文摘
客观的。探讨电针刺激的效果(EA)在大鼠认知功能障碍与肝性脑病和它的底层机制。方法。五十Wistar鼠随机分为正常组(n= 10)、模型组(n= 40)。大鼠模型建立了肝性脑病的四氯化碳和硫代乙酰胺总数为12个星期。建模在9周后,模型组大鼠认知障碍的莫里斯通过进行水迷宫测试,然后随机分为对照组(三地4包括EA组(CCl)和治疗组4+ EA), CCl乳果糖组4+ Lac)和EA +乳果糖组(三地4+厘米),每组9老鼠。在第九周结束时,老鼠在三地4CCl + Lac和4+ CM组乳果糖填喂法的剂量10毫升/公斤体重,而正常的控制和创新领导力4组强饲法同样体积的生理盐水每天一次21天,直到实验结束。CCl的老鼠4CCl + EA和4+ CM组接受了针灸在Baihui(全球之声(DU) 20),被羞辱的(全球之声(DU) 24),和Zusanli (ST36)穴位,其中EA Baihui和被羞辱的穴位有每天一次连续30分钟持续21天。治疗的效果是衡量莫里斯水迷宫测试学习和记忆能力和核磁共振光谱(夫人)在大鼠的海马神经元代谢和肝性脑病。病变大鼠海马被他染色观察,而血清氨和肝功能检测标记。免疫印迹和实时荧光定量PCR是用于检测特定基因的表达和蛋白质的脑组织。结果。与对照组相比,老鼠接受EA明显缩短逃脱延迟和增加数量的交叉平台。他走时染色证实,EA改善脑组织坏死和改善核固缩有肝性脑病的老鼠。血清水平显著降低氨、丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、总胆红素(治疗组)和总胆汁酸(稍后通知)中观察到的老鼠接受EA,以及提高水平的总蛋白(TP)、白蛋白(铝青铜)。此外,EA抑制TNF -大脑的表达式α,il - 1β,il - 6,进气阀打开,TLR4、MyD88 NF -κB p38MAPK磷酸化(p) -p38MAPK STAT3和p-STAT3基因以及蛋白质TNF的表达α、il - 6、TLR4 MyD88, NF -κB p38MAPK p-p38MAPK, STAT3和p-STAT3。夫人显示增加Glx / Cr和减少乙酰天冬氨酸/ Cr, Cho / Cr和mI / Cr在对照组,和EA显著逆转这种变化Glx / Cr和mI / Cr值。结论。EA改善过度生产的促炎细胞因子在大鼠的海马与认知功能障碍继发于肝性脑病,也引发了后续更改,如降低血氨水平,brain-protective激活星形胶质细胞,降低脑组织损伤程度。p38MAPK / STAT3和TLR4 / MyD88 / NF -κB信号通路可能参与其中。EA还可以提高乙酰天冬氨酸的代谢和赵大鼠海马,从而提高学习和记忆能力。
1。介绍
肝性脑病(他),由于代谢紊乱,中枢神经系统功能障碍引起的急性和慢性肝功能异常或门户系统并联(1]。它的特点是广泛的神经精神改变,意识障碍,行为异常,以及一系列的障碍从亚临床改变昏迷,这是一个持续的过程的神经认知功能障碍(2]。等等,这种他(切)是最常见的类型,它与肝硬化,门脉高压,和/或门户分流。研究表明,格瓦拉在肝硬化患者独立和死亡联系在一起,和他在这样的病人的发病可能导致持久和累积认知障碍(3),包括大脑功能障碍影响学习、记忆、注意、执行功能和推理。这些障碍会直接损害患者的日常生活活动和生活质量,从而带来巨大的经济负担和严重的社会问题4]。然而,治疗策略能够有效地改善后肝性脑病的肝硬化患者的认知功能障碍还有待发现。
他的确切发病机制仍不清楚。研究调查了氨的协同效应对星形胶质细胞肿胀和脑水肿和炎症诱导氧化应激和线粒体损伤与其他因素的参与5,6]。Hyperammonemia能引起嗜中性粒细胞功能障碍,释放活性氧,引发氧化应激和炎症。与hyperammonemia在老鼠模型中,氨诱导海马星形胶质细胞和小胶质细胞的激活和释放脑源性炎症等因素进气阀打开,il - 1β和肿瘤坏死因子-α,从而损害脑内皮细胞,破坏血脑屏障。这将导致增加渗透性,协同作用与肠氨和脑水肿,加重神经炎症触发神经炎症,影响脑功能(7,8]。此外,异常等神经递质谷氨酸可以由改变相应受体的表达,从而导致认知障碍(9]。相关研究表明,抗炎治疗可以降低门静脉压力和改善小鼠认知功能,减轻炎性细胞因子(10]。MAPK的重要成员之一,p38MAPK扮演监管角色在神经元生长,大脑组织开发和心脏细胞生长(11]。Toll-1ike受体4 (TLR4)也扮演着一个很重要的角色,作为一个跨膜蛋白受体介导炎症先天免疫,这是各种致病病原微生物与宿主细胞识别(12]。TLR4明确其为病原体识别的分子模式(pamp)和跨膜信号转导提供其分子刺激信号通过骨髓分化细胞和触发一连串的信号因子88 (MyD88)。核转录因子的抑制单位kappa-B (NF -κB),我κBα,随后被磷酸化和退化,允许NF -κB我κBα分离到专门细胞核和绑定κB转录调控序列位于下游基因的启动子或增强子。因此,炎症相关的基因的表达将最终导致各种炎性细胞因子的释放和随后的炎症反应(13]。
切的主要治疗及时去除诱发因素和扭转的急性精神异常相对稳定状态(14]。乳果糖是一线代理在当前治疗指南推荐他。研究Karakan et al。15,16)表明,乳果糖可以改善患者的认知功能,减少他症状的发生率。然而,乳果糖的胃肠道副作用,使用有限,而且不建议长期临床应用由于其潜在的毒性和耐药菌株的发展。因此,一个更安全、更有效的治疗,他是十分必要的。针灸已经报道neuro-endocrine-immune网络中发挥监管作用下压力。机械化、针灸扫清了经脉,调节气和思想通过刺激穴位,调节神经递质和激素的释放和neuro-endocrine-immune系统。因此,它可以提高身体的能力,以应对与压力相关的伤害。此外,作为非侵入性的另类疗法,针灸可以直接影响到大脑的神经损伤和改善认知功能障碍(17,18]。然而,针灸治疗的价值和机制仍有待阐明。
核磁共振光谱(夫人),非侵入性方法探讨生化代谢大脑的变化,反映了化合物和代谢物的浓度在组织和细胞利用氢质子磁共振频率的差异在不同的化合物和共振峰的高度和面积(19]。夫人为早期诊断提供了新的方法和监控他的直接测量渗透浓度的物质,如分钟,曹和乙酰天冬氨酸。海马体是一个重要的功能区域的神经系统与学习和记忆密切相关。在这项研究中,通过观察电针刺激的效果(EA)炎症因素如il - 1的生产β肿瘤坏死因子-α,il - 6与认知障碍大鼠在切,我们探讨TLR4 / MyD88 / NF -的作用κB和p38MAPK / STAT3信号通路在改善CHE-related认知障碍大鼠接受EA,以及底层的机制和治疗靶点。
2。材料和方法
2.1。主要仪器和试剂
天冬氨酸转氨酶(AST)检测组件(批号:01 ast180109)、丙氨酸转氨酶(ALT)检测组件(批号:01 ast180108)和总胆汁酸(稍后通知)检测组件(批号:2401698)从上海购买华辰轴承科技有限公司,有限公司(上海,中国)。总胆红素(治疗组)检测组件(很多:180824101)、总蛋白(TP)检测组件(很多:2401106)和血清白蛋白(铝青铜)检测组件(很多:2400122)购买的医疗系统生物技术有限公司有限公司(中国宁波)。CCl四氯化碳(4)(批号:89106125),硫代乙酰胺(TAA)(批号:20160930),和橄榄油(批号:c10728873)购自上海化学工业区(中国上海);乳果糖(批号:h20103621)由四川Jianneng药业有限公司有限公司的苏木精和伊红染色检测组件())(批号:20180720)和血氨测定工具包(批号:2400505)是购自南京建成生物工程研究所(中国南京)。肿瘤坏死因子-α(60291 - 1 - ig), il - 1β(12703),il - 6 (12153), TLR4 (14358), MYD88 (4283), NF -κB (8242), p38MAPK (6417), (p) -p38MAPK (8690), STAT3 (9139), p-STAT3(9145)和间接宾语(SBJ_M0506)购买的细胞信号技术。特别固定帧鼠针灸实验(从北京购买全球生物技术有限公司),0.18毫米13毫米针灸针(批号:20071723;北京中研泰和医疗器械有限公司),在Huatuo SDZ-V脉冲针灸治疗仪器(上海华谊医疗器械有限公司),和西门子Skyra 3.0 t扫描仪用于磁共振光谱学。莫里斯Digbehv动物行为分析系统包括水迷宫,电脑的摄像系统,和软件分析系统,由上海Jilu购买软件技术有限公司。
2.2。实验动物和建模方法
50纯种雄性老鼠(200±20 g, SPF级)在价值上的实验动物中心上海中医药大学动物许可证号码SYXK(上海,2020 - 0009)和伦理委员会文件。:PZSHUCM200703001-were维持在无菌条件下动物设施。老鼠和实验过程的处理按照实验动物进行了指导方针。肝硬化大鼠模型建立了根据马泰之前报道协议et al。20.,21]。五十Wistar鼠随机分为正常对照组(n= 10)、模型组(n根据重量= 40)分层方法适应性喂养后一个星期。他模型建立与四氯化碳结合和硫代乙酰胺(TAA) 9周。模型组腹腔注射1毫升/公斤35%四氯化碳(稀释用橄榄油)每周两次。在第九周,TAA(3.5%, 250毫克/公斤)在每个小组每天注射2天。TAA注入大鼠后,任何的一个症状,如嗜睡、反应缓慢,志愿活动下降、共济失调、昏迷可以诊断为他。在建模之前,所有老鼠受到莫里斯水迷宫测试。在第九周建模后,老鼠与认知障碍筛查莫里斯通过水迷宫测试和随机分为不干预组(CCl4)和治疗组包括EA组(亚兰+ EA),乳果糖组(亚兰+ Lac)和EA CCl结合乳果糖组4+厘米),每组9老鼠。其中,治疗干预是在亚兰+ EA,三地4CCl +虫胶,4+厘米团体被视为介入组。9月底一周,三地4+ CCl Lac组和4+ CM组填喂法和乳果糖的剂量10毫升/公斤体重,而正常的控制和创新领导力4组强饲法同样体积的生理盐水每天一次21天,直到实验结束。所有免费用普通饲料喂养老鼠摄入的食物和水在研究期间。最后,在第12周的干预,测定大鼠的学习和记忆功能通过使用莫里斯水迷宫。
2.3。EA治疗
在9周的最后一天,EA CCl的老鼠4CCl + EA和4+ CM组。老鼠被放置在一个专用的固定剂对老鼠针灸和穴位选择指的是由教科书的实验针灸(22]。双方的皮肤区域的“点”(相当于“Zusanli点)”,“Baihui”,“被羞辱的穴位和75%乙醇消毒。穴位被接受一次性无菌针灸针(0.18×13毫米),每个点是扭曲和补充1分钟。针穿透深度约4毫米,这表明Deqi针灸。电刺激在“Baihui”和“被羞辱的”是由使用Hwato EA治疗仪器10赫兹的频率和强度1到2马(连续波)。的正极连接Baihui点,和负极连接到被羞辱的点,形成一个循环。的外观轻微震颤鼠四肢和EA的频率装置被认为是适当强度的标志。每个EA刺激持续了30分钟,每天一次连续21天。
2.4。莫里斯水迷宫实验
莫里斯水迷宫测试是用来测量每组大鼠的学习和记忆能力之前和之后与EA建模和治疗后。一个黑色圆池直径约150厘米,高60厘米,十字架是分为四个象限,即左上、右上、左下、右下。一个圆形的透明的平台和一个直径约12厘米放置在右上象限的中心,和的位置和大小平台记录作为目标区域。水放入池的高度高出2厘米的平台,和水温度调整到25±1°C。池里的水是沾碳墨水,这样老鼠看不到平台的位置。早上所有水迷宫实验进行了连续4天。定向航行测试:老鼠放到标记每次面临的水从任何象限,允许自由游泳找到60年代的水面下的平台。如果老鼠爬上平台在60年代,这一时期被记录为延迟。潜伏期是60年代,老鼠人为引导休息20年代的平台。也做过相同的程序在所有四个象限。空间探索实验:定向导航测试3天之后,圆柱形平台被和老鼠放入水中。 The computer automatic monitoring system tracked and recorded the number of times that the rats passed through the original platform position within 90 s, and the mean value of each group was taken for observation and comparative analysis. The escape latency and times of crossing the platform on the fourth day were used to assess the learning ability and memory of the rats.
2.5。核磁共振检查
MRI进行年底第三莫里斯水迷宫测试。西门子3.0 t Skyra磁共振扫描仪与特殊的线圈老鼠(上海Guangcheng公司;模型CG-MUC40-H300-AS)是利用核磁共振成像的老鼠。后与腹腔内3%戊巴比妥麻醉剂量的2毫升/公斤,老鼠被放置在线圈的卧姿,这样大脑位于线圈的中间部分。后常规横向和日冕T1WI和T2WI MRI扫描,1 h-mrs扫描进行[23]。使用单一的体素光谱(sv)刺激回波采集模式光谱学(蒸汽),大脑扫描了1 h-mrs TR / TE = 2000/9.53女士和转角度90°。平均收购时间是128年,扫描时间是4分25秒,和体素的大小是111厘米。扫描在老鼠大脑的海马本地化,头骨是可以避免的。VOI的匀场进行了水峰的半宽度小于8赫兹。与此同时,确定水的共振频率和输入化学位移选择序列。最优水抑制效应是通过调整脉冲励磁序列中的角。
扫描后,基线校准、信号平均、代谢物鉴定,代谢物峰曲线下的面积计算与软件连接到设备完成。代谢物的化学位移的位置如下:N-acetylaspartic酸(NAA): 2.01 ppm;碱复杂(Cho): 3.22 ppm;肌醇(mI): 3.22 ppm;肌酐的峰值(Cr): 3.03 ppm;谷氨酸acid-glutamine复杂(Glx): 3.75 ppm。曲线下的面积的比率每个metabolite-i.e。,NAA/Cr, CHO/Cr, MI/Cr, and GLX/Cr—were calculated with creatine (Cr) as the reference.
2.6。样品采集和处理
开颅后扫描,夫人是在全身麻醉下进行。左脑植入10%福尔马林固定,和右大脑海马区分开冷冻保存表。海马体在低温贮藏管放入液氮,储存在−80°C。采样脑组织脱水,嵌入式,切片沾)染色。病理变化的大脑组织在显微镜下观察。从腹主动脉血液样本收集,和部分血液与肝素钠作为抗凝治疗。血氨水平被发现在0.5 h。剩余的血液样本被放置在4°C 3 h在3000 r / min 15分钟离心之前,和血清得到存储在−70°C,供以后使用。
2.7。观察指标和检验方法
2.7.1。血清生化分析
老鼠与戊巴比妥麻醉,从腹主动脉和血液收集。血清氨的水平,治疗组ALT, AST,稍后通知,TP,铝青铜被测量按照南京建成生物工程研究所的设备说明。
2.7.2。评价脑损伤和病理
脑组织在neutral-buffered 10%福尔马林固定石蜡和嵌入。部分5μ米厚度上的幻灯片,deparaffinized与苏木精和伊红染色观察海马CA1区的组织学变化,是否有细胞坏死或神经变性。
2.7.3。实时聚合酶链反应
实时逆转录聚合酶链反应(rt - pcr)设计并合成引物由上海Sangon生物工程(中国上海)。引物的肿瘤坏死因子-α,il - 1β,il - 6,进气阀打开,TLR4、MyD88 NF -κB, P38MAPK,设计并合成STAT3 mrna BioTNT(上海,中国)。上述基因的信息和他们的引物序列见表1。从组织使用一个RNA提取的总RNA提取工具(MagExtractor)根据制造商的说明;和RNA浓度检测器之前纠正5μ每个样本被L, 2000年NanoDrop用来探测rna的浓度和纯度。提取总rna reverse-transcribed使用逆转录酶包根据制造商的指示。使用互补dna作为模板,使用10进行了放大μL SYBR绿色qPCR混合系统根据TOYOBO放大设备的指令。
第2.7.4。免疫印迹分析
脑组织(25μg)被添加到一个适当的卷里帕(包括蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂)和腌10分钟之前离心机在12000 rpm, 20分钟4°C,上层的收集。蛋白质浓度测定,样品准备使用加载缓冲区。sds - page电泳与恒流在300毫安,和阻塞的解决方案是申请了30分钟。一夜之间,主要的抗体被添加和孵化在4°C。主要抗体是il - 6(1:1000),伊诺(1:1000),p-p38 (1: 1000), p38 (1: 1000), TLR4 (1: 1000), MyD88 (1: 1000), NF -κB(1:1000)、肿瘤坏死因子-α(1:1000),il - 1β(1:1000),STAT3(1: 1000),和p-STAT3 (1: 1000)。产品与PBST洗3次,每次持续5分钟。二次抗体(1:3000)在室温下被添加和孵化1 h与PBST之前洗。PVDF膜放在图像扫描器,chromographic覆盖解决方案,反应1 - 2分钟。变色是用Photoshop软件,光密度值α的目标乐队进行了分析软件处理系统。β肌动蛋白作为内部参考,感兴趣的蛋白质的相对表达的灰度值的比值计算感兴趣的蛋白质内部的灰度值参考。
2.8。统计分析
统计分析了使用IBM SPSS软件,版本22.0(纽约阿蒙克)。测量数据被表示为平均值±标准偏差(x±年代)。单向方差分析是用于在多个组之间比较,和LSD -t测试是用于事后分析。 被认为是具有统计学意义。
3所示。结果
3.1。EA显著缩短了逃避延迟和穿越平台的数量增加
莫里斯水迷宫是一个经典的方法观察空间学习和记忆能力在实验动物模型中,动物的训练来导航到一个平台位于水面以下空间认知测试。在这项研究中,没有发现显著差异在水迷宫逃脱的延迟和穿越平台的数量 在大鼠建模。建模后,逃离CCl延迟的老鼠4组和治疗组显著延长 ,而穿越平台的数量减少 。四组中没有发现显著差异 。干预后,逃离CCl的延迟4组显著延长 与正常组相比,相反,CCl相比4CCl的逃脱延迟4CCl + EA,4CCl +虫胶,4+ CM组明显缩短 和穿越平台的数量增加 ,和同4+ CM组是最重要的,如图1。上述结果表明,EA改善学习和记忆障碍由他引起的。
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3.2。EA可以显著降低血清氨值和提高他的老鼠的肝脏功能
血氨代谢的障碍是他的一个重要致病的因素。丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、白蛋白(铝青铜)、总蛋白(TP)、白蛋白(铝青铜)、总胆红素(治疗组)是常用的肝功能的指标。这些指标可以有效地反映肝脏的炎症状态和肝细胞损伤的程度。与常规控制相比,血清水平的治疗,CCl ALT, AST,稍后通知4组显著增加 ,和TP和铝青铜的水平显著下降 。与此同时,CCl相比4组,治疗组的水平,CCl ALT, AST,稍后通知4CCl + EA,4CCl +虫胶,4+ CM组显著降低 和TP水平显著增加 ,而铝青铜CCl的水平4+ CM组显著增加 。CCl相比4在同华集团、AST水平4CCl + EA和4+ CM组显著降低 ,而治疗组和CCl ALT水平4+ CM组明显减少 (数据2(一个)- - - - - -2 (f))。与正常组相比,CCl血氨水平4组显著增加 。CCl相比4CCl组、血氨含量4CCl + EA,4CCl +虫胶,4平均+ CM组明显减少 ,和同4最重要的(图+ CM组2 (g))。这些结果表明,EA可以显著提高大鼠的肝功能和肝性脑病和改善脑水肿,降低血氨。
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3.3。EA CCl改善鼠引起的脑损伤4和TAA
他染色的脑组织海马的CA1区正常组的老鼠显示完整的结构和正常大小与缺乏异常细胞的神经元细胞;而在CCl老鼠的脑组织4组织了著名的坏死与核形态不规则,破坏细胞膜,细胞质体积减少,与细胞质凝聚染色质分散,固缩,神经元轴突瓦解。相比之下,那些创新领导力4CCl的老鼠4CCl + EA,4CCl +虫胶,4+ CM组明显改善大脑结构,特别是在创新领导力4(图+ CM组3)。
有10个大鼠正常组和9大鼠在无人干预组(三地4)和治疗组包括EA组(亚兰+ EA),乳果糖组(亚兰+ Lac)和EA结合乳果糖(三地4+ CM)组。他走时染色是用来评估脑部炎症的程度。)(×200)染色。
3.4。EA改善小鼠海马神经细胞代谢和肝性脑病
夫人是用于定量测量脑代谢物的变化。与正常组相比,增加Glx / Cr值和减少乙酰天冬氨酸/ Cr, Cho / Cr和mI / Cr值(所有 )CCl的观察4组。干预后,我们发现Glx / Cr值降低,增加Cho / Cr和mI / Cr值在所有治疗组(所有 ),特别是在创新领导力4CCl + EA组4+ CM组 (图4)。结果表明EA结合其他疗法可以调节乙酰天冬氨酸的代谢,Glx,曹在大鼠海马和他,从而提高学习和记忆的性能在莫里斯水迷宫。
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3.5。EA有效改善炎症在他老鼠通过抑制炎症因素如TNF -α、il - 6和il - 1β
炎症会加重认知障碍与氨。在这项研究中,信使rna和蛋白质的表达TNF -α,il - 1β,il - 6在CCl老鼠的脑组织4组与正常对照组相比显著调节 ;与此同时,CCl相比4组,TNF -的mRNA和蛋白表达α,il - 1β,il - 6在老鼠的脑组织在每个治疗组均明显下调 ,尤其是同4CCl + EA和4+ CM组 (数据5(一个)- - - - - -5 (c),6(一),6 (b),7(一))。因此,建议EA会抑制大脑的炎症反应,抗炎和炎症因素之间的不平衡。
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肝功能衰竭会导致毒素累积,血氨水平升高,和二次脑功能障碍(24]。血氨升高可以刺激伊诺表达,促进生产,增加脑血流量,导致星形胶质细胞水肿。CCl的老鼠4伊诺mRNA的表达组显著增加(与正常组, )。与此同时,在每个治疗组大鼠在脑组织伊诺mRNA的表达下调表达(CCl vs4组, );其中,在创新领导力的老鼠4CCl + EA和4+ CM组明显减少伊诺mRNA CCl相比4+ Lac组 (图5 (d))。
3.6。TLR4 / MyD88 / NF - EA激活κB信号通路
TLR4 / MyD88 / NF -κB信号通路是广泛分布于人体的各种组织和细胞,它可以调节炎症因子的表达在细胞25]。干预的各种目标TLR4 MyD88 / NF -κB信号转导通路被发现减少组织的炎症反应脑损伤(26]。我们的研究结果表明,与常规控制相比,TLR4的mRNA和蛋白表达,MyD88, NF -κCCl的老鼠的大脑4组显著增加(所有 ),虽然表情的他老鼠的大脑明显降低(所有 )。此外,信使rna和蛋白质TLR4的表达,MyD88, NF -κB在同4CCl + CM组相比明显减少4+ Lac组 (数据5 (e)- - - - - -5 (g),6 (c)- - - - - -6 (e),图7 (b))。我们的研究结果表明,EA可以减轻脑损伤大鼠和他通过调节TLR4 / MyD88 / NF -κB信号通路。
3.7。EA抑制p38MAPK / STAT3信号通路,从而减少了炎症反应
作为增殖蛋白激酶家族的重要成员,p38MAPK信号通路中扮演着重要的角色在炎症反应和细胞凋亡。STAT3 MAPK的被认为是一个可能的基质,这是细胞内的共同通路不同炎症细胞之间的信号传输和各种炎症介质和参与各种生物反应,如免疫反应和细胞增殖、分化、迁移和细胞凋亡27]。在这项研究中,针灸治疗3周后,p38MAPK mRNA和蛋白表达,p-p38MAPK, STAT3和p-STAT3 CCl老鼠的脑组织4组与正常对照组相比显著增加 ,表明MAPK和STAT3信号通路可能同时被激活的炎症反应。CCl相比4集团p38MAPK mRNA和蛋白表达,p-p38MAPK, STAT3和p-STAT3他在所有治疗组大鼠的大脑组织中明显减少 。CCl相比4+ Lac集团的表情p38MAPK p-p38MAPK, STAT3和CCl p-STAT3在4+ CM组显著下调 。在mRNA和蛋白表达水平无显著差异亚兰+ EA和创新领导力4+ Lac组 被发现(图5 (h),5(我),6 (f)- - - - - -6(我),7 (c))。总之,EA下调p38MAPK-STAT3 mRNA的表达和蛋白质通过激活p38MAPK-STAT3相关的信号通路,从而调节炎性反应在他的老鼠。
4所示。讨论
目前,他的发病机制尚不清楚,可能的理论包括中毒源于过多的氨,γ氨基丁酸酸、锰离子和伪神经递质,以及氧化应激和血清氨基酸不平衡(1]。氨中毒的主要理论,降低血氨水平作为一个重要的治疗策略治疗他。一项前瞻性临床研究显示血清氨和认知功能障碍[剂量依赖性关系28]。研究氨中毒的影响在他和神经损伤的发病机制已经取得了一些进展。一项研究[29日]调查慢性他在老鼠身上发现,降低血氨可以影响肝功能生物标记物的表达,炎症因子,凋亡基因,神经递质。最近,血氨和炎症介质的协同效应的起始和发展他吸引了更多的关注30.]。针灸,中医经典的治疗方法之一,有其独特的优点如多目标、多层次,全方位的治疗方法。针灸能治疗效果通过刺激身体的内部潜在的通过激活不同的监管机制。现代研究表明,针刺特定穴位可以发挥治疗作用,他通过抑制炎症反应,改善肝功能,降低血氨水平(31日]。此外,通过观察海马神经元形态和脑源性神经营养因子在大鼠慢性应激状态下,一项研究报告说,针灸改善应力状态下的中枢神经元的损伤和良性监管的影响脑源性神经营养因子(32]。然而,很少有研究调查的具体机制针灸疗法在减轻他的认知功能障碍。“Zusanli”穴位选择在这个研究是目前最常采用的穴位治疗肝脏疾病的研究(33]。此外,Baihui和被羞辱的穴位属于督脉,这被认为承担mind-awakening效果。初步的临床和临床前研究表明针灸的功效Baihui和被羞辱的穴位治疗认知功能障碍(34]。因此,这三个穴位被选为老鼠实验研究中。
我们使用莫里斯水迷宫调查与他认知障碍大鼠的空间学习和记忆。这是一个行之有效的方法用于测试认知障碍,尤其是在大鼠学习障碍。逃避潜伏期和平台交叉选择反映了认知变化。我们发现缩短逃脱延迟和数量的增加平台跨越EA治疗3周后在三地的老鼠4CCl +漆,4CCl + EA,4+ CM组,这表明EA可以刷新大脑和复苏,调节气的活动,放松肌腱和激活络脉,并促进经济复苏脑组织受损的老鼠,从而减轻大鼠的学习和记忆障碍与他认知障碍。
夫人技术利用氢质子磁共振频率的差异在不同的化合物和共振峰的峰高和面积来反映化合物浓度,以及组织和细胞内代谢,可作为早期诊断的指标他(35]。一般代谢物研究包括N-acetylaspartate (NAA),肌酸(Cr)和胆碱复杂(Cho)、谷氨酰胺和谷氨酸复杂(Glx),肌醇(分钟),等等。每个代谢物对不同的病理过程十分敏感。NAA峰主要存在于神经元,它可以反映神经元的密度和功能状态。曹高峰的标志细胞膜损伤和神经胶质细胞增殖和乙酰胆碱的前体,是一种重要的神经递质(36]。分钟的峰值是神经胶质细胞的标记,和赵的异常变化和mI山峰间接反映了星形胶质细胞内外的渗透压的变化。Glu大脑中最丰富的氨基酸和一个主要的神经递质。Glx复合高峰主要来源于重叠的共振峰的谷氨酰胺(Gln)和谷氨酸(Glu) [37]。因为Cr在大脑的水平仍相对稳定,Cr作为一个内部参数量化的水平Glx,分钟,曹和乙酰天冬氨酸。典型的变化他患者减少mI / Cr和Cho / Cr、增加Glx / Cr和乙酰天冬氨酸和乙酰天冬氨酸/ Cr(微不足道的变化38]。在这项研究中,我们发现,与正常组相比,mI / Cr,乙酰天冬氨酸/ Cr和Cho / Cr和Glx / Cr下降增加了模型组,与先前的研究结果一致,也呼应了他的氨中毒学说。底层机制可能是他患者肝功能异常可能会导致hyperammonemia,这就增加了血氨浓度和损害血脑屏障,从而增加谷氨酰胺合成星形胶质细胞,从而增加Glx高峰。大脑中的渗透压升高导致的神经元肿胀,引起脑水肿,进一步认知功能障碍(39]。因此,海拔Glx / Cr与他的严重程度密切相关。同时,谷氨酰胺的生产增加星形胶质细胞的渗透压和细胞弥补高渗透压排出渗透剂如Mi和曹,导致减少Mi / Cr和Cho / Cr比率。然而,乙酰天冬氨酸/ Cr值CCl的老鼠4集团被发现在这项研究中,减少表明他和晚期神经功能受损。这些结果进一步验证了他的老鼠模型的成功,反映脑代谢物的变化在他有一定的诊断价值。EA治疗3周后,Glx / Cr,乙酰天冬氨酸/ Cr, Cho / Cr, CCl mI / Cr明显减少4+ EA组,而乙酰天冬氨酸/ Cr, Cho / Cr和mI / Cr CCl相比显著增加4组。CCl相比4CCl + Lac集团4+ EA组没有显著差异,而创新领导力4+ CM组有最显著的影响。这些结果表明,脑代谢异常所示是可逆的,夫人和EA可以保护神经元,改善认知功能通过调节乙酰天冬氨酸的代谢,Glx,秋有他的老鼠。
炎症反应导致他在很大程度上的病理变化。最近的一项研究[40)已经证实,免疫炎症反应参与认知功能障碍的发生和发展。炎性细胞因子如TNF -α,il - 1β,il - 6主要贡献者病理生理过程通过维持慢性炎症状态和诱导炎症级联放大。肿瘤坏死因子-α诱发的细胞因子il - 1等“二次”β和炎症反应,从而刺激细胞因子il - 6级联反应和炎症的连锁反应。研究揭示了很强的相关性之间的TNF -α水平和他,从而表明TNF -α可以作为预测他严重41]。il - 6,也称为促炎因子,可以激活小胶质细胞和星形胶质细胞,导致神经元损伤诱导生产和认知障碍的神经毒素发射器。尽管炎性细胞因子如TNF -α,il - 1β,il - 6不能直接穿透血脑屏障,它们可以损害血脑屏障的通透性在一定程度上。同时,主动运输物质的大脑可能会导致大脑中星形胶质细胞肿胀和炎症反应。肝功能的损伤原因hyperammonemia,血氨浓度增加和妨碍了血脑屏障进入脑组织。增加大脑中的渗透压导致神经细胞的肿胀,引起脑水肿,表现为协同作用促进了他的发展。因此,有效的antagonization TNF -α,il - 1β,il - 6可能是一个治疗策略来减轻肝性脑病。
炎症反应可由多种信号通路,其中TLR4 MyD88 / NF -κB是一个主要途径协调全身炎症反应。在中枢神经系统,TLR4主要表达在神经胶质细胞。研究表明TLR4表达与血氨水平之间的关系,发现TLR4表达的抑制大鼠可以减轻血氨释放,从而防止他(42]。NF -κB是一种蛋白质复杂的广泛参与生物过程如炎症、细胞凋亡、免疫反应、细胞生长和发展。在巨噬细胞激活,上游TLR4触发细胞内信号转导,最终激活NF -κ通过刺激MyD88 B (43]。NF -κB激活可以进一步引发炎性细胞因子的释放,如肿瘤坏死因子-α,il - 1β,il - 6 (44]。一致,TAA-induced NF -κB表达被发现显著调节大鼠的肝脏与他(21]。在NF -κB激活,炎症因子释放可以反过来进一步激活NF -κB和放大炎症反应级联,从而产生了一个恶性循环,最终导致大量的肝细胞坏死。因此,合成、代谢和肝的解毒功能会阻碍和过多的氨和内毒素不能中和肝脏会进入血液循环。Hyperammonemia可以刺激一氧化氮合酶的表达(间接宾语),上调一氧化氮(NO)的生产,并增加脑血流量,从而导致星形胶质细胞水肿和中枢神经系统损伤45),最终导致认知功能障碍。另一方面,炎性细胞因子释放了NF -κB激活可以进入外周血循环加重感染和诱导系统性炎症反应,从而发挥重要作用在他与hyperammonemia协同发病和进展(46]。简而言之,NF -κB信号通路引起炎性因子的释放,增强肝脏炎症反应,加速肝功能损伤,从而导致他的发病机制。减轻炎症,在本地系统和肝脏,可以缓解他的严重程度。在这项研究中,我们评估EA治疗的作用在一个建立大鼠模型时,发现EA疗法降低il - 1β、il - 6和TNF -α水平在海马体,EA和药物显著下调伊诺mRNA和蛋白表达,TLR4 MyD88和NF -κCCl b相比4CCl + Lac集团4CCl + EA和4+ CM组有显著的影响。因为EA和乳果糖都是有效的治疗方法,EA和乳果糖有最好的效果。基于发现TLR4 / MyD88 / NF -κB信号通路在调节炎症反应起着重要的作用,通过NF - EA可以抑制炎症反应κB信号通路,我们推测,EA颅内炎症反应可能抑制TLR4 / MyD88 / NF -κB信号通路,从而提高他的认知功能障碍。
P38MAPK信号通路是一个增殖蛋白激酶家族的重要成员,可以激活各种压力刺激包括活性氧和炎症反应等过程中发挥着重要作用,细胞应激反应和细胞凋亡。有研究报道,包括p38MAPK信号通路发挥重要作用的发病机理和治疗他(47),抑制MAPKs可以提高他的认知功能在动物模型。激活p38和JNKMAPKs星形胶质细胞可能导致星形胶质细胞肿胀,影响谷氨酸摄取(48]。P38MAPK也是通过中介STAT3通路(抗炎和抗氧化作用49)通过直接磷酸化的丝氨酸残基STAT3-C终端,和STAT3因此被认为是一个可能的MAPK的基质。在某些刺激因素(如炎症和氧化应激)、MAPK和STAT3信号通路可能与此同时激活(50]。在这项研究中,CCl相比4集团p38MAPK mRNA和蛋白表达,p-p38MAPK, STAT3和p-STAT3他在所有治疗组大鼠的大脑组织中明显减少 。CCl相比4+ Lac集团的表情p38MAPK p-p38MAPK, STAT3和CCl p-STAT3在4+ CM组显著下调。因此,p38MAPK-STAT3信号通路被激活。EA治疗减轻磷酸化p38MAPK和STAT3引起CCl治疗相结合4硫代乙酰胺和表达下调p38MAPK和STAT3 mrna的表达,以及它们的磷酸化蛋白质。此外,在大鼠肝脏病理损伤他被EA缓解治疗。这些结果表明,p38MAPK-STAT3信号通路参与他和EA的规定可能通过调节抗炎和抗氧化作用p38MAPK-STAT3信号通路,从而提高他的认知障碍。
此外,至于夫人之间的关系,氨、肝功能指标,血清和脑组织中某些基因的表达和蛋白质,TNF的表达α,il - 1β、il - 6和TLR4与血清中氨浓度呈正相关,肝性脑病大鼠模型。血清氨和炎症介质作用影响的发生和发展,他通过皮尔森相关分析和文献综述。氨是一种神经毒素,导致多种神经系统并发症,导致氧化应激和脑水肿(触发神经炎症51]。炎症是许多人类神经系统疾病的发病机制的核心包括他。系统性炎症诱发和加剧了他的一个关键球员,可能通过使大脑更容易并发hyperammonemia [52]。活化的小胶质细胞也释放促炎介质(如细胞因子TNF -α、il - 6和il - 1β),也直接关系到脑功能障碍(45]。之前报道,激活TLR4发起NF -κB通路,因为它刺激促炎细胞因子的表达TNF -α、il - 6和il - 1β星形胶质细胞肿胀,最后导致他(53]。反映了脑代谢物的变化如夫人分钟和Glx肝性脑病的诊断。Kooka等人的研究表明,血氨水平与曹夫人和分钟水平负相关和正相关Glx水平(39]。大脑Glx水平与血清TNF -极显著的正相关关系α和il - 6水平。肿瘤坏死因子的增加α和il - 6水平可能增加Glx在星形胶质细胞的积累,促进脑水肿的发生。他染色反映脑组织星形胶质细胞和神经元的变化。这个实验还表明,EA神经保护作用,可以改善脑损伤。ALT, AST,治疗组等,都是典型的生化测试指标,可以有效地反映肝脏的炎症状态和组织细胞损伤的程度。相关分析表明,血清TNF -α、il - 6和il - 1β水平不显著相关肝功能指标如AST、ALT、治疗组和铝青铜。原因可能是由于小样本大小,仍然需要大量的实验研究。
5。结论
总之,炎症和hyperammonemia的协同作用可以在他进一步加重认知功能受损。治疗与EA可以降低血氨水平,调节炎症因子,改善脑坏死和凋亡,改善认知障碍通过调控TLR4 / MyD88 / NF -κB和p38MAPK / STAT3信号通路。夫人可能是他的诊断价值及对针灸疗效的评价。在本研究的范围有一定的局限性,这是相对简单的较复杂的发病机制涉及多个炎症反应通路。未来的研究应采用多通道功能成像技术,扩大样本容量,设计严谨的实验方法进一步探讨针灸改善认知功能障碍的机制。
数据可用性
使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突。
作者的贡献
黄JL执行大部分的实验,分析数据,并参与了手稿草案。香港YN统计提供建议。龚ZG黄YW,王H帮助完成许多实验。康YJ和詹SH设计手稿的研究和起草和定稿。所有作者阅读和批准最终的手稿。
确认
作者感谢所有的参与者和他们的家庭参与和贡献研究和放射学重点实验室部门(上海中医药大学)提供实验支持。这项研究得到了国家自然科学基金(81573782)和上海科委2018年“科技创新行动计划”项目(排名18401970300)临床医学领域。