Products, Sollentum, Germany) to concentrate the faecal flora [ 4]。在用塑料巴斯德移液管去除上清液后，乳状相边界被移到单独的2毫升eppendorf (Fisher Scientific UK, Leicester, UK)中，加入等量的Prepman Ultra (Applied Biosystems, Cheshire, UK)。该试剂是为从食品中分离PCR质量DNA而制造的，并根据制造商的说明使用。

样品在水浴中100℃煮沸10 min，使蛋白变性，裂解细菌细胞壁，冷却2 min，离心10 min (Heraeus Biofuge Stratos)，离心10 min使颗粒成粒。有机萃取使用苯酚:氯仿:Isoamylalcohol (PCI) 25: 24: 1 (Sigma-Aldrich,普尔,英国)是用来提取核酸,这涉及到相同体积的PCI和粪便上层清液的混合反演之前在20000×g离心5分钟(EBA 12离心机,Hettich Zentrifugen, Tuttlingen,德国)。将含有上水相的核酸转移到新鲜的2ml eppendorf管中，重复2次。PCI的痕迹最终以类似于上述程序的方式去除，但使用氯仿(Sigma Aldrich, Poole, UK)。用0.1体积的冰3m醋酸钠和两体积的100%乙醇(Sigma-Aldrich, Poole, UK)进行乙醇沉淀回收总核酸。混合后，冰孵育30分钟，16000×g离心15分钟(EBA 12离心机，DJB Labcare Ltd.， Newport Pagnell, UK)。去除上清后，样品风干30分钟后再于266进行复苏 μTE buffer的Ls (Sigma-Aldrich，普尔，英国)。

RNA was degraded by incubating with 40 U of RNAse One (Promega, Southampton, UK) at 37°C for 1 h before the enzyme was removed by ethanol precipitation as previously described. Contaminating DNA was removed by gene capture using a biotinylated oligonucleotide probe to a specific region of the 16SrRNA gene which in 幽门螺旋杆菌，与所有独特的细菌物种一样，几乎没有等位基因的变异。这是非常特殊的 幽门螺旋杆菌基因是与0.83的平均遗传多样性超过了所有其它细菌物种[高度多态性 2]。这涉及一个特定的捕获探针的结合（5'生物素化的探针：CAPC [5- GGG GAG TAC GGT CGC AAG ATT AAA ACT CAA AGG AAT A-3]）（Sigma-Aldrich公司，普尔UK）[ 15]到 幽门螺旋杆菌DNA随后过夜杂交。链亲和素包被的磁珠，然后用杂交的复杂孵育，以允许生物素 - 链霉亲和相互作用。 幽门螺旋杆菌通过电磁分离将DNA从可能干扰后续PCR的粪便菌群和抑制化合物中分离[ 4]。DNA样品储存在-20℃直至分析。

一个单一的任意引物PCR引物（1254），具有序列[5- CCGCAGCCAA-3] [ 10]（Sigma-Aldrich公司，普尔，UK）用于扩增分离的DNA片段。这使琼脂糖凝胶电泳带型的使用Quantity One软件（Bio-Rad实验室公司，赫默尔亨普斯特德，UK）分离物之间的视觉比较和摄影。使用的阳性对照所有实验纯化（ 幽门螺旋杆菌DNA菌株NCTC 26695和阴性对照(粪便样本阴性 幽门螺旋杆菌通过粪便抗原） ，相同的处理，以研究样品。所有样品，包括控制，重复运行。

用PTC-200 Peltier热循环仪（MJ Research公司，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆，USA）进行基因片段的扩增。总共使用了50进行PCR扩增  μL反应体积，含1 μL模板，1×缓冲液，3 mM MgCl₂，250的dNTP  μM各自的dATP，dTTP的，dGTP和的dCTP，0.4  μM primer and 1.0 U of taq DNA polymerase per reaction volume (Abgene Ltd., Epsom, UK). This was modified from the method previously described [ 10]。Thermocycling was performed under the following conditions: 95°C for 15 min, 94°C for 5 min, 36°C for 5 min 72°C for 5 min repeated four times, followed by 94°C for 1 min, 36°C for 1 min, and 72°C for 2 min repeated 30 times. A final 10 min at 72°C was used to finish as described previously [ 10]。使用BioNumerics软件(Applied Maths NV, Sint-Martens-Latern, Belgium)利用骰子系数评估车道之间的相似性[ 16]用于RAPD遗传指纹分析 幽门螺旋杆菌通过凝胶电泳产生的菌株。RAPD patterns were normalised using a 0.1–1 kpb molecular size standard (Abgene Ltd., Epsom, UK), and UPGAMA cluster analysis was performed.

在里面 幽门螺旋杆菌成人受试者阴性，可培养菌量随分数密度的增加而增加，分数密度的平均值为8.25×10⁸ CFU/mL faecal fraction (SE 2.3 × 10⁷）在级分A（9.6％总CFU / mL）至6.2×10的平均⁹CFU/mL粪便分数(SE 3.6×10⁹）在分数E（65.1％总CFU / mL）中。在里面 幽门螺旋杆菌阳性受试者，可培养细菌负载分数密度增高从4.7×10的平均⁶CFU/mL粪便分数(SE 2.5×10⁶)的分数(0.87%总CFU/mL)，平均值为6.8×10⁸ CFU/mL faecal fraction (SE 2.6 × 10⁸）在分数E（82.5％总CFU / mL）的[ 4]。在两种情况下，可培养细菌的数量与比例的密度成正比。对于这两个个体，所有可培养细菌的大多数在分数E(图 2)。

抗原仅在细菌粪便的乳脂层中被检测到 幽门螺旋杆菌殖民个体（平均OD₄₅₀(- < 0.10，模棱两可≥0.1 < 0.12，正≥0.12))在里面 幽门螺旋杆菌-colonized个体，抗原负载分数密度在馏分A中的馏分E（SE 7.33）（图增加从平均10.5％的总抗原至平均47.5％的 2)表明 幽门螺旋杆菌通过肠道完整以来的最高 幽门螺旋杆菌抗原信号中包含大部分培养细菌的[粪便部分中发现 4]。

A series of dilutions was made of a 16.16 ugs/mL stock DNA solution. This was then used for PCR amplification in duplicate, and a gel was run of the PCR products. The limit of detection was determined to be the dilution of the stock solution amounting to 8.08 ugs/mL, equivalent to 2.17 × 10e⁶细菌（图 3)。

28的二十六 幽门螺旋杆菌研究分离株后行RAPD打字产生可再现的条带模式，给予93％的typeability。这些分离物中，（1254）引物产生的条带即是在有电泳带本所有的情况下高度歧视。没有两个样品是相同的，并且七个一高一个频带的低频之间的每个变化。数字 4示出了条带模式与使用Quantity-一个想象软件V500 4.5.0（Bio-Rad实验室制造）的2％琼脂糖凝胶电泳。从家庭RAPD电泳带型其中有父母与子女分离的图进行比较 五。

所有电泳条带模式给予了低程度的同源性。在家族1，母亲的样品（分离物3）稍微更密切相关的孩子的样品（分离物2和4）比父亲的样品（分离物1），60％与40％比较。在家族2，将样品（分离物5和6）孔的65％的相似性，而在家庭三个分离株从母亲和女儿衍生（分离物7和8）显示出程度的同源性为60％的相似性。所有其他亲和同胞样品显示出小于50％的相似性。来自亲粪便样品分离在图进行比较 6。

株[1,3]从家族1具有55％的相似性，而样品（分离物21和23）未能产生的带型的，不能使用的样品进行比较（分离物24和27），分别。发现同级之间的相似性是混合（图 7)。从家庭1分离出的分离株2和4的相似性为78%，而所有其他同胞样本(分离株6和16、9和10、14和25)的相似性低于50%。所有的单成员家庭分离株之间的相似性较低(图) 8)。从该队列的单个不相关的部件分离物之间最接近的相似性分离物20和26，分离物18和22之间的60％之间的62％，和17株和28所有其它之间50％低于50％的相似性。