文摘
客观的。探索Zengye汤的效果和潜在机制(ZYD),从中国传统的公式,在重症急性胰腺炎(SAP)大鼠模型与急性肾损伤(AKI)。方法。SAP-AKI模型被3.5%牛磺胆酸盐钠诱导。老鼠用生理盐水或ZYD建模后两次,牺牲了36小时。淀粉酶、脂肪酶、肌酐、血尿素氮、肾损伤分子1 (KIM-1)和多个器官的病理检查被用来评估ZYD的保护作用。肠道微生物检测到16 s rRNA测序分析和血清氨基酸代谢组分析液相色谱-光谱法解释底层机制。的斯皮尔曼相关分析微生物群落和代谢物之间的关系。结果。ZYD显著降低KIM-1 ( )和胰腺的病理评分( ),冒号( ),和肾脏( )。与此同时,ZYD转移整个肠道微生物结构(β多样性,ANOSIMR= 0.14, )并改变了微生物的组成部分。值得注意的是,ZYD减少了潜在的致病性bacteria-Bacteroidetes,梭菌的vadin BB60集团和uncultured_Clostridiales_bacterium,但促进了短链脂肪酸(SCFA) producers-Erysipelotrichaceae,乳酸菌和双歧杆菌Moryella(所有 )。此外,主成分分析(PCA),偏最小squares-discriminant分析(PLS-DA)和层次聚类分析(HCA)提出了一个显著的变化在氨基酸代谢组SAP-AKI感应和明显的监管由ZYD治疗(R2Y 0.878, ;Q2 0.531, )。斯皮尔曼的相关分析表明,肠道细菌可能影响血清代谢物水平(绝对的r> 0.4和罗斯福 )。结论。ZYD减毒SAP-AKI通过调节肠道微生物和血清氨基酸代谢物,这可能是一个有前途的辅助治疗。
1。介绍
重症急性胰腺炎(SAP)是一个多变的和可能致命的疾病与多器官功能障碍(1]。急性肾损伤)是一种常见的并发症SAP和极高的死亡率(2]。代谢重编程的一部分接受底层SAP-AKI病态,但确切的机制尚不清楚3]。同时,独特的治疗SAP-AKI仍在探索(4]。
最近,肠道microbiome-modulating内源性代谢引起了许多利益5]。越来越多的研究表明,肠道细菌生态失调起着至关重要的作用在急性胰腺炎(AP)的病理机制和阿基6,7]。报告也表明,改善肠道微生物群可以预防SAP (8,9]。然而,很少研究调查SAP-AKI调节肠道菌群的影响。血清代谢物对肠道微生物的变化(10],代谢组学是一个强大的工具来探索潜在的发病机理和有效的药物对疾病(11]。氨基酸作为主要营养物质和信号分子调节各种生理过程(12]。不过,据美联社和阿基导致氨基酸代谢轮廓明显的障碍(13,14]。一些研究提出,调节整体血清代谢物可以保护美联社(15- - - - - -17),但很少有人了解的影响调节SAP-AKI氨基酸代谢组。
Zengye汤(ZYD),中药,由Scrophulariae(Xuanshen),过程(Maidong),地黄(Shengdi)已广泛应用于许多亚洲国家几千年来(18]。研究报道,ZYD可以改善代谢疾病如糖尿病19,20.]。值得注意的是,刘等人证明ZYD可以调节肠道微生物群和氨基酸代谢途径治疗便秘大鼠(21]。据我们所知,还没有报告探索ZYD SAP或AKI的应用。因此,我们假设ZYD可以保护SAP-AKI通过调节肠道微生物和血清氨基酸代谢组。这项研究可能提供一个新的治疗方法SAP-AKI和阐明潜在的潜在机制。
2。材料和方法
2.1。动物
21岁男性的雄性sd大鼠中(重量:220±10 g中,清洁级)是获得Dashuo实验动物有限公司有限公司(中国)成都(证书号512003500015140;许可证没有。SCXK(四川)2020 - 030)。经过一个星期的适应环境,动物禁食,但免费访问水24小时前的实验。实验协议通过了四川大学华西医院伦理,是动物伦理委员会批准的(协议编号:2020234,成都,中国)。
2.2。ZYD准备
ZYD汤由Scrophulariae、过程和地黄。根据中国药典,这些原油的合适剂量药物一个成年人(60公斤)15克,12克,分别和12 g。此外,经常使用这个汤是一天3次。因此,单剂量是每公斤体重0.21克/千克(= 0.021克/ 100克)。符合实验药理学的方法写的徐et al。22),6.3倍剂量的成年雄性sd大鼠中是合理的,大概是0.13克/ 100克体重。
这些天然药来自成都中医药大学的附属医院(中国成都),在那里,他们加工后由药学部门的专业人士讨论粒子识别。之后,我们重新成立的喷粉40°C在0.13 g / ml蒸馏水和治疗ZYD组实验动物胃内的政府(1毫升/ 100克体重)。
2.3。实验设计
雄性sd大鼠中被随机分为对照组(C,N= 7)和虚假的操作,SAP模型组(毫克,N= 7),ZYD治疗组(ZYD,N= 7)。所有的老鼠都麻醉与腹腔内注射戊巴比妥钠溶液(2%)(50毫克/公斤)23]。随后的操作类似张等人描述他们的研究(24]。总之,胆胰管被发现和精心插管,然后,微血管夹用于暂时关闭肝管。接下来,3.5%牛磺胆酸盐钠(1毫升/公斤体重)诱导SAP模型通过输液的速度6毫升/小时。最后,我们取代了胰腺和谨慎地关闭了腹部。ZYD煎剂应用于实验大鼠SAP 12 h和24 h后感应到胃内的注入,分别。同时,C和MG等效体积的生理盐水。老鼠牺牲SAP模型建立后36小时。血液样本站2 h后离心(1300 g, 10分钟,4°C),和血清样本存储在−80°C到分析。新鲜组织,包括胰腺、结肠和肾脏,在室温下与多聚甲醛固定并送往Lilai生物科技公司嵌入的石蜡和部分。结肠的新鲜粪便样本快速保存在液氮容器在−80°C到分析和维护。
2.4。实验室测试
的浓度淀粉酶、脂肪酶、肌酸(Cr)和血液尿素氮(BUN)测定血清中检测到罗氏Cedex C501自动生化分析仪(瑞士)。血清肾损伤分子1 (KIM-1)水平测定的酶联免疫试剂盒(猫。不。佐- 37184)从卓Cai技术公司(上海,中国)符合制造商的指示。
2.5。组织病理检查
石蜡包埋胰腺、结肠和从每组肾组织,切片后(5μ米)、脱蜡和苏木精和伊红染色()),一个正直的显微镜下观察(德国蔡司)由两个专业病理学家在盲目的方式。胰腺(×200)和肾(×200)得分,分别为水肿、中性粒细胞浸润、坏死,出血在0(没有)4(严重)规模25];然后,综合成绩计算。结肠(×200)是得分为炎症反应组织学变化使用建立评分系统和一个范围从0到4 (26]。随机十领域的每个部分都算,综合得分的平均值为每个字段是最终的病理损伤评分。
2.6。16 s rRNA肠道微生物的测序分析
2.6.1。DNA提取
大便的送到OE生物技术(上海,中国)执行16 s rRNA分析。根据制造商的指示,总基因组DNA提取通过DNeasy PowerSoil工具包(试剂盒,猫。不。12888年,美国)。NanoDrop(美国热费希尔2000)和琼脂糖凝胶检测DNA的浓度。然后,他们的援助申请PCR扩增编码引物和橡胶草Gflex DNA聚合酶(豆类,猫。不。R060B、日本)。
放大特定区域(V3-V4) 16 s rRNA基因帮助细菌多样性分析和广泛的引物:343 f (5′-TACGGRAGGCAGCAG-3′)和798 r (5′- AGGGTATCTAATCCT-3′)被用于这项研究。测量后利用凝胶质量,净化AMPure XP珠子(美国Agencourt) PCR产品再次放大了PCR。然后,最后的扩增子被净化,收购量化利用量子位dsDNA化验设备(热费舍尔,猫。不。美国Q32854)。最后,这些扩增子合并在等量后续的测序。
2.6.2。生物信息学分析
未加工的测序数据保存在FASTQ格式。Trimmomatic软件(版本0.35)应用于预处理paired-end读取检测和切断模糊基地(N) (27]。滑动窗口修剪方法帮助减少劣质序列(平均质量分数< 20)。然后,Flash软件(版本1.2.11)组装paired-end读(28]。参数在组装如下:10 bp - 200 bp的重叠和20%的最大的错配率。QIIME软件(版本1.8.0)协助进一步去噪的序列如下:放弃读与模糊序列,同源,或低于200个基点;保留基地高于Q20读取的75%。然后,读取与嵌合体探索和删除29日]。VSEARCH软件(2.4.2版本)的帮助下,业务分类单元(辣子鸡)产生的干净的读取,这来自引物序列去除和集群(相似性截止:97%)30.]。的代表读OTU QIIME包被。分析α多样性,如香农指数、辛普森指数,曹国伟1指数,并观察到的物种,在先前的研究[详细31日]。线性判别分析(LDA)的效果(LEfSe)执行根据朱et al。32]。非度量多维标度(nmd)基于Bray-Curtis距离,分析相似之处(ANOSIM)和京都基因和基因组的百科全书(KEGG)路径分析中描述的研究实现Lei et al。33,34]。核糖体数据库项目(RDP)分类器是利用注释所有典型对席尔瓦读取数据库(123年版)和70%置信阈值(35]。
2.7。血清氨基酸代谢组检测
代谢组学分析,21血清样本被送往西方China-Washington线粒体和新陈代谢研究中心。合并方法针对性分析氨基酸的和无目的的分析实施这项研究[36]。最终3000快速液相色谱分离(热费希尔科学、美国)配备了本·酰胺列(100×2.1毫米,1.7μ米,水域,美国)加上问Exactive + quadrupole-Orbitrap高分辨率质谱(美国热费希尔科学)进行测量。详细的程序从试剂制备液体chromatography-tandem质谱(质/ MS)数据分析研究报告中描述了Zhang et al。37]。在这项研究中如下特殊参数。列的温度是35°C,洗脱梯度线性改变:0 - 2分钟,100% B;2 - 4分钟,100% - -95% B;第4 - 9分钟,95% - -85% B;9-14 min, 85% - -50% B;14 - 17分钟,50% - -50% B;17 - 17.1分钟,50% - -100% B;和17.1 -25分钟,100% b差异表达代谢产物筛选在这些条件下:1。克鲁斯卡尔-沃利斯检验 ;2。变量重要性的投影(VIP)评分> 1。R软件(版本4.1.0)是用于统计数据分析,比如克鲁斯卡尔-沃利斯检验,层次聚类分析(HCA),主成分分析(PCA),偏最小squares-discriminant分析(PLS-DA),对数据库和路径分析KEGG [38]。
2.8。斯皮尔曼的相关分析
cor.test (R软件4.1.0)执行枪兵的血清代谢物浓度和属丰度之间的相关性分析。的P价值的多重比较被Benjamin-Hochberg纠正错误发现率(罗斯福),如果绝对协会被认为是具有统计学意义r值> 0.4和调整 (39]。
2.9。统计分析
数据(均值的平均值±标准误差(SEM)分析SPSS26.0(美国芝加哥,IL)。参数分布的类型检查使用Shapiro-Wilk测试。单向方差分析与事后至少显著差异(LSD)试验进行了三组标准分布数据。Mann-WhitneyU测试两组和克鲁斯卡尔-沃利斯检验三组被用来比较连续变量。 被认为是具有统计学意义。
3所示。结果
3.1。对SAP-AKI ZYD显示保护作用
在这个实验中,我们建立了SAP-AKI模型再输注3.5%牛磺胆酸盐和钠牺牲大鼠建模后36小时观察ZYD的效果。血清淀粉酶( ),脂肪酶( ),和KIM-1 ( )SAP感应后水平显著提高。相反,ZYD降低血清淀粉酶和脂肪酶浓度显著降低KIM-1 ( )(图1(一))。没有明显的差异Cr和包子三组(数据没有显示)。
(一)
(b)
MG组形态学显示重伤水肿和胰腺腺泡的细胞坏死,在结肠嗜中性粒细胞浸润,肾脏出血较C组( ,图1 (b))。相比之下,一个重要的损伤胰腺的改进( ),冒号( ),和肾脏( )提出了ZYD组(图1 (b))。总之,这些结果表明SAP-AKI ZYD的保护作用。
3.2。在SAP-AKI ZYD调节肠道微生物组
检测ZYD对肠道微生物区系的影响与SAP-AKI老鼠,我们分析了21个粪便样本使用16 s rRNA基因测序的方法。辣子鸡,集群的高质量的扩增子从肠道细菌基因序列变异V3-V4地区,被肠道微生物组比较的基础。共有3083个辣子鸡重叠在三组中,与143年、157年和117年辣子鸡专门检测到C MG,分别和ZYD团体(补充图1(一))。物种积累曲线往往趋于平缓随着样本数量的增加,这意味着适当的排序在这个实验中(补充图1 (b))。有趣的是,四α多样性指数在三组比较,揭示ZYD没有明显影响intrasample物种丰富度和多样性(补充图1 (c))。
的β多样性分析基于Bray-Curtis距离(nmd)显示了相似的细菌结构(34]。尽管集群的样本在C MG不能分开,ZYD显著改变了微生物从SAP-AKI状态(ANOSIM结构R= 0.14, )(图2(一个))。LDA的影响大小(LEfSe)确定10、10、14 C占主导地位的细菌类群,MG和ZYD(从门到属,LDA > 3, )(图2 (b),补充图1 (d)),这表明不同微生物组成的三组。此外,潜在的致病细菌(40),如拟杆菌门毫克,是不成比例。与此同时,短链脂肪酸(SCFA)生产商-Erysipelotrichaceae,双歧杆菌属,乳酸菌都是主要的ZYD [41,42]。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
接下来,由Mann-Whitney微生物成分的变化进行了评估U测试。在门级,SAP-AKI大量的增加拟杆菌门,但ZYD下降( )(图2 (c))。在家庭层面,梭菌的vadin BB60组增加了SAP-AKI ( )但被ZYD下降( )(图2 (d))。在属级,12属被SAP-AKI转移状态( ),和20属受ZYD ( )(图2 (e))。值得注意的是,ZYD增加乳酸菌( )和Moryella( )而减少uncultured_Clostridiales_bacterium ( )。总的来说,这些结果指出重要的调制效应,ZYD治疗肠道微生物概要文件。
此外,KEGG路径分析表明,肠道微生物群落功能基因的氨基酸代谢更丰富的ZYD组,这意味着氨基酸代谢组可能受ZYD(图2 (f))。
3.3。ZYD监管SAP-AKI血清氨基酸代谢组
探索的影响ZYD血清氨基酸代谢组,我们用质/ MS进行代谢组学分析。完全,确定了814种代谢物从21血清样本。无人监督的PCA方法提出了数据的变化趋势和血清样本的检测到潜在的离群值43]。主成分分析的散点图(图3(一个))表明,第一主成分(PC1)覆盖14.59%的变异和分离SAP-AKI状态和健康对照组(MG例外之一除外)。第二主成分(PC2)覆盖12.68%的变异和MG和ZYD组明显分歧。此外,PLS-DA监督方法应用于描述全球跨组织代谢的差异(43]。根据集团,杰出的集群中塑造PLS-DA情节,表明代谢表型被SAP-AKI戏剧性的改变了,ZYD(图3 (b))。相应地,置换试验显示出良好的可解释性和可预测性的PLS-DA模型(R2Y 0.878,P= 0.01;Q2 0.531, )(图3 (c))[43]。因此,随后的分析可以实现。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
53个代谢物与跨组织被克鲁斯卡尔-沃利斯检验选择统计学意义( )和投影变量重要性评分(VIP > 1)。HCA有效的算法来处理类似的样本是基于特征峰的相对区域检测到质/女士[44]。结合HCA和热图可视化有助于发现这些差异代谢物的变化趋势45]。图3 (d)提出了一个非凡的丰度变化这些代谢物SAP-AKI建模和ZYD治疗后。另外,21个血清样本集群分成三个类别(一个例外除外),和集群ZYD接近对照组比出来。可以推断,ZYD可以调节SAP-AKI扰动的氨基酸代谢轮廓。
ZYD探索潜在的保护机制,我们接下来进行KEGG通路富集分析这些代谢物。气泡图显示,多个通路被这些代谢物(图丰富3 (e))。其中,KEGG通路的丙氨酸,天冬氨酸和谷氨酸代谢( ,= 0.5)影响可能发挥重要作用在ZYD SAP-AKI疗法。这些结果共同提出了一个显著的变化在氨基酸代谢组SAP-AKI感应和明显的监管由ZYD治疗。
3.4。微分属和代谢物之间的相关性
斯皮尔曼相关分析是进行30属,53个代谢物的统计差异(克鲁斯卡尔-沃利斯检验, )在三组。有趣的是,发现显著的交互作用(绝对的r> 0.4和罗斯福 )其中属代谢物,表明肠道细菌可能诱导血清代谢物水平的变化(图4)。
4所示。讨论
SAP-AKI提高患慢性肾病的风险和患者的死亡率,但确切的病理机制尚不清楚,迫切需要独特的治疗(46]。本研究成功建立了SAP-AKI大鼠模型,观察肠道微生物的干扰和血清代谢物。我们的结果呈现,ZYD重塑肠道微生物群落的景观,赋予耐氨基酸代谢失衡,并显示对SAP-AKI的保护作用。
分泌淀粉酶和脂肪酶是一种重要的胰腺腺泡细胞的功能。胰腺腺泡细胞受损时,大量的淀粉酶和脂肪酶将直接进入循环系统,而不是消化管(47,48]。因此,淀粉酶和脂肪酶是全球推荐生物标志物评估急性胰腺炎严重程度(49]。在这项研究中,两个指数的显著增加和组织病理学评分建议SAP模型建立成功。正如预期的那样,ZYD降低血清淀粉酶和脂肪酶在很大程度上,虽然没有达到统计学意义,也隐含ZYD胰腺腺泡细胞的保护作用在SAP。这种猜测也支持我们的组织病理学结果,在腺泡细胞的病理损伤明显减少ZYD治疗。目前,从SAP的诊断AKI复杂取决于动态增加血清铬(49]。包子通常是用来评估肾功能在临床实践50]。然而,不准确地反映肾损伤严重程度,尤其是在早期SAP (51]。因此,Cr和包的变化在这个研究是轻微的和无关紧要的。一个初步研究证明尿KIM-1浓度SAP-AKI患者的诊断价值,显示了持续很短的时间内和缺陷需要频繁的监控(52]。一种罕见的研究探讨了血清KIM-1 SAP-AKI严重性评估价值(51]。但常等人发现了一个显著增加出血性休克大鼠模型血清KIM-1与阿基53]。与文献一致,我们发现血清KIM-1明显解除在36 h SAP-AKI但接近正常ZYD治疗后大鼠模型。所以,这个结果表明血清KIM-1的诊断价值SAP-AKI在早期阶段。需要更多的研究来阐明这一点。
最新的研究表明,肠道微生物群在急性胰腺炎的发展中扮演着重要的角色(45,46),这意味着调节肠道微生物结构可能是一种有效的治疗SAP。早前的一项研究报道,壳聚糖寡糖减毒SAP通过调制β肠道细菌的多样性和主要成分(54]。部分符合先前的研究[9),ZYD还显示能力从SAP-AKI肠道细菌结构转变,nmd和LDA-LEfSe就证明了这一点。因此,我们推测,ZYD改善SAP-AKI通过肠道微生物区系的调制。的拟杆菌门(门),潜在的致病细菌(55),是一个占主导地位的肠道细菌在SAP-AKI成员。同样,梭菌的vadin BB60集团(家庭)和uncultured_Clostridiales_bacterium(属),都属于机会致病性梭菌的(顺序)56SAP-AKI状态),显著增加。然而,我们的研究结果表明,这些致病菌有效减少ZYD治疗。因此,它可以推断出,减少致病微生物群可能ZYD的保护机制密切相关。改变肠道微生物成分有助于细菌代谢产物的变化,这可能会影响SAP的进展(57]。SCFAs,广泛研究细菌的代谢产物表现出良好的性能在维持肠道内稳态(58]。研究还表明,补充SCFAs帮助改善器官损伤在SAP (59,60]。在这项研究中,SCFA-producing菌株Erysipelotrichaceae,双歧杆菌属,乳酸菌,Moryella在比MG ZYD[更丰富42,61年]。它表明ZYD保护SAP-AKI SCFAs通过增加这些细菌间接补充。综上所述,我们的研究结果暗示ZYD改善SAP-AKI通过调节肠道微生物,包括减少病原菌和提高SCFA-producing菌株。
氨基酸是大量能源燃料身体(62年]。在急性胰腺炎,系统性炎症引起hypercatabolic状态,导致能源需求增加,破坏氨基酸的代谢13,63年]。为关键的AKI患者,hypercatabolic条件也消极地影响蛋白质降解和氨基酸转换(64年]。因此,调节氨基酸的代谢可能作为一种潜在的治疗SAP-AKI。先前的研究已经阐明中药治疗急性胰腺炎的能力通过改变代谢概要文件(16]。正如所料,独特的氨基酸的代谢表型SAP-AKI ZYD治疗后,提出了在主成分分析的散点图和PLS-DA。此外,53个微分代谢物的变化在组织透露,ZYD可能会改变氨基酸的代谢状况对健康的状态。总之,这些结果暗示ZYD变弱SAP-AKI通过调节氨基酸代谢组。一个意想不到的发现是局外人的MG组,但我们认为这是由于较小程度的疾病后SAP-AKI建模。此外,KEGG分析表明ZYD可能影响多个通路治疗SAP-AKI,但丙氨酸,天冬氨酸,谷氨酸代谢大大丰富了多种代谢物值得高度重视。丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸发挥重要作用在蛋白质结构和能量补充三羧基的周期(62年]。SAP困扰我们的结果显示,这些代谢物的代谢通路,和ZYD显著监管他们中的大多数,尤其是增加谷氨酸(谷氨酸)。谷氨酰胺的供应,可以水解谷氨酸,可以改善肠道通透性,氧化应激,降低SAP患者的并发症率(65年]。因此,可以推断,ZYD可以通过影响丙氨酸通路的调节能量补充剂,天冬氨酸和谷氨酸代谢保护SAP-AKI,但需要更多的研究来阐明它。
代谢物是生理反应条件和肠道微生物区系的变化(66年,67年]。氨基酸已成为关键代谢物调节代谢和炎症信号通过与微生物群的关系和宿主受体(68年]。相应地,在这项研究中,重要的肠道细菌和氨基酸之间的相关性被发现,也被卷入调制SAP-AKI ZYD。因此,我们推测,肠道微生物群和血清代谢物之间的相互作用有关的潜在机制ZYD保护。
这项研究有一些局限性。首先,这些实验数据来自少数SAP-AKI动物模型。第二,当前的发展水平的方法可能会限制检测肠道微生物组和代谢组的血清。然而,这项研究提供了一种新的疗法SAP-AKI并初步阐明底层机制。我们的发现可能有助于进一步理解SAP-AKI ZYD病理学和适当的临床应用。
5。结论
ZYD减毒SAP-AKI通过调节肠道微生物和血清氨基酸代谢物,这可能是一个有前途的辅助治疗。
数据可用性
和/或使用的数据集分析在当前研究可从相应的作者在合理的请求。
信息披露
资助者没有参与研究设计、数据收集和分析,决定发表,准备手稿。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突。
作者的贡献
温敷唐设计研究和获得资金;小雨戴,钱其琛,Jia-qi姚明,和吴Xia-jia进行实验;小雨戴分析数据和起草论文;Yi-fan苗,胡安·李,美湾的关键修订手稿。
确认
作者要感谢梁通用电气,张璐和郑温家宝(西China-Washington线粒体和代谢研究中心,华西医院,四川大学)对代谢组学的数据采集和分析。这项工作得到了国家自然科学基金(批准号81873203)。
补充材料
补充数据上传与原来的手稿。(补充材料)