文摘

客观的。本研究的目的是探索的机理黄芪在脓毒症的治疗。方法。我们搜索的活性成分和目标黄芪使用TCMSP和蝙蝠侠数据库。然后,GeneCards、MalaCards和人类数据库被用来屏幕脓毒症的相关目标。前两组基因的共同目标是上传到数据库的字符串创建一个交互网络。大卫是用于执行KEGG富集分析的核心目标。基于KEGG和先前的研究结果,确定了脓毒症的发展的关键途径和实验验证。结果。我们获得3370 sepsis-related目标数据库和59活性成分黄芪通过数据挖掘,对应1130年目标。十字路口的两种类型的目标导致318取得了共同的目标和84年核心目标后再次检查。KEGG和先前的研究表明,这些84年核心目标是参与脓毒症通过调节肿瘤坏死因子,MAPK和PI3K通路。肿瘤坏死因子、MAPK8 NF -κB,我κBα是脓毒症的关键。实验验证表明,一些标记在脓毒症模型大鼠的干预后改善黄芪颗粒及其化学成分。其中,il - 1β、il - 6和TNF -α大鼠血清中减少。肿瘤坏死因子-的mRNA和蛋白表达αil - 6, MMP9、MAPK8和NF -κ大鼠血液中B减少。然而,我的信使rna和蛋白质表达κBα和PI3K老鼠血液中增加。结论。AST可能会影响TNF、PI3K和MAPK通路级联反应以我为中心κBα和NF -κB,减弱il - 6的表达和MMP9,干扰在脓毒症炎症反应。

1。介绍

overactivation引起的脓毒症是一种全身性炎性疾病的免疫系统和炎症的级联分子释放身体压力条件下,如由病原微生物感染、创伤、休克。没有及时和有效的治疗,脓毒症可能发展为严重脓毒症和威胁病人的生命1,2]。流行病学显示,全世界有超过3000万患者脓毒症(3]。目前,学术界表明过度激活的炎症反应4),免疫功能障碍(5),凝血功能障碍(6脓毒症患者预后的影响。临床上,主要治疗败血症对抗疗法是基于抗生素。然而,随着越来越多的耐药菌株,抗菌药物的滥用,新的抗菌药物的发展,并在临床应用相对滞后,脓毒症患者的预后仍不满意(7]。

黄芪(AST)是一种有效的治疗脓毒症的中草药。AST的干燥根黄芪(费)。知母。var. mongholicus(。)萧。现代药理研究表明,AST和其成分有很好的药理作用器官损伤引起的败血症。第四套变弱sepsis-induced肠道屏障功能障碍通过抑制RhoA / NLRP3 inflammasome信号转导(8]。黄芪多糖对脓毒性保护作用抑制TLR4 / NF -心脏功能障碍κB信号通路(9]。黄芪皂苷还可以调节血清髓过氧化物酶的水平,一氧化氮,乳酸脱氢酶和减少mRNA的表达诱导一氧化氮合酶和interleukin-1β在肝脏,减轻脓毒症引起的盲肠的结扎和穿刺10]。

网络药理学是一门学科,它使用网络可视化和其他技术,揭示了复杂生物网络之间的关系药物,基因,疾病,和目标(11]。网络药理学分析药物作用于不同的目标,细胞和器官在分子和基因水平以及预测和揭示药物的作用和机制。网络药理学可以用来构造一个药物靶网络基于药物的结构和功效,有效地预测药用成分和中药的作用机制及其复合制剂(12]。因此,我们对身体的AST的保护作用进行了探讨。本研究使用网络药理学的方法来预测多种化合物在AST的目标和途径。通过构造一个“compound-target-disease”网络,我们能够进一步阐明AST的改进机制在脓毒症的过程中。与此同时,我们intragastrically管理AST颗粒为一个星期,然后建造了一个SD大鼠脓毒症模型通过尾静脉注射LPS。最后,关键基因变化检测在脓毒症探索AST的保护作用。

2。材料和方法

2.1。AST的化学成分和它的目标

AST的主要化学成分是从中医系统药理学数据库检索和分析平台(TCMSP) (http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)[13)和中药分子机制的生物信息学分析工具(蝙蝠侠)14)(http://bionet.ncpsb.org.cn/batman-tcm/)。基于药物的药代动力学参数的吸收,分布,代谢和毒性在人体15),口服生物利用度(16](OB)≥30%和druglikeness [17)(DL)≥0.18被用作TCMSP数据库中化学成分的筛选条件。调整 被用来作为蝙蝠侠数据库中的化学成分的筛选条件(18]。根据筛选条件,筛选AST最初的有效活性成分。如果筛选组合没有目标,然后删除它。

2.2。寻找Sepsis-Related目标

在线孟德尔遗传在人(人类,https://www.omim.org/)和人类疾病数据库(MalaCardshttps://www.malacards.org/),人类基因数据库(GeneCards,https://www.genecards.org/)是搜索目标基因使用“败血症”作为关键字。在十字路口和AST sepsis-related目标目标,我们获得潜在的AST治疗脓毒症的基因。

2.3。蛋白质相互作用(PPI)建设和筛选

交叉基因导入到字符串数据库11.5 (http://string.embl.de/)。物种是人类;最高最低交互阈值设置为“信心”(> 0.9)[19];和断开网络中的节点是隐藏的。此外,执行第二个屏幕获取更精确的目标。筛选标准如下:目标程度,中间性,亲密的中值大于交叉网络中所有节点被选为核心目标构建蛋白质相互作用(PPI)网络(20.]。

2.4。Drug-Target-Disease建设网络图

我们进口的核心基因和它们相应的组件到Cytoscape 3.6.1为了构建Drug-Target-Disease网络图。

2.5。京都基因和基因组的百科全书(KEGG)富集分析

进一步了解的具体角色筛选交叉网络的基因功能和相关的信号通路,KEGG通路富集分析在使用大卫与核心目标相关的基因。的阈值 被设置为显著。潜在通路之间的连接在PubMed之前还发现通过搜索文献,和基本目标的重要途径是使用Cytoscape 3.6.1形象化。

2.6。分子对接

分子对接进行验证的重要目标筛选KEGG分析以及他们更多的化学合成成分密切相关。从RCSB蛋白质的目标是获得PDB (https://www.rcsb.org/)数据库,从TCMSP数据库获得的化合物。蛋白质和小分子的优化使用SYBYL-X.2.0软件,使用SurflexDock模块执行和分子对接。活性成分与目标蛋白之间的相互作用是根据总分得分得分函数,用更大的总分值表明更好的匹配更重要蛋白质的小分子化合物。一般来说,分值4.0分以上被认为是表明一些绑定活动,和一个值大于5.0表明,分子有很强的绑定到目标(21,22]。

2.7。实验验证

2.7.1。主要试剂和仪器

我们使用以下药品和试剂:cycloeucalenol encecalin,山柰酚(成都推动生物技术有限公司、PS210726-09 PS210726-08,和PS011676), Interleukin-1β(il - 1β)、白细胞介素- 6 (il - 6)、肿瘤坏死因子(TNF -α酶联免疫分析法(ELISA)试剂盒(武汉基因组生物技术有限公司,JYM0419Ra, JYM0646Ra,和JYM0635Ra),有限合伙人(Solarbio L8880)、肿瘤坏死因子-兔多克隆抗体αMAPK8 PI3K, il - 6(亲和力,没有。AF7014、DF6089 AF6241 DF6087), GAPDH(杭州Xianzhi生物有限公司,有限公司,没有。我AB-P-R 001),兔单克隆抗体κ英航,MMP9, NF -κB,β肌动蛋白(abcam没有。Ab32518、Ab76003 Ab32360 Ab6276),甲醇(德国默克公司),黄芪颗粒从百利制药集团在中国购买(授权文件编号:国家医学准确的字符Z20003380),赋形剂(指梁小君的生产过程23助剂在贵州大学),中药),试剂盒(Ambion, 15596 - 026), HiScript逆转录酶(VAZYME R101-01/02), 5 x HiScript缓冲区(VAZYME R101-01/02), ddH2O (genecopoeia C1D230A)核糖核酸酶抑制剂(TransGen AI101)、核苷酸(TIANGEN CD117) SYBR绿色主人混合(VAZYME Q111-02), Taq + DNA聚合酶(TIANGEN ET105-01) DL2000 DNA标记(TIANGEN MD114-02)和随机引物(豆类,3801);引物(武汉Tsingke生物公司,中国)。

我们使用以下工具:哈佛商学院- 1096 a ELISA分析仪器(热电子公司(美国),可调微量吸液管(Glison、法国),高速和低温离心机(埃普多夫,德国)、低速离心机(上海安亭科技仪器工厂,中国),恒温器(北京Liuyi有限公司,中国),4°C冰箱(中科宋美龄,中国),37°C孵化箱(河南金波,中国),和QuantStudio 6实时定量PCR仪(ABI,美国);高效液相色谱法(水域,美国)和PCR仪器(东胜创新生物科技有限公司,中国)。

2.7.2。基于高效液相色谱确定化合物和LD50预测和发现工作室

4 g的溶解黄芪颗粒在10毫升的超纯水,添加甲醇修复卷50毫升,与超声波提取2小时,然后在4°C的离心机,离心10分钟的12000 rpm。1毫克的标准产品cycloeucalenol溶解在1毫升甲醇。1毫克的标准产品encecalin溶解在1毫升甲醇。1毫克的标准产品山柰酚溶解在1毫升甲醇。

检测cycloeucalenol,水域模型2695高效液相色谱蒸发光检测器2424水使用。色谱柱是Diamonsil C18 (2) (2504.6毫米,5μ米),流动相甲醇,列温度是60°C,流量是1毫升/分钟,漂移管温度为80°C, nebuliser温度是30°C,氮流量和增益设置为25 psi和100年,分别注入体积是10μl

Encecalin检测使用水域模型2695爸爸检测器的高效液相色谱法。色谱柱是Diamonsil C18 (2) (2504.6毫米,5μ米),流量是1毫升/分钟,列温度是35°C,检测波长254 nm,注入体积是10μl .梯度洗脱过程如表所示1。

仪器用于测定山柰酚水模型2695高效液相色谱和爸爸探测器。色谱柱是Diamonsil C18 (2) (2504.6毫米,5μ米)1毫升/分钟的流量,一列温度35°C,检测波长360纳米。流动相是甲醇:0.1%磷酸在水/ 50:50,注入体积是10μl

口服LD50预测cycloeucalenol、encecalin和山柰酚在大鼠使用发现Studio执行软件来确定随后的剂量管理(24),把各自的LD50合成剂量被用作最后的剂量为后续药理实验(25]。

2.7.3。实验动物

七十名年龄在8∼9周的SD雄性大鼠的体重(200±30 g)是本实验室中使用,所有提供的是长沙Tianqin生物技术有限公司(动物生产许可证号码:SCXK(香),2019 - 0014年)。根据随机数字表法,他们被随机分为7组,每组10大鼠,即:对照组,有限合伙人,有限合伙人+黄芪颗粒组、有限合伙人+赋形剂组,有限合伙人+ cycloeucalenol集团有限合伙人+ encecalin集团和有限合伙人+山柰酚组。正常成人剂量的黄芪颗粒是每天8 g。基于human-rat身体表面积转换,大鼠每日剂量为0.8克/公斤。溶解8 g的黄芪颗粒在100毫升的水准备的水溶液中黄芪颗粒在80毫克/毫升。这个研究是医学研究伦理委员会批准的南昌大学第二附属医院和审批。回顾[2021],不。(A801)。

第2.7.4。脓毒症模型准备和抽样

经过一个星期的适应性喂养,每组大鼠给予适当的干预。黄芪颗粒(0.8 g / kg),赋形剂(0.8 g / kg), cycloeucalenol(350毫克/公斤),encecalin(14.1毫克/公斤),和山柰酚(6.9毫克/公斤),分别是由填喂法一周。有限合伙人造型进行所有老鼠除了对照组24 h后管理。在对照组,只有尾静脉注射生理盐水。老鼠在其他组注射10毫克/公斤的有限合伙人通过尾静脉根据体重(26]。模型建立后24小时,所有幸存的老鼠,曝露在每组取血样。

2.7.5。观察大鼠的一般情况和存活率

行为改变,皮毛颜色,和精神状态之前和之后的造型被观察到。死亡后造型被记录,每组大鼠的生存曲线被绘制。

2.7.6。检测血清摘要意思β、il - 6和TNF -α通过ELISA水平的老鼠

麻醉后,腹主动脉血拍摄和离心机。浮在表面的拍摄,内容摘要意思β、il - 6和TNF -α血清中被酶联免疫试剂盒检测。操作严格按照指令进行。

2.7.7。实时定量PCR分析

总RNA提取大鼠血液使用试剂盒工具包(豆类)根据制造商的指示,反向转录成cDNA使用PrimeScript RT与基因组净化装备,然后放大了PCR。GAPDH是作为内部参考基因计算2^-ΔΔCt价值的il - 6、MAPK8 TNF -α、MMP9 PI3K和NF -κB基因。β肌动蛋白作为内部参考基因计算2^-ΔΔCt我价值κBα基因。具体的引物如下(如表所示2)。

2.7.8。免疫印迹

使用•瑞帕溶解产物溶解血液中的细胞,用BCA试剂盒来确定蛋白质浓度,添加10%的凝胶电泳蛋白质样品,准备转移膜,然后阻止它5%的脱脂牛奶2小时。PVDF膜的0.45μm大小都沉浸在初级抗体孵化解决方案和孵化一夜之间在4°C。抗体稀释如下:GAPDH(1: 1000)、肿瘤坏死因子(1:500),β肌动蛋白(1:200),MAPK8 (1: 1000), PI3K (1: 2000), NF -κB (1: 1000), il - 6 (1: 1000)κBa(1: 5000)和MMP9 (1: 5000)。添加相应的二级抗体,浸泡在二级抗体孵育PVDF膜解决方案,和孵化瓶2 h在37°C。最后,这部电影被TBST发达和ECL发光。电影进行扫描,结果被ImageJ凝胶成像系统软件进行了分析。

2.7.9。统计方法

所有的数据都是由SPSS 22.0统计软件进行处理。测量的数据表示为平均值±标准偏差(平均数±标准差)。单向方差分析是用来比较多个组当数据是正态分布和方差齐性。生存分析使用log-rank (Mantel-Cox)测试函数。差异显示统计学意义时 。

3所示。结果与讨论

3.1。结果

3.1.1。AST化学成分和它的目标

筛选后,TCMSP数据库包含111化合物和目标,和蝙蝠侠数据库包含51化合物和1081的目标。删除空白和复制目标后,共有59化学成分和1130年药物获得的目标(如表所示3)。

3.1.2。潜在目标对脓毒症的AST

2498、771和183年的目标与脓毒症得到从GeneCards MalaCards,和人类。总共有3370个致病基因重复的删除这些目标后获得。总共有318个交叉基因相交后获得这些致病基因与1130年AST的目标。这些都是潜在的目标,可以用于治疗脓毒症(如图1)。

3.1.3。蛋白质相互作用(PPI)网络建设和筛选

进一步澄清的范围交叉基因的作用在脓毒症的发展,我们筛选318 intersection-based基因数据库的字符串。基于中值的大小程度,介数、和亲密的个人基因在整个网络中,我们确定了84年核心目标(如图2)。

3.1.4。AST活性成分Target-of-Action疾病网络图

84年核心目标和相应的44 chemo-components想起使用Cytoscape 3.6.1软件(如图3)。

3.1.5。KEGG结果演示

KEGG分析目标相关的治疗脓毒症的AST大卫进行使用。八十四年标志被发现参与104信号通路( ),主要包括癌症、肿瘤坏死因子信号通路,恰加斯病,甲型、乙型肝炎、利什曼病,MAPK信号通路,蛋白聚糖在癌症、破骨细胞分化、Tollas疾病,破骨细胞分化、甲型、乙型肝炎、利什曼病,MAPK信号通路,蛋白聚糖在癌症、破骨细胞分化,toll样受体信号通路、弓形体病、沙门氏菌感染、非酒精性脂肪肝病(NAFLD),催乳素信号通路,麻疹、趋化因子信号通路、百日咳、HIF-1信号通路,生成信号通路,PI3K-Akt信号通路,等等。在这项研究中,排名前20的KEGG信号通路筛选显示计数值生成地图(如图4)。根据KEGG结果和总结之前的研究,我们发现TNF, MAPK和PI3K通路在脓毒症的发病机制27]。我们终于确定我κBα、MAPK8 NFκB1,脓毒症发展和肿瘤坏死因子指标基于84年核心目标的频率在TNF, MAPK和PI3K通路和相关的引用(28- - - - - -30.]。在图3这些目标对应的化合物,包括山柰酚、cycloeucalenol, cyperol, encecalin, gamma-sitosterol, encecalin,可能发挥重要的治疗作用。我们发现AST活性成分的基础上,核心目标和绘制网络图的核心目标,路径和组件结合KEGG结果(如图5)。

3.1.6。分子对接

AST节中获得的主要活性成分3.1。5是γ谷甾醇、cycloeucalenol、山柰酚、encecalin cyperol。肿瘤坏死因子,MAPK8(物)、NF -κB1,我κBα关键基因识别部分吗3.1。5。我相对应的蛋白质受体活性化合物κBα(PID: 6 y1j), NF -κB (PID: 1 nfk)、肿瘤坏死因子(PID: 1 du3), MAPK8 (PID: 4 g1w)从RSCB PDB中选择数据库进行分子对接。AST的主要活性成分在对接过程中进入活动网站的核心目标,表明主要的活性成分和核心目标具备良好的绑定,这验证研究结果的可靠性。总分结果如图6。分子对接结果图显示在图7。

3.1.7。实验验证

(1)物质测定和预测基于高效液相色谱的LD50为化学组件和发现工作室。在色谱分析中,样品的黄芪颗粒显示相同的保留时间cycloeucalenol的标准产品,encecalin和山柰酚(如图8)。

根据发现的计算工作室,口服cycloeucalenol LD50, encecalin,和山柰酚是7克/公斤,282.7毫克/公斤,138.9毫克/公斤,分别。

(2)概况和生存分析。与对照组相比,老鼠在LPS组,有限合伙人+黄芪颗粒组、有限合伙人+赋形剂组,有限合伙人+ cycloeucalenol集团有限合伙人+ encecalin集团,有限合伙人+山柰酚组减少了饮食和水的消耗。LPS组和有限合伙人+赋形剂组最严重的精神状态和活动减弱,而有限合伙人+黄芪颗粒组和有限合伙人+ cycloeucalenol组情况明显改善。当老鼠的死亡时间在24小时内计算,发现了一个显著差异在LPS组相对于对照组的生存曲线( )。这表明,有限合伙人有很强的致命影响。干预的存活率明显提高黄芪颗粒和cycloeucalenol ( )(如图9)。这意味着黄芪颗粒和cycloeucalenol可以显著降低LPS在老鼠身上的毒性。

(3)测定血清IL-1β,il - 6,老鼠通过ELISA TNF-α水平。il - 1β、il - 6和TNF -α脓毒症的关键炎症因子和生物标记(31日]。他们可以用作标准的成功脓毒症模型。本研究证实体内血清炎性因子的表达在败血病的老鼠受到脓毒症的影响。il - 1β、il - 6和TNF -α血清生物标志物的表达增加LPS组相比,对照组( )。il - 1的水平β、il - 6和TNF -α后被下调黄芪颗粒干预( )。Cycloeucalenol显著抑制il - 1β( )也抑制il - 6和TNF -的高程α在某种程度上( )。Encecalin显著抑制肿瘤坏死因子-α( )也抑制il - 1的高度β在某种程度上( )。山柰酚显著抑制il - 1β( )也在一定程度上抑制il - 6的海拔( )(如图10)。

(4)检测TNF-α、il - 6、MMP9, MAPK8, PI3K, NF-κB, IκBαmRNA表达通过实时qPCR老鼠血液中。结果表明,肿瘤坏死因子-的目标α、il - 6、MMP9 MAPK8(物),和NF -κB在大鼠的血在LPS组明显高于对照组大鼠的血( ),PI3K和我κBα是大大低于对照组(在大鼠的血 )。这一趋势正好相反黄芪颗粒干预( )。此外,cycloeucalenol encecalin,山柰酚也调节这些基因的表达在脓毒症模型不同程度的血。其中,cycloeucalenol显著抑制MMP9的mRNA表达( )和mRNA的表达抑制MAPK8, TNF -α和il - 6 ( )。Cycloeucalenol显著调节PI3K表达( )和我κBα( )。Encecalin抑制MMP9的upregulation, NF -κB, TNF -α( )。Encecalin调节PI3K表达( )。山柰酚抑制NF -的高程κB和il - 6 ( )。这些表现说明黄芪颗粒及其组件可以调节这些基因的表达在转录(如图11)。

(5)的蛋白表达水平TNF-α,il - 6, MMP9, MAPK8, PI3K, NF-κB, IκBα鼠血。我们的研究揭示了重要的血液蛋白表达变化的核心目标,如肿瘤坏死因子-α、il - 6、MMP9 MAPK8 PI3K, NF -κB,我κBα有限合伙人干预后在LPS组( )。肿瘤坏死因子的蛋白表达αil - 6, MMP9、MAPK8和NF -κB在LPS组显著增加( ),而PI3K蛋白表达和我κBα显著降低( )。这些趋势在有限合伙人+显著逆转黄芪颗粒组干预后黄芪颗粒( )。此外,cycloeucalenol、encecalin和山柰酚还可以调节血液中相关蛋白的表达不同程度的脓毒症模型。其中,cycloeucalenol显著抑制MMP9的表达( )和抑制MAPK8, TNF -α和il - 6 ( )。Cycloeucalenol显著调节PI3K表达( )和我κBα( )。Encecalin显著抑制MMP9的upregulation ( ),肿瘤坏死因子-α和NF -κB ( )。Encecalin显著调节PI3K表达( )。山柰酚显著抑制NF -κB ( )和il - 6 ( )(如图12)。

3.2。讨论

作为炎症性血病,败血症的发生和发展是多种蛋白质分子的结果和多个信号通路调节各种细胞生物学行为。AST、中药对脓毒症有显著的影响,它可以扮演一个角色用不同的方法治疗脓毒症。最近的研究表明,有许多组件AST,可以减缓脓毒症的进展。文献表明,山柰酚、豆甾醇(-)-dicentrine, 1-tetradecanol, cyperene,十四烷,tridecene elemicin和其他组件可以缓解身体的炎症反应。豆甾醇可以有效地抑制LPS诱导的炎症反应,对超出正常水平的一个优秀的监管影响血清肝酶标记,丙氨酸转氨酶、天冬氨酸转氨酶、ALT、AST (32]。山柰酚可以用于治疗急性和慢性炎症损害许多器官,如结肠、肝脏和肺(33]。(-)-Dicentrine可以抑制MAPK / Akt通路激活有限合伙人在一定程度上,减轻身体的炎症反应(34]。家庭可以影响PPAR十四烷γ信号和削弱组织损伤肠(35]。Cyperene有极好的保护作用LPS-induced炎症和氧化应激损伤在星形胶质细胞(36]。Elemicin和其他组件对抑制肺炎有显著影响,降低血清干扰素-γ和il - 4水平,增强他们的抗氧化活性37]。γ谷甾醇可以抑制NF -的表达κB和肿瘤坏死因子的合成α在巨噬细胞38]。AST可以减轻炎症损伤患者脓毒症通过调节MAPK通路,PPARγ信号,干扰素,γ和il - 4。

PPI网络进行分析之后,发现肿瘤坏死因子,MAPK14, AKT1, MAPK8(物),和NF -κB1在疾病的进展很重要。肿瘤坏死因子是一个双分子来自巨噬细胞和免疫细胞。当身体被激活在感染或组织损伤,它可以传递信号通过配体和受体细胞,导致后续的炎症级联反应(39]。肿瘤坏死因子-α不仅可以诱发大规模释放多种炎性因子和刺激炎症的发展(40),但也直接食用抗氧化物质在体内谷胱甘肽(41)和刺激中性粒细胞和内皮细胞释放氧自由基和其他自由基(42]。MAPK14 (p38)和MAPK8(物)可以接收和延长肿瘤坏死因子信号传导的路径和时间,共同影响全身炎症反应的程度,组织损伤的面积,和器官功能障碍的程度通过激活NF -κB (43]。在这个过程中,AKT1(也称为蛋白激酶B或PKB)激活κBαPI3k的作用下。我κBα可以通过300氨基酸残基Rel同源区域。Rel同源域(RHD)与我κBα为了防止NF -κB二聚体进入细胞核在NF -发挥负反馈调节κB (44,45]。总之,上述目标最终会激活PI3k, MAPK、TNF和NF -κB通路加重体内的炎症反应。

根据KEGG结果和之前的文献,我们发现PI3K信号通路,MAPK信号通路,肿瘤坏死因子信号通路发挥重要作用在脓毒症的发病机制。PI3K通路(phosphatidylinositol-3-kinase)是一个重要的信号通路在体内,和保持组织内稳态的调节蛋白质磷酸化、甲基化、泛素化(44]。在脓毒症,PI3K通路的激活可以减少损坏隔膜(46),心肌47)、肺(48),和其他组织和器官通过抑制我的退化κBα。增殖蛋白激酶(MAPK)是一种重要的细胞内信号蛋白网络,介导细胞外刺激细胞内的反应。亚型的激活物是基于thermal-induced凋亡的巨噬细胞,释放il - 6, MMP9, TNF -α和其他炎症因素进一步加剧器官损伤患者脓毒症(49]。这些炎症介质在血液循环调解损害宿主细胞,组织,器官和作为后续的触发级联反应(50]。il - 6是一个重要的指标来评估的程度的炎症反应51),它可以与多种细胞因子,启动一系列的信号转导机制,并形成一个复杂的细胞因子网络,它可以调节内皮细胞和单核细胞52]。趋化蛋白1 (MCP)的生产也可以招募外周血单核细胞积累的炎症,激活特定的白细胞,并启动和维护炎症反应(53]。肿瘤坏死因子-α可以有效地控制在启动后MMP9表达增加MAPK8(物)54],MMP9的增加可以进一步促进炎症反应和降解细胞外基质成分(55]。此外,肿瘤坏死因子-α结合TNFR导致的高表达转录因子NF -κB和加剧了全身炎症反应(56]。在正常情况下,NF -的结合κ二聚体和我κBα在静息细胞面具核本地化NF -的信号κB,但是当刺激,我κBα退化,因此NF -κB二聚体释放到原子核和激活靶基因的转录57]。在NF -κB被释放,它启动MAPK8(物)和加剧炎症反应(58]。PI3K途径合成我是至关重要的κBα(59,60]。因此,这三个因素不独立影响人体的生理和病理变化。在脓毒症的发展,这些途径主要是相互关联和相互交织在一起的。肿瘤坏死因子信号通路是一个必要条件的早期激活MAPK和PI3K信号通路,并建立一个连接PI3K和MAPK信号通路之间的炎症反应的调节中心的NF -κB通路。TNF、MAPK和PI3K信号通路是通过我连接κBα和NF -κb .这些途径在脓毒症的发病机制之间的相互作用决定了广泛的全身炎症的程度,和交换这三个途径可能是通过影响我的平衡κBα和NF -κB。

分子对接技术是一个重要的手段确认化合物之间的相互作用和它的目标61年]。验证是否在上述三个关键目标路径可以结合AST的内部化学成分,我们使用SYBYL-X.2.0开展分子标记之间的对接和化合物,这些通路密切相关,总分大于4,这是一个合理的标准定义标记和化合物的结合。结果表明,γ谷甾醇、cycloeucalenol、山柰酚、encecalin cyperol绑定TNF的共同目标,MAPK8(物)、NF -κB,我κBα在这三个途径。然而,尽管我们可以确定化合物及其之间的绑定的潜在目标通过这种方法,目标基因的生物变化绑定后仍不清楚。

因为所发生的相互作用的化学成分黄芪颗粒是不清楚,中医的优势在于多个特性在多个通路的叠加效应。如肿瘤坏死因子——核心基因αMAPK8(物),NF -κB,我κBα验证了ELISA,实时定量PCR和免疫印迹。结果表明,脓毒症标记摘要意思的水平β、il - 6和TNFα模型大鼠的血和死亡率的老鼠尾静脉注射后明显增加。这些现象是PI3K信号通路变化密切相关,MAPK信号通路,并在大鼠肿瘤坏死因子信号通路。高死亡率的老鼠往往伴随着自己的内部NF -之间的不平衡κB我κBα,NF -之间的平衡κB我κBα可以通过关键基因的表达改变如TNF -α、il - 6、MMP9 MAPK8和PI3K。幸运的是,黄芪明显颗粒及其组件调制死亡率和老鼠的这些关键基因的表达发生改变。

的确,cycloeucalenol的影响、encecalin和山柰酚有些倾斜的影响黄芪颗粒。这些化合物表现出一些针对这些关键基因的调控。例如,尽管cycloeucalenol有调制作用在大多数指标,对NF -它有一个较弱的调制作用κb . Encecalin可以调制MMP9, TNF -α、PI3K和NF -κb .山柰酚更可能影响目标,如il - 6和NF -κb .因此,在某种程度上,cycloeucalenol encecalin,山柰酚都能降低炎症因子的表达,减少大鼠的死亡率。

这表明的药理作用黄芪颗粒可能共同作用的结果,其内部趋药性的组件如cycloeucalenol encecalin、山柰酚。的药理作用黄芪颗粒不能被自己的组件内部的趋化作用。当然,这项研究的结果的量效关系。在未来,我们将进一步明确各自的优势黄芪颗粒和化学成分结合,为临床应用提供新思路和方法。

4所示。结论

本研究是基于网络药理学和使用TCMSP,蝙蝠侠,GeneCards MalaCards,人类数据库获取AST和sepsis-related目标识别它们之间共享基因。AST可能会影响TNF、PI3K和MAPK通路级联反应以我为中心κBα和NF -κB,减弱il - 6的表达和MMP9,干扰在脓毒症炎症反应。

数据可用性

使用的数据来支持这个研究的发现可以从相应的作者在合理的请求。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

海阳Yu和凌Qihua同样这项研究。

确认

这项研究得到了贵州省科学技术计划项目([2017]1401),国家自然科学基金(82074156)、上海医学创新研究特殊项目科学技术委员会(y21900300 20和21 y11920500),和特殊项目研究创新和探索贵州大学中药(2019 yfc171250101)。