文摘
背景。大黄酸是主要提取的感冒palmatuml,which has been proved to improve the renal function of chronic kidney disease, but its mechanism is not clear. Therefore, this experiment explored the potential pharmacological effect of rhein on renal interstitial fibrosis rats.方法。本研究探讨了大黄酸的潜在药理作用。在这项工作中,我们调查的潜在药理作用大黄酸在单边尿道梗阻(UUO)大鼠。三十岁的雄性sd大鼠中被随机分为三组:骗局,UUO,大黄酸(rhein-treated UUO大鼠)组。左侧输尿管UUO组的老鼠被暴露,直言不讳地切割。大黄酸组老鼠注射一种胃内的强饲法的大黄酸(2 mg·公斤−1·d−1),14 d。在这些老鼠肾脏function-related指标监控,而确定组织学病理方面的索引。的表达αsma, TGF -β1、嘘Gli1,蜗牛是量化使用实时聚合酶链反应和免疫印迹。NRK-49F细胞孵化了,没有嘘(100 ng·毫升−1)48小时。的SHH-activated NRK-49F细胞孵化与环巴胺(CNP, 20 umol L−1ng)或大黄酸(1毫升−1)。Gli1蜗牛mRNA和蛋白水平检测。结果。在体内实验中,结果展示,UUO肾脏病理损害引起的。然而,这些变化可以显著逆转大黄酸的管理。与未经处理的UUO组相比,大黄酸组显示减少肾小管萎缩和坏死,间质纤维化增生,异常细胞外基质的沉积。大黄酸的RNA和蛋白表达降低嘘,Gli1, UUO大鼠的蜗牛。在体外实验中,CNP或大黄酸治疗减少Gli1和蜗牛信使rna和蛋白质的表达水平SHH-induced NRK-49F细胞,这表明CNP或大黄酸抑制SHH-induced NRK-49F激活。综上所述,这些研究结果表明,大黄酸抑制SHH-Gli1-Snail信号通路的激活,对肾纤维化的治疗有潜在的影响。结论。大黄酸治疗显著改善肾间质纤维化UUO大鼠通过调节SHH-Gli1-Snail信号通路。
1。介绍
目前,慢性肾脏疾病(CKD)是16th全球死亡原因。它已经成为世界上一个突出的公共卫生问题,与全球发病率约为10 - 15% (1]。一旦在不可逆转的终末期肾病(ESRD)开发的,他们只能接受透析和肾移植。肾脏纤维化是疤痕的形成实质内,它代表了共同的最后通路几乎所有慢性和进步的肾病2]。事实证明,改变生长因子β1 (TGF -β1)由肾小管分泌细胞。TGF -β1确认是引发众多信号的大师,在纤维化和肾实质损失达到高潮。重要的是,TGF -β1可以诱导激活肾间质成纤维细胞,myofibroblasts,特点是α光滑的肌肉肌动蛋白(αsma)表达式3]。表达的增加TGF -β1,αsma是epithelial-to-mesenchymal过渡(EMT)的表现。在肾间质纤维化(RIF)的形成,EMT被认为发挥重要作用器官纤维化(4,慢性炎症5,组织重建6),和各种纤维化疾病(7]。
近年来,嘘信号通路已经被证明组织纤维化密切相关,涉及肝、胆、肺、肾脏和其他器官。发现嘘几乎不表达在正常成人肾,嘘的表达在肾小管上皮细胞明显调节CKD患者由于各种原因造成的。这个结果也证实各种鼠肾纤维化模型如单侧输尿管梗阻(UUO) [8]。这些结果表明,嘘信号通路激活各种肾脏疾病是一种常见的病理结果。因此,抑制myofibroblast激活和嘘信号通路可能是一个有效的策略来防止肾纤维化。
感冒palmatuml,a type of traditional Chinese herb defecation-promoting purgative medicinal, has bitter and cold medicinal properties [9]。大黄酸是一个主要的生物活性成分感冒palmatuml,which has been widely used for the treatment of chronic kidney-related diseases in the clinic [10]。最近的研究表明,大黄酸的anti-autophagy [11],抗凋亡[12],antifibrosis [13]。大黄酸能显著改善肾间质纤维化体内是否其潜在的机制可能与抑制SHH-Gli1-Snail信号通路。
探讨大黄酸和理解其潜在的机制antifibrosis影响肾,UUO模型被用来模拟在大鼠肾间质纤维化。这里,UUO引起亚急性肾损伤表现为肾小管细胞损伤,间质炎症和纤维化,著名的模型诱导肾纤维化体内(14]。体内研究旨在调查肾纤维化的病理变化,和大黄酸在嘘的表达的影响,Gli1,蜗牛蛋白进行了分析。和体外研究旨在探讨大黄酸在Gli1和蜗牛信使rna和蛋白质的表达水平,这与人类嘘蛋白质和老鼠NRK-49F细胞激活。嘘信号通路的激活肾纤维化的保护机制antifibrosis大黄酸在本研究进行了讨论。
2。材料和方法
2.1。动物和细胞
已三十clean-grade雄性SD大鼠(200±20)g动物实验伦理委员会批准重庆医科大学(中国重庆;没有动物许可证。SCXK: 2018 - 0003),由重庆医科大学动物保健委员会的指导方针。正常大鼠肾间质成纤维细胞(NRK-49F)从美国购买类型文化集合(写明ATCC马纳萨斯,弗吉尼亚州)。
2.2。试剂和仪器
试剂和仪器用于这项研究如下:大黄酸(罗恩,上海,中国;环巴胺(美国休斯顿Selleck化学品);人类嘘蛋白质(美国StemRD公司);抗体TGF -β1,αsma (Servicebio,武汉,中国);嘘,抗体Gli1、蜗牛和GAPDH(亲和力生物科学、江苏、中国);PVDF膜,BCA蛋白质化验设备,BeyoECL月球工具包(Beyotime生物技术,中国上海);试剂盒(豆类生物、志贺、日本);引物对qPCR (Servicebio,武汉,中国);AU400自动生化分析仪(奥林巴斯、东京、日本);BX51T-PHD-J11显微镜(奥林巴斯公司,日本东京);图像采集系统的CMOS(奥林巴斯公司,日本东京);Image-Pro +(美国贝塞斯达国家健康研究所的);和TEM (JEM1400PLUS JEOL、东京、日本)。
2.3。动物实验
适应性饲养一周后,三十雄性SD大鼠,随机分为三组:虚假的组老鼠(虚假的操作),UUO组和大黄酸组(rhein-treated UUO大鼠),每组10个老鼠。除了虚假的集团,另两组接受相同的手术建立UUO模型大鼠:用2%的戊巴比妥钠麻醉后,大鼠的肾脏被暴露,然后,左侧输尿管double-ligated。老鼠在虚假的组进行与虚假的操作而不结扎左输尿管。大黄酸组老鼠在2 mg·公斤−1·d−1,大黄酸溶解在0.5%羧甲基纤维素钠(CMC-Na +)在H2啊,通过胃内的强饲法14 d。收到的骗局和模型组大鼠胃内的管理CMC-Na + 0.5% (2 mg·公斤−1·d−1),14 d。2周后,所有老鼠都牺牲了。血液和组织从老鼠是禁食12小时。
2.4。在体外实验中
NRK-49F细胞治疗10%胎牛血清,100 U /毫升青霉素、100 mg / L链霉素,37°C公司5%2在DMEM培养基。大黄酸溶解在二甲亚砜(DMSO)。这些细胞被分为四组:对照组无任何治疗,嘘组(100 ng / L人类嘘蛋白),嘘+大黄酸组(100 ng / L人类嘘蛋白质+ 1 ng / ml大黄酸),和嘘+尼共组(100 ng / L人类嘘蛋白+ 20 umol / L环巴胺)。当细胞增长到80%∼90%融合、激活细胞诱导为48小时100 ng / L人类嘘蛋白质。培养基被丢弃,添加了相应的血清和试剂在每组,和24小时后收集的细胞。Gli1和蜗牛的表达在体外被免疫印迹分析或评估rt - pcr。
2.5。肾组织的组织病理学分析
大鼠肾组织首次在4%多聚甲醛固定48 h,分段嵌入石蜡,进一步。3 -μ米厚的部分获得脱蜡,梯度乙醇,处理和染色hematoxylin-eosin(他),马森,周期性acid-Schiff (PAS)污渍。肾小球病理分析和小管进行了使用光学显微镜。
肾小管间质分数的分析在200×放大;十个小管每视野观察。根据范围的肾小管萎缩,管状类型、基质细胞浸润、纤维化,得分从0到3被分配:0没有;1不到25%;2为25 - 50%;为50 - 75%和315]。从每个皮质筛选图片,分数添加阻力指标损伤:也许可以根据肾小管萎缩,肾小管坏死,间质纤维化16,17]。
2.6。电子显微镜
肾脏的形态和微观结构结构,如肾小球基底膜、系膜细胞,足细胞、内皮细胞和胶原纤维间质组织,使用透射电子显微镜(TEM)检查。老鼠的肾脏组织固定在2.5%戊二醛和嵌入在石蜡。70 - nm厚组织部分被染色,透射电镜观察到。
2.7。免疫组织化学
3 -μ米肾组织部分与柠檬酸抗原检索解决方案孵化20分钟在95°C。此后,部分是沾对转化生长因子单克隆抗体β(TGF -β1;稀释1:500)和α光滑的肌肉肌动蛋白(αsma;稀释1:500)。部分是孵化与山羊anti-rabbit抗体在一夜之间,进一步,与二次抗体50分钟。积极的地区使用轻拍装备可视化。蛋白表达的集成光密度计算使用ImageJ软件。
2.8。实时聚合酶链反应
根据制造商的协议、肾组织的总RNA提取使用试剂盒试剂,根据制造商的指示。此外,RNA是reverse-transcribed互补。PCR循环条件如下:94°C 5分钟,其次是95°C 30年代和57°C 30年代,然后32周期为10分钟72°C。基因表达水平从标准曲线计算使用3 -磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)基因的表达作为参考。
2.9。西方墨点法
肾组织蛋白质提取、量化和可视化通过电泳、免疫印迹膜转移,抗体孵化。主要抗体(1:1000稀释)嘘,Gli1,和蜗牛,一夜之间,膜被孵化在4°C在摇床上。此外,二级抗体(1:2000稀释)添加和孵化37°C的120分钟。在应用颜色ECL试剂和执行黑室曝光成像,图像的灰度值进行了分析使用ImageJ软件(National Institutes of Health),马里兰州贝塞斯达)。
2.10。统计分析
使用SPSS 17.0软件进行数据分析(SPSS Inc .,芝加哥,美国)。数据平均值±标准偏差。每组变量进行了测试,以确定他们是否正态分布。单向方差分析的统计分析进行了最小显著差测试或Dunnett的多重比较检验。 被认为是具有统计学意义。
3所示。结果
3.1。大黄酸提高组织病理学变化的影响
肾纤维化的特点是肾小球硬化症,阻力指标纤维化也许可以肾,肾血管纤维硬化,和过度积累和细胞外基质(ECM)的沉积。病理表现是肾小管扩张与萎缩(绿色箭头);肾小管上皮细胞水肿(蓝色箭头);胞质松散染色、淋巴细胞增殖和浸润(黄色箭头);内皮细胞增殖,ECM组件扩散,肾间质基质扩散,和系膜区扩张(橙色箭头);基底膜增厚(红色箭头);布朗和脚过程融合损失(箭头)。在这个研究中,我们从不同的角度评价肾脏的病变,肾的外表,他或PAS染色和透射电子显微镜。积极的部分病变都标有箭头UUO组和大黄酸组。与UUO组相比,大黄酸改善这些病理损伤(图1)。
3.2。大黄酸在缓解肾纤维化的影响
肾纤维素增生被马森染色评估。ECM的主要组件检查TGF -的表达β1,α通过免疫组织化学sma。在马森染色,胶原纤维所示蓝色(紫色箭头)。与假组相比,有显著的积累在肾组织中胶原纤维的UUO组。与假组相比,ECM的TGF -β1,αsma表达所示黄色是重要的积累。这些结果证实了我们的实验模型是成功的,表明大黄酸交付减轻病变和肾纤维素增生UUO大鼠(图中观察到2)。
(一)
(b)
(c)
(d)
3.3。大黄酸在SHH-Gli1-Snail信号通路的影响
嘘的信号通路调节纤维化是一个重要的途径。嘘的抑制信号通路与肾纤维化的抑制有关。我们检查了嘘的表达,肾Gli1,蜗牛下游。与假组相比,嘘的表达,Gli1,蜗牛UUO组显著增加( )。与UUO组相比,嘘的表达,Gli1,蜗牛的大黄酸组显著降低( )。结果表明,大黄酸可以抑制嘘的激活信号通路(图3)。
3.4。大黄酸对体外嘘通路的影响实验结果
与虚假的集团相比,Gli1的表达和蜗牛NRK-49F细胞刺激嘘(100 ng / ml)显著增加。嘘显著诱导新创Gli1和蜗牛表达在肾间质成纤维细胞NRK-49F细胞。结果表明,同时孵化与环巴胺(CNP, 20 umol / L)压抑和蜗牛SHH-initiated gli NRK-49F细胞的表达( )。孵化和大黄酸(1 ng / ml)也有同样的效果CNP ( )。(图4)。
4所示。讨论
大黄酸蒽醌活性成分之一感冒palmatuml感冒palmatuml .广泛应用于中医作为一个不可或缺的和特定的治疗治疗CKD阶段1 - 5和显示了良好的疗效。大黄酸具有多种药理活性,包括抗氧化,抗癌,抗病毒,抗炎,antifibrosis, anti-hyperuricemic和通便的效果18,19]。大黄酸可以减弱在糖尿病大鼠肾脏损伤改善葡萄糖代谢异常,逆转胰岛素抵抗和血脂异常,有效地防止糖尿病肾病(20.]。众多研究表明,大黄酸保护肾脏通过各种信号通路参与(11,21,22]。
肾脏纤维化是一种常见的病理途径导致终末期肾病。UUO手术可引起肾脏病理变化,包括periglomerular纤维化,肾小球毛细血管壁破裂在肾小囊,血液流入肾胶囊和凝固,导致上皮细胞扩散,扩散的足细胞,单核细胞浸润,生产各种纤维发生的细胞因子、增殖和成纤维细胞的纤维化,毛细血管和向内压缩,或肾小球毛细血管的融合和肾小囊基底膜叫做气球粘连,这把肾小囊的毛细血管基底膜形成肾小球硬化症。肾脏囊泡的基底膜增厚,肾脏囊泡扩张,毛细血管循环挤压(23]。肾小球缺血期间,早期表现是缺血性萎缩,在后期,由于缺血、缺氧毛细管壁,导致渗透率的增加,血浆蛋白漏和冷凝在肾被膜,最后硬化。肾小管的血液供应来自于肾小球,肾小管更容易受到缺血性损伤,胞质浊度和肿胀,肾间质水肿、炎症细胞浸润,肾间质纤维化(RIF) [14]。
肾间质纤维化(RIF)的主要病理改变是多种慢性肾脏疾病(CKD)。这是一种常见的途径,最终导致终末期肾病(ESRD) [2,24]。RIF的范围和严重程度与肾脏功能障碍的程度高度相关(25]。因此,改善RIF具有重要意义减缓和扭转慢性肾病的进展。RIF的发生和发展过程主要包括以下四个环节:调节细胞因子表达,炎性细胞浸润,细胞增殖和epithelial-mesenchymal过渡(EMT)和异常细胞外基质(ECM)的积累26]。EMT是肾脏纤维化的关键流程的上皮细胞失去上皮特征和获得间充质特性,和肾小管上皮细胞的转化,成纤维细胞和其他细胞成myofibroblasts, ECM的形成。RIF的形成,EMT被认为发挥重要作用器官纤维化(4]。肾EMT包含四个关键步骤:失去上皮细胞之间的粘附;新合成的α光滑的肌肉肌动蛋白(αsma)表达和肌动蛋白重组;肾小管基底膜破裂;和细胞迁移和入侵的能力。αsma间质细胞是一种特殊的标记,表示在正常组织和器官但低水平调节在组织或细胞间质分化转移。研究表明,水平α-SMA-positive表达与组织纤维化的程度呈正相关,和大量的αsma表达上皮和间充质细胞转化的一个标志27]。
EMT在肾小管中演示了各种肾间质纤维化动物模型,如单侧输尿管梗阻性(UUO)、肾病、糖尿病肾病(28]。转化生长因子β1 (TGF -β1)是一个关键的球员在纤维化的发展。TGF -β1是所有哺乳动物细胞中表达,是一种重要的细胞因子诱导EMT (29日]。TGF -β是一种分泌刺激蛋白,从而影响自分泌和旁分泌的细胞。在一些动物上皮细胞,可以诱导EMT TGF -β1单独刺激。TGF -β主要包括三种类型,即TGF -β1、TGF -β2,TGF -β3所示。TGF -β1中扮演一个重要的监管作用,病理过程的发生和发展,包括肿瘤和纤维化(30.]。本研究证明了纤维组织和细胞外基质在UUO组显著增加。政府的大黄酸后,肾纤维蛋白的表达TGF -β1,αsma明显减少,基底膜的增厚是抑制比模型组。
嘘的激活信号通路可以诱导大鼠肾成纤维细胞的变换成myofibroblast表现型。研究表明,声波刺猬(嘘)信号通路密切相关,各种器官fibroses [31日]。修补嘘的途径是由配体,细胞膜受体(Ptc), (SMO)抵抗蛋白质,Gli1 (gli, Gli2和激活)下游转录因子。嘘很难检测到正常的人。当发生纤维化,嘘的表达增加,可以绑定到Ptc和删除Pct在SMO的抑制作用。增加了SMO的表情刺激增加了下游Gli1表达式,它以完整的形式进入细胞核和启动靶基因的转录。Gli1是刺猬的转录目标信号转导通路及其嘘信号活动的激活是一个可靠的指标。SHH-Gli1通路参与RIF的过程通过促进细胞增殖(32]。Gli1基因敲除小鼠的研究表明,SHH-Gli1通路是至关重要的器官纤维化(33]。最近的研究发现SHH-Gli1通路可以诱导转录因子的表达蜗牛(34),从而激活细胞内信号转导途径移植选择锌指转录因子(例如,蜗牛)和诱导EMT。研究已经证实,蜗牛是一种重要的信号分子,从而引发EMT并直接参与RIF的发生和发展32]。研究表明,TGF -β激活不同的信号通路之间的串扰,Gli1初始化和维护蜗牛表达式。和蜗牛函数作为TGF -积分器的重要信息β1信号通过上游途径[35]。TGF -β1促进EMT过程中诱导表达的蜗牛,促进肾纤维化。EMT过程中,多个信号通路发挥作用,移植转录因子,促进上皮细胞间质转化。其中,核转录因子蜗牛参与信号转导过程的多个信号通路包括TGF -β1通路,可以诱导EMT在上皮细胞,激活过程中扮演着很重要的角色的myofibroblast [36]。Lovisa [37)发现,在小鼠肾纤维化模型中,蜗牛表达在肾小管上皮细胞内丰富的纤维化病变。删除后的蜗牛在肾小管上皮细胞基因,EMT的肾小管上皮细胞是抑制和肾脏纤维化是缓解(图5)。
蜗牛的家庭是一个锌指转录因子,在果蝇基因在1984年首次被发现。有超过50个成员的家庭。脊椎动物蜗牛家庭由两个成员组成:蜗牛(Snail1)和蛞蝓(Snail2)。最近,人们已经发现,除了防止表达mesectodermal在中胚层和外胚层的基因基础,蜗牛也方在细胞代谢功能,调节细胞分化,能动性和细胞凋亡。研究表明,蜗牛能促进EMT。蜗牛可以移植标记蛋白的表达αsma、myofilin和间充质细胞纤连蛋白。大量的研究已经证实,蜗牛是一种重要的信号分子,从而引发EMT并直接参与RIF的发生和发展。在体内研究中,嘘的表达,Gli1,蜗牛UUO组显著增加,嘘的表达,Gli1,蜗牛信使核糖核酸或蛋白质是大黄酸治疗后下降。结果表明大黄酸可以降低Gli1和蜗牛的表达通过抑制嘘信号通路,从而减少EMT和肾纤维化。体外实验表明,嘘信号通路的激活能显著诱导NRK-49F Gli1和蜗牛的表达( )。添加尼共阻止嘘通路可能抑制Gli1和蜗牛的upregulation鼠肾成纤维细胞诱导嘘蛋白质。大黄酸的添加也抑制了upregulation Gli1和蜗牛。因此,我们假设嘘信号通路可能促进NRK-49F表型转换的诱导upregulation Gli1和蜗牛的表情。大黄酸的antifibrosis效应可能与SHH-Gli1-Snail信号通路的抑制。
5。结论
我们的实验数据表明,大黄酸的摄入可以调节UUO大鼠的病理变化观察到。大黄酸被发现抑制SHH-Gli1-Snail信号途径,缓解肾纤维化的rhein-treated UUO大鼠。因此,我们的研究结果揭示了RIF的潜在治疗靶点和提供新的视角RIF治疗期间大黄酸的药理作用。
缩写
| CKD: | 慢性肾脏疾病 |
| RIF: | 肾间质纤维化 |
| UUO: | 单边尿道梗阻 |
| TGF -β1: | 转化生长因子β1 |
| αsma: | α光滑的肌肉肌动蛋白 |
| EMT: | Epithelial-to-mesenchymal过渡 |
| ECM: | 细胞外基质 |
| 迹象: | 终末期肾脏疾病 |
| 嘘: | 声波刺猬 |
| NRK-49F: | 正常大鼠肾间质成纤维细胞 |
| Gli1: | Glioma-related癌症基因同源蛋白质1 |
| 蜗牛: | 转录因子蜗牛。 |
数据可用性
生成的数据集和/或分析在此研究可从相应的作者在合理的请求。
伦理批准
所有动物实验动物实验伦理委员会批准重庆医科大学(中国重庆)(动物许可证。SCXK: 2018 - 0003),由重庆医科大学动物保健委员会的指导方针。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突。
确认
这项研究支持由中国国家自然科学基金(批准号81573860和81573860)和重庆省自然科学基金(格兰特nos. cstc2021jxjlAX0003, cstc2019jxjl130022,和cstc2018jcyjAX0818)。