文摘

客观的。急性肺损伤(ALI)在脓毒症是一种危及生命的并发症,导致多器官功能衰竭和败血症的患者高死亡率。本研究旨在调查生长分化因子的作用和分子基础7 (GDF7)在sepsis-induced阿里。方法。小鼠皮下注射重组鼠标GDF7蛋白质(rmGDF7)然后气管内的注射脂多糖(LPS)生成sepsis-induced阿里。原发性腹膜巨噬细胞被孤立的进一步评估的作用和基本机制GDF7体外。结果。GDF7 LPS-stimulated肺癌组织中表达下调,rmGDF7治疗显著地抑制炎症和氧化应激在阿里老鼠,从而防止LPS-induced肺损伤和功能障碍方面研究。从力学上看,我们发现rmGDF7激活活化蛋白激酶(AMPK)和AMPK显著抑制阻塞在LPS-induced rmGDF7阿里的抗炎和抗氧化作用。进一步的研究结果表明,rmGDF7激活AMPK通过干扰素基因的表达下调刺激器(刺痛)体内和体外。结论。GDF7防止LPS-induced炎症反应、氧化应激和阿里通过调节刺/ AMPK途径。我们的研究首次确定GDF7潜在代理治疗sepsis-induced阿里。

1。介绍

急性肺损伤(ALI)在脓毒症是一种危及生命的并发症,导致急性呼吸窘迫综合征(ARDS)的发展,阿里的严重形式,通常与多器官功能衰竭和高死亡率为败血症的患者(1- - - - - -3]。多个研究表明,炎症和氧化应激对sepsis-induced阿里的发展至关重要(4- - - - - -6]。脓毒症、炎症细胞被雇来肺组织通过alveolar-capillary特异表达障碍和肺泡壁,他们产生过度的炎性细胞因子,包括白介素6 (IL)和肿瘤坏死因子(TNF)α。反过来,这些细胞因子白细胞激活促炎的积极反馈信号(7,8]。与此同时,大量的白细胞的涌入到肺部也会导致活性氧(ROS)生产过剩和氧化损伤。此外,肺组织的内源性抗氧化能力也受到脓毒性刺激(9]。因此,抑制炎症和氧化应激对减轻sepsis-induced阿里至关重要。

活化蛋白激酶(AMPK),细胞能量的关键调节器内稳态,起着重要的作用在调节炎症和氧化应激和分子靶向治疗已成为一种战略sepsis-induced阿里(9- - - - - -11]。杨等人最近表明,AMPK活化明显块脂多糖(LPS)全身炎症和氧化应激,从而防止感染性肺损伤(12]。江等人表明,AMPK失活促进炎症和氧化损伤在LPS-induced阿里(13]。此外,我们最近的研究结果也显示,AMPK活化介导的抗炎和pulmonoprotective影响丁双胍,,AMPK抑制完全废除这些有益的角色(14]。总的来说,这些发现AMPK定义为一个有前途的治疗目标治疗sepsis-induced阿里。

生长分化因子(GDF)蛋白质属于骨形成蛋白(BMP) /转化生长因子(TGF)β总科,涉及胚胎发育、器官发生和疾病进展15,16]。GDF7(也称为BMP12)是著名的肌腱和韧带形成调节作用[17]。因此,他一一等人先前表明,重组人类GDF7可以促进肌腱套开放手术后愈合修复人类在阶段1中,随机,护理标准控制、多中心研究18]。最近发现周等人证明GDF7能有效地诱导人脂肪干细胞的成骨分化19]。此外,GDF7中和还抑制小梁网纤维化和顺向房水流出阻力,从而阻止青光眼的发展(20.]。此外,Gelberman等人确定GDF7治疗可以刺激M2巨噬细胞的激活和炎症,从而促进肌腱修复的增殖阶段(21,22]。本研究旨在调查的作用和分子基础GDF7 sepsis-induced阿里。

2。材料和方法

2.1。试剂

有限合伙人(大肠杆菌O111: B4, # L2630)从Sigma-Aldrich购买(圣路易斯,密苏里州,美国)。重组小鼠GDF7蛋白质(rmGDF7, # 779 -七国集团),小鼠il - 6 Quantikine酶联免疫试剂盒(# M6000B),和鼠标TNF -αQuantikine酶联免疫试剂盒(# MTA00B)购买的研发系统,Inc .(明尼阿波利斯,加拿大)。复合C(中国共产党,# hy - 13418 - a)购买从MedChemExpress(美国新泽西州蒙茅斯结)和结构提供了官方网站:https://www.medchemexpress.cn/dorsomorphin.html。鼠标GDF7酶联免疫试剂盒(# MBS2500588)从MyBioSource购买,Inc .(美国圣地亚哥,CA)。乳酸脱氢酶(LDH)测定试剂盒(# ab102526),鼠标髓过氧化物酶(MPO)酶联免疫试剂盒(# ab155458),脂质过氧化(MDA)试验设备(# ab118970),脂质过氧化(4-HNE)试验设备(# ab238538)、超氧化物歧化酶(SOD)活力测定装备(# ab65354),以及谷胱甘肽(GSH)试验设备(# ab239727)买来Abcam(英国剑桥)。ROS分析工具包(# S0033)购买从Beyotime(上海,中国)。皮尔斯™BCA蛋白质分析工具包(# 23225)是购自热费希尔科学(美国加利福尼亚州圣何塞)。

2.2。动物

依法所有动物实验进行指导的实验室动物保健和使用由美国国家卫生研究院(NIH出版85号- 23,1996年修订)以及动物保健和使用委员会批准的医院(WDRM 20210305)。雄性C57BL / 6小鼠(8 - 10周大)气管内的注射LPS 50(5毫克/公斤μL盐水)生成sepsis-induced阿里我们先前描述(23,24]。小鼠rmGDF7治疗皮下注射rmGDF7 (25μg /鼠标)有限合伙人注射前24小时,根据一项研究[17]。十二小时后注射LPS,老鼠牺牲与肺组织收集深造。生存研究小鼠气管内的注射致命剂量的有限合伙人(25毫克/公斤),存活率是监控每12 h post-LPS治疗。抑制AMPK,小鼠腹腔注射共产党(20毫克/公斤)2 h和2 h post-rmGDF7注射如前所述[13]。调查的参与干扰素基因的刺激器(刺痛),刺痛全球淘汰赛(KO)小鼠和野生型(WT)的同胞被用作我们先前描述的23]。

2.3。支气管肺泡灌洗液(BALF)采集和分析

获得BALF,老鼠牺牲和气管内的注射1.0毫升的预冷磷酸缓冲盐(PBS)的3倍。液体收集和离心5分钟在1500 rpm在4°C获得浮在表面的游离,然后用于总蛋白质和细胞因子的分析我们之前描述的23,24]。接下来,沉淀细胞颗粒在0.5毫升的PBS和resuspended计算血细胞计数器和Wright-Giemsa染色。

2.4。分析血清和肺GDF7水平

血清和肺GDF7水平进行了分析使用一个商业工具根据制造商的指示。短暂,血清样本允许血栓在室温下2小时,然后离心15分钟在1000 g在4°C得到上层清液。准备组织匀浆,新鲜的肺部都碎成小块,在预冻PBS冲洗以去除多余的血,当时均质在PBS和离心5分钟在5000 g得到上层清液。接下来,血清和肺样本与生物素化的检测Ab孵化工作方案和合共轭工作方案,分别。可视化的衬底试剂后,光密度值以使用标450海里。

2.5。分析LDH活性和MPO活性

评价肺损伤、新鲜肺均质测量LDH的活性,对细胞损伤指数,使用商业套装。简单、新鲜肺均质冷试验缓冲区,当时离心机15分钟在10000 g在4°C得到上层清液。然后,与50个样本孵化μL反应混合,光密度值以使用标450海里。分析MPO活性,肺匀浆是孵化抗体和链霉亲和素与生物素化的解决方案,分别。三甲一步衬底可视化的试剂后,光密度值使用标为450 nm。

2.6。动脉血气分析

分析血液气体交换功能,从降主动脉动脉血液样本收集,和动脉氧的分压(PaO₂)以及动脉二氧化碳分压(帕科₂)是由一个自动血气分析仪分析了如前所述[13]。

2.7。肺功能测定

肺功能测定使用Buxco肺功能系统(美国康涅狄格州,CT)如前所述[25]。治疗后,老鼠被放置在检测房间里连续4天每天2 h后测量给老鼠住宿。接下来,Buxco肺功能系统校准,和老鼠引入气压全身体积描记法single-chamberwhole-body体积描记器。肺合规,气道阻力和肺通气使用FinePointe监控软件。

2.8。肺湿干比

肺样本收集12 h有限合伙人注射后,立即涂抹干燥和重获得湿重,然后受到干燥在烤箱80°C获得恒定的干重。肺湿干比测量来评估组织水肿。

2.9。定量实时聚合酶链反应

定量实时PCR进行如前所述,我们和其他人23,26- - - - - -28]。简而言之,肺组织的总RNA提取有或没有使用试剂盒试剂有限合伙人受伤,然后接受与rt - pcr Transcriptor互补脱氧核糖核酸合成第一链cDNA合成装备。接下来,执行定量实时PCR SYBR绿色我掌握混合LightCycler®480实时PCR系统。引物被列为:鼠标Gdf7提出5′-GAGCTTCCTGTTCGACGTATC-3′;反向5′-CAGGCAGAACTTGCGGGAG-3′;鼠标glyceraldehyde-3-phosphate脱氢酶(Gapdh)转发5′-ACTCCACTCACGGCAAATTC-3′;反向5′-TCTCCTATGGTGGTGACGACA-3′。

2.10。测定氧化应激

测量肺ROS含量和细胞、组织匀浆或细胞孵化dichlorodihydro-fluorescein二乙酸(DCFH-DA 20μmol / L)探针1 h在37°C受光,然后ROS内容确定使用荧光显微镜激发和发射波长485 nm和535 nm (13,29日]。丙二醛(MDA)的含量,4-hydroxynonenal (HNE)、SOD活性、谷胱甘肽测定使用商业套装根据制造商的指示。

2.11。免疫印迹

进行免疫印迹如前所述,我们和其他人23,30.,31日]。短暂,总蛋白提取使用里帕从肺组织裂解缓冲,然后提取蛋白质含量受到量化使用皮尔斯™BCA蛋白质化验设备。接下来,总蛋白质sds - page分离,转移到PVDF膜和孵化主要抗体在一夜之间在4°C被屏蔽后5%的脱脂牛奶。第二天,孵化了膜peroxidase-conjugated二级抗体室温1 h,增强化学发光探测到,随后分析了使用图像实验室分析仪软件(美国大力神,CA)。以下主要抗体购买从细胞信号技术(美国马丹弗斯):antiphospho-AMPK (p-AMPK # 2535), antitotal-AMPK (t-AMPK # 5831), anti-STING(# 13647),和anti-GAPDH (# 2118)。

2.12。原发性腹膜巨噬细胞

原发性腹膜巨噬细胞分离(如前所述)(9]。thioglycolate短暂,小鼠腹腔注射3%,3天后,腹膜巨噬细胞被腹膜灌洗和收获预冷RPMI 1640。接下来,流体是离心机15分钟在1500 g在4°C,和陈腐的巨噬细胞颗粒resuspended RPMI 1640中含10%胎牛血清。巨噬细胞是用rmGDF7预处理(10 nmol / L) 24 h,紧随其后的是刺激与有限合伙人(100 ng / mL)另一个6 h (9,32,33]。抑制AMPK,巨噬细胞与共产党进行预处理(10μmol / L)前12 h LPS刺激(14]。

2.13。统计分析

所有数据被当作平均值±标准偏差(SD)和分析软件SPSS 22.0。单向方差分析后跟一个图基posthoc测试进行比较差异三个或更多的团体,而一个未配对的学生的t以及被用来比较两组之间的差异。< 0.05被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。GDF7减轻LPS-Induced阿里和小鼠的肺功能障碍

首先,我们评估在LPS-induced阿里GDF7表达式是否异常。我们发现血清GDF7水平减少LPS-challenged老鼠(图1(a))。与此同时,肺GDF7信使rna和蛋白质含量也抑制LPS刺激(数字1(b) -1(c))。确认的角色发展的GDF7 LPS-induced阿里,老鼠接受rmGDF7有限合伙人注入之前,和验证效率水平的提高血清和肺GDF7(数据1(d) -1(e))。如图1(f), rmGDF7治疗显著降低肺LDH的活性,对细胞损伤指数。LPS-induced阿里伴随着弥漫性肺泡上皮细胞和血管内皮细胞损伤,导致富含蛋白质的液体泄漏进入肺泡空间和肺水肿(5,8,9]。正如所料,有限合伙人注入增加肺湿干比和总BALF中蛋白质,减少了rmGDF7治疗(数据1(g) -1(h))。血气分析结果暗示LPS-induced损伤的血液气体交换被rmGDF7注入明显缓解,增加PaO就证明了这一点₂和减少帕科₂(图1(我))。因此,rmGDF7治疗肺合规和肺通气量显著升高和降低气道阻力与LPS滴剂(图阿里老鼠1(j))。此外,我们还发现,治疗rmGDF7显著提高LPS-challenged老鼠的存活率(图1(k))。综上所述,这些数据表明GDF7减轻LPS-induced阿里和小鼠的肺功能障碍。

3.2。GDF7抑制炎症和氧化应激在LPS-Treated老鼠

接下来,我们调查的影响上GDF7 LPS-induced在小鼠肺内的炎症和氧化应激。我们发现rmGDF7治疗有效减少总量的积累细胞,中性粒细胞,巨噬细胞(图2(a))。和预处理rmGDF7也抑制LPS-induced MPO活性的增加,中性粒细胞在肺组织中积累的索引(图2(b))。因此,il - 6和TNF -的水平α在阿里小鼠肺组织也抑制rmGDF7治疗(图2(c))。此外,rmGDF7预处理可以抑制LPS-induced肺部氧化应激,就是明证ROS水平下降,MDA和4-HNE(数字2(d) -2(e))。SOD和谷胱甘肽是必不可少的清除过多的自由基,防止氧化应激(9]。我们发现rmGDF7也明显减少LPS-induced SOD,谷胱甘肽耗竭(数字2(f) -2(g))。这些结果表明,GDF7抑制炎症和氧化应激在LPS-treated老鼠。

3.3。GDF7 LPS-Stimulated减少炎症和氧化应激在初级巨噬细胞

基于体内这些结果,我们进一步调查GDF7能否抑制LPS-induced主巨噬细胞体外炎症和氧化反应。如图3(一)rmGDF7孵化显著抑制分泌il - 6和TNF -α从LPS-stimulated巨噬细胞。LPS-induced ROS生成以及脂质过氧化在初级巨噬细胞也阻止rmGDF7治疗(数字3(b) -3(c))。而谷胱甘肽的含量和SOD活性的巨噬细胞显著减少了有限合伙人。预处理rmGDF7可以部分逆转谷胱甘肽含量和SOD活性的减少引起的有限合伙人(数字3(d) -3(e))。这些数据表明,GDF7减少LPS-stimulated炎症和氧化应激在初级巨噬细胞。

3.4。GDF7变弱LPS-Induced阿里通过激活AMPK体内和体外

AMPK分子靶向治疗是一个战略sepsis-induced阿里,我们最近的研究也报道,AMPK活化LPS-inducedALI显著预防。因此,我们试图调查GDF7 pulmonoprotective的影响是否介导了AMPK途径(14]。有趣的是,rmGDF7治疗显著激活AMPK在肺部有或没有LPS刺激(图4(一))。在阿里rmGDF7-mediated肺部炎症和氧化应激的抑制小鼠预防在那些接受共产党,AMPK的药理抑制剂(数字4 (b)- - - - - -4 (d))。同时,中共治疗也封锁对LPS-induced rmGDF7肺损伤的保护作用和水肿,就是明证增加肺LDH活性和湿干比(数据4 (e)- - - - - -4 (f))。正如所料,rmGDF7也未能减轻LPS-induced CpC-treated小鼠血液气体交换障碍,肺功能障碍(数字4 (g)- - - - - -4 (h))。符合体内发现,我们还发现,共产党治疗明显阻塞的抑制性影响rmGDF7 LPS-stimulated炎症和氧化应激在初级巨噬细胞,就是明证增加水平的il - 6、TNF -α,ROS、MDA和4-HNE(数字5(一)-5(c))。增加SOD活性和rmGDF7-treated巨噬细胞谷胱甘肽含量有限合伙人孵化也减少了共产党治疗(数据5(d) -5(e))。我们证明GDF7变弱LPS-induced阿里通过激活AMPK体内和体外。

3.5。GDF7激活AMPK通过体内和体外表达下调刺痛

先前的发现我们和其他人发现,刺痛,先天免疫的关键调节器,有助于sepsis-induced阿里的发展通过促进炎症和氧化应激(23,34]。彭等人也表明,抑制刺可以激活AMPK,从而衰减存在蛛网膜下腔出血后(35]。基于这些研究,我们推测GDF7激活AMPK是否通过下调刺痛。如图6(一),rmGDF7注入显著抑制LPS-induced海拔刺蛋白在肺组织中。有趣的是,AMPK显著激活从刺KO小鼠肺组织有限合伙人滴注法;然而,rmGDF7治疗无法的AMPK激活LPS-treated刺KO肺,表明刺在rmGDF7-mediated AMPK活化(图的必要性6 (b))。符合我们之前的发现,刺KO显著预防LPS-induced炎症和氧化应激反应,不能进一步增强rmGDF7注入,一成不变的描写就是水平的il - 6、TNF -α和活性氧(数字6 (c)- - - - - -6 (d))。rmGDF7也未能减少肺LDH活性和湿干比的刺KO小鼠LPS刺激(数字6 (e)- - - - - -6 (f))。因此,刺KO也废除了有利影响对LPS-induced rmGDF7血液气体交换障碍和肺功能障碍,一成不变的PaO就证明了这一点₂,帕₂、肺合规、肺通气量和气道阻力(数字6 (g)- - - - - -6 (h))。符合体内发现,rmGDF7治疗取得了没有LPS-stimulated刺KO的AMPK激活巨噬细胞,表明刺在rmGDF7-mediated AMPK活化(图的必要性7(a))。因此,LPS-induced炎症和氧化应激在刺KO巨噬细胞显著减少,不能进一步抑制rmGDF7,就是明证的il - 6、TNF -α,ROS、MDA和4-HNE(数字7(b) -7(d))。rmGDF7治疗也未能产生增强SOD活性、谷胱甘肽含量LPS-stimulated刺KO巨噬细胞(数字7(e) -7(f))。综上所述,我们得出结论,通过下调GDF7激活AMPK刺体内和体外。

4所示。讨论

过度的炎症和氧化应激的发病机制是必不可少的sepsis-induced阿里和为ARDS的发展作出贡献。在这项研究中,我们提供了体内和体外证据表明GDF7防止LPS-induced阿里通过抑制炎症反应和氧化应激。机械的研究表明,GDF7会使刺痛,随后激活AMPK(图8)。这些结果,首次表明GDF7可以被视为一个潜在的代理在未来治疗sepsis-induced阿里。

炎症sepsis-induced阿里是一个关键的特性和贡献者。在脓毒症中,循环白细胞(如中性粒细胞和巨噬细胞)被激活并招募了肺组织,产生过度的促炎细胞因子,包括il - 6和TNF -α。这些促炎细胞因子反过来加速的激活和招募白细胞,从而放大了表达和分泌的促炎介质7]。巨噬细胞是主要炎症细胞在sepsis-induced阿里和可分为促炎M1或抗炎M2表型。在这项研究中,我们用LPS刺激巨噬细胞,引起的主要中介M1表型转换。我们的研究结果表明,rmGDF7治疗显著抑制LPS-induced促炎激活的巨噬细胞。同时,增加血管通透性脓毒症过程中也容易使这些白细胞的浸润到肺组织(5,8]。氧化应激是sepsis-induced阿里的另一个必不可少的特点。中性粒细胞积累和肺组织中巨噬细胞的激活不仅可以促进炎性细胞因子和细胞释放也增强活性氧产量和脂质氧化损伤,导致MDA的积累和4-HNE [9]。核因子erythroid-2相关因子2 (NRF2)是一个关键的转录因子在调节氧化还原内稳态和具有保护作用在sepsis-induced阿里9,36]。ROS刺激,NRF2 Kelch-likeECH-associated分离蛋白1和把进入细胞核,它与抗氧化基因的启动子结合(如超氧化物歧化酶、谷胱甘肽)来增强抗氧化能力。之前我们和其他人的研究表明,NRF2表达和活动明显抑制LPS-stimulated肺组织(9,14]。因此,肺组织SOD活性和总谷胱甘肽含量也减少了有限合伙人滴注法,表明抗氧化能力。相反,氧化应激也可以促进促炎细胞因子的表达和分泌,造成了一种恶性循环,引发sepsis-induced ALI的发生和发展。在氧化压力的背景下,硫氧还蛋白相互作用的蛋白分离硫氧还蛋白,结合nucleotide-bindingdomain-like受体蛋白3 (NLRP3),随后激活NLRP3 inflammasome,从而促进成熟,分泌的促炎细胞因子(37- - - - - -40]。因此,我们之前发现抑制NLRP3 inflammasome有效减轻炎症和阿里LPS-treated老鼠(14,23]。在这项研究中,我们证明了rmGDF7治疗显著降低LPS-induced在肺组织炎症和氧化应激和初级腹膜巨噬细胞。

AMPK是一种很有前途的治疗目标治疗sepsis-induced阿里通过抑制炎症和氧化应激。这里,我们发现对LPS-induced GDF7阿里的保护作用是由AMPK活化和共产党治疗显著废除这些pulmonoprotective影响体内和体外。刺痛,DNA检测通路的关键调节器,是嵌入在内质网在生理条件下,在调节炎性疾病中扮演着重要的角色。我们之前发现刺导致sepsis-induced阿里的发展(23]。在这项研究中,我们证明了由rmGDF7所需的AMPK激活,差别刺对这些刺KO废除rmGDF7-mediated额外压抑对sepsis-induced炎症和氧化应激。一致,彭等人也表明,抑制刺可以激活AMPK,从而衰减存在蛛网膜下腔出血后(35]。然而,如何刺KO激活AMPK仍不清楚。白等人先前表明,刺痛了激活磷酸二酯酶3 b / 4,导致降低营水平和蛋白激酶信号的经典上游激活AMPK途径(41]。这项研究有一些局限性。首先,在差别的精确机制调解GDF7对这些sepsis-induced阿里仍不清楚。第二,rmGDF7体内注射系统,肺外的作用和副作用应该评估。第三,需要进行进一步的研究来调查GDF7沉默是否有助于sepsis-induced阿里的进展。

总之,我们证明GDF7防止LPS-induced炎症反应,氧化应激,阿里通过调节刺/ AMPK途径。我们的研究首次确定GDF7潜在代理治疗sepsis-induced阿里。

数据可用性

的数据支持本研究的发现可以从相应的作者在合理的请求。

信息披露

平东和张应是co-first作者。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

萍,应张耿、清构想假说和研究设计。平东、刘年和Jun-Yuan杨和获得的数据进行了实验。平王董和Hui-Min进行了数据分析。萍,应张耿、清起草了手稿。萍耿董、清修订后的手稿。平东和张应同样这项工作。

确认

这项工作得到了国家自然科学基金(批准号81700093和81700093)。