文摘

目的。该研究旨在识别的活性成分石榴l .减轻缺血/再灌注损伤和澄清活跃组件的底层机制减轻缺血/再灌注损伤。材料和方法。oxygen-glucose剥夺的SH-SY5Y细胞模型/复氧(OGD / R)成立模拟缺血/再灌注损伤。根据获得的策略隔离,punicalin的活性成分石榴l .被确定。流式细胞术和免疫印迹是用来评估的影响OGD / R和/或punicalin细胞周期阻滞。免疫荧光分析应用于评估核易位。ROS的相对含量及谷胱甘肽和猫和SOD酶活性用ELISA检测。结果。获得的数据表明punicalin隔离石榴l可以缓解OGD / R-induced SH-SY5Y细胞的细胞损伤。流式细胞仪分析和探索CDK1的表达蛋白免疫印迹,p-CDK1,细胞周期蛋白B1, p21和透露,punicalin可以缓解OGD / R-induced细胞周期G0 / G1逮捕。此外,免疫荧光试验和免疫印迹探测TGF -的表达β和p-Smad2 / p-Smad3表明punicalin可以缓解OGD / R-induced TGF -β/ Smad通路。此外,TGF -β/ LY2157299 Smad通路抑制剂来确认TGF -β/ Smad通路punicalin的影响是至关重要的。最后,这是表明punicalin可以缓解OGD / R-induced氧化应激。结论。Punicalin,一个活跃的组件石榴l,was identified as a protective agent to alleviate the OGD/R-induced cell injury, which could exert the protective effect via TGF-β/ Smad pathway-regulated SH-SY5Y细胞氧化应激和细胞周期阻滞。

1。介绍

脑缺血性中风是一种脑损伤疾病症状的半身不遂,认知障碍,和残疾,这是由于堵塞血管导致脑血液供应不足(1]。它占了全世界大约有三百万个人死亡在2015年,和死亡率仍在逐年上升,严重威胁着人类的生命和安全。溶栓是治疗缺血性中风的主要策略之一,和重组组织纤溶酶原激活物(rtPA)作为血栓溶解剂现在通常用来减轻缺血性中风通过溶解血管内血栓(2,3]。虽然rtPA的使用提供了一个在缺血性症状缓解,也引发更严重的副作用的脑损伤和神经障碍称为缺血/再灌注损伤(IRI)。几个碎片的证据表明氧化应激、细胞凋亡、细胞周期阻滞和钙超载可能参与IRI (4,5]。然而,复杂的病理机制仍然是难以捉摸的,这也限制了IRI药用剂的发展。因此,紧急和重要的是阐明IRI进步和识别潜在候选人IRI的临床治疗。

TGF -β/ Smad途径被认为是一个生长因子的信号级联反应过程维持个人的生理和病理的动态平衡。它扮演着许多重要的角色在细胞增殖,凋亡,氧化应激,炎症,参与一系列的疾病活动,比如癌症,糖尿病,心脑血管疾病(6,7]。最近的碎片的证据表明,TGF -β可以作为一个伤害有关细胞因子参与脑损伤和神经退行性疾病。Abdel等人报道,蜂胶能减轻脑损伤通过TGF -的规定β/ Smad途径[8]。另一项研究表明,TGF -β/ Smad通路参与了脑后IRI异氟烷暴露(9]。这些发现暗示我们,TGF -β/ Smad通路可能是其中一个至关重要的部分在IRI的进步。因此,识别TGF -β抑制剂将是一个潜在的战略发展医药代理IRI治疗。

石榴l。(PGL),也叫石榴,被广泛认为是一种可食用的水果数百年来在地球。最近,增加碎片PGL的证据表明,有许多生物活性,包括抗炎和抗氧化作用和产生一个巨大的效益在治疗和预防疾病,如糖尿病、癌症、心血管疾病、和缺血损伤(10,11]。成分分析表明,有一系列的活性化合物含有原花青素,corilagin,鞣花酸,在PGL punicalin退出。据报道,在这其中,原花青素对小鼠的脑损伤有保护作用通过减轻细胞凋亡,氧化应激,诱导血管生成(12,13]。Corilagin拥有oxidation-inhibiting和angiogenic-evoking效果改善脑缺血(14],鞣花酸可以减轻脑损伤通过调节神经元细胞凋亡和恢复大脑血屏障(BBB) [15]。前面提到的信息表明,PGL可能是一个潜在的药用价值的宝库代理商的开发对于疾病的治疗尤其是IRI。

在这里,我们建立了一个oxygen-glucose剥夺/复氧(OGD / R)模型在模拟人类神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y IRI,确定一个TGF -β抑制剂punicalin减轻OGD / R-induced PGL提取神经母细胞瘤损伤,并阐明通过TGF - punicalin-suppressing细胞损伤的机制β介导的氧化应激和细胞周期阻滞。目前的研究显示TGF -的作用βIRI发展和治疗和提供了IRI的新治疗方法。

2。材料和方法

2.1。化学药品和试剂

DMEM培养基(猫没有。C11995)和的边后卫(猫no.10099 - 141)买来Gibco(美国)。MTT试剂和碘化propidium(π,猫没有。P8080)获得Solarbio(中国)。的主要抗体CDK1(猫没有。ab133327)、p-CDK1(猫没有。ab201008),细胞周期蛋白B1(猫没有。ab32053)、p21(猫没有。ab109520), TGF -β(猫没有。ab215715)和Smad 2 / Smad3(猫没有。ab202445)和二级抗体购自Abcam(美国)。的染料DAPI 268298号(Cat)购买的σ(美国)。ROS的ELISA检测工具(猫没有。E004-1-1),猫(猫没有。A007-1-1)、谷胱甘肽(猫没有。A005-1-2), SOD(猫没有。A001-3-2)获得南京建成生物工程研究所(中国)。LY2157299(猫没有。 HY-13226), a TGF-β抑制剂,从MedChemExpress购买”(MCE)。有机溶剂乙醇、石油醚、氯仿、乙酸乙酯是化学试剂购自国药控股有限公司有限公司(中国)。

2.2。的制备石榴l。提取

的水果石榴l .购买从农贸市场在哈尔滨城市,种子被带出去了。收集到的种子在真空干燥箱和地面干粉末使用破碎机械。粉(500克)和2.5 L 60%乙醇回流并提取了2小时,并提取重复三次。提取的解决方案是合并,并且在旋转蒸发,蒸发没有酒精的味道。之后,乙醇提取与石油醚提取,氯仿,乙酸乙酯,分别获得三个分数的PE, CF, EA,三个分数干固体旋转蒸发,和活跃的化合物被确定根据bioactivity-guided隔离。

2.3。细胞培养

人类神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞从细胞资源中心,购买上海生命科学研究院和中国科学院。SH-SY5Y细胞在DMEM培养媒介的边后卫10%和5%股份有限公司的条件₂在37°C。

2.4。OGD / R-Induced细胞损伤模型的建设

SH-SY5Y细胞被播种到6-well板与glucose-free DMEM培养基中培养。文化条件有限公司5%₂,1%的人啊₂,94% N₂在37°C 6小时。然后,媒介取代了正常的DMEM培养基和培养在正常大气5%的股份有限公司₂另一个24小时reoxygenate。

2.5。MTT试验

SH-SY5Y细胞被播种到96孔板和培养12小时。然后,种子细胞治疗OGD / R和石榴l/punicalin at the response concentration for the specific time. After treating, the cells were added with 20 μL MTT(5毫克/毫升),培养3小时,100年和稀释μL DMSO, OD值是读取使用标(Peiqing,中国)。增殖率是使用Microsoft Excel软件计算

2.6。EdU公司分析

SH-SY5Y细胞被播种到12-well板和培养12小时。然后,种子细胞治疗OGD / R和石榴l/punicalin at the response concentration for the specific time. After treating, the cells were added with 300 μL EdU介质(50μ米),培养另一个2小时,洗两次与PBS。细胞图像捕获与荧光显微镜(日本尼康)。

2.7。细胞周期分布分析

SH-SY5Y细胞被播种到6-well板和培养12小时。然后,种子细胞治疗OGD / R和punicalin的具体时间了。治疗后,这些细胞被消化成信号状态的细胞,收集细胞1.5毫升管,固定precold 70%酒精在室温下30分钟,染色和π30分钟。染色细胞被流式细胞术检测(美国贝克曼)。

2.8。西方墨点法

SH-SY5Y细胞被播种到6-well板和培养12小时。然后,种子细胞治疗OGD / R和punicalin的具体时间了。治疗后,细胞使用•瑞帕裂解缓冲细胞溶解,离心,收获总蛋白。总蛋白受到的sds - page分离、蛋白质转移到PVDF膜,阻止了PVDF膜有5%的脱脂牛奶,孵化CDK1主要抗体,p-CDK1,细胞周期蛋白B1, p21, TGF -β一夜之间,p-Smad2 / Smad3在4°C,与TBST清洗三次,孵化响应二次抗体室温1小时,洗了三遍,最后探讨了ECL试剂。

2.9。免疫荧光

SH-SY5Y细胞被播种在12-well板片和培养12小时。然后,种子细胞治疗OGD / R和punicalin的具体时间了。治疗后,切片用甲醛固定,穿孔triton x - 100方案,固定BSA,孵化主要Smad3抗体和二次抗体室温,并与DAPI染色和密封。最后,使用共焦显微镜切片检查。

2.10。统计分析

数据表示为均值±SD和执行分析SPSS软件(美国)。统计学意义的定义是 。

3所示。结果

3.1。的影响石榴l .提取在SH-SY5Y OGD / R-Induced细胞损伤的细胞

细胞形态和增殖率的变化是外观指标来评估细胞损伤。显微镜照片(图1(一))表明,SH-SY5Y细胞的轮廓让OGD / R治疗是分散和模棱两可,和被拒绝与SH-SY5Y细胞在正常对照组(NC)。石榴l。提取在不同浓度的1毫克/毫升和2毫克/毫升改善细胞形态学变化引起OGD / R。MTT试验(图1 (b))透露,让活细胞数量的补充2毫克/毫升石榴l。提取24、48和72小时接近正常对照组和显著高于OGD / R组( 48小时, 72小时)。DNA合成决定细胞增殖和数量,间接反映出细胞损伤。此外,EdU公司试验来评价DNA合成。如图1 (c)EdU的比例掺入OGD / R组相比明显抑制,在正常对照组( )在SH-SY5Y细胞。石榴l。提取管理不同剂量诱导的抑制OGD / R改善,和2毫克/毫升石榴l。提取了EdU掺入比例从0.46到0.80 ( )。结果表明,石榴l。提取可以缓解OGD / R-induced SH-SY5Y细胞的细胞损伤。

3.2。Punicalin作为活性成分的识别石榴l .提取

获得隔离来确定活性成分与潜在的对抗OGD / R-induced细胞损伤石榴l .粉样品用乙醇提取获得乙醇提取物(EE)。导致乙醇提取是分馏石油醚(PE)、氯仿(CF)、乙酸乙酯(EA)。提取路线如图2(一个)。然后,乙醇提取的保护作用和扩散三个分数对细胞损伤评估的测试。如MTT数据的图所示2 (b),OGD / R抑制人类神经母细胞瘤的增殖SH-SY5Y细胞( ),和乙醇的提取和EA分数表现出特定的减轻OGD / R-induced增殖抑制( )。接下来,EA分数受到在硅胶柱层析法的流动相chloroform-methanol解决方案和制备高性能液相的流动相(pHPLC)甲醇-水获得几个化合物。孤立的化合物对细胞损伤的保护活动MTT试验检测(数据没有显示)。预期被确认为punicalin活性化合物,结构如图2 (c)。

3.3。Punicalin对OGD / R-Induced细胞周期阻滞

为了更好地理解的作用在人类神经母细胞瘤punicalin SH-SY5Y细胞让OGD / R,细胞周期分布及其标记蛋白质进行测试,分别通过流式细胞术和免疫印迹。流式细胞术(图3(一个))显示,细胞治疗OGD / R展出G0 / G1逮捕和G0 / G1期的比率从24.7%上升到37.4%,与正常对照组相比。punicalin预曝光后在不同浓度的比值G0 / G1期的10μM和20μM,分别为37.6%和28.9%,高剂量的punicalin缓解G0 / G1期比率的上升OGD / R组。蛋白质标记表达式反映G0 / G1期进展(图3 (b))表明,OGD / R会抑制细胞周期蛋白B1的表达和细胞周期蛋白依赖性激酶CDK1诱导p21的表达和CDK1磷酸化。Punicalin在20μ改善OGD / R-mediated表达细胞周期蛋白B1, CDK1, CDK1 p21和磷酸化,与细胞周期阻滞的数据是一致的。这些结果表明,punicalin可以缓解OGD / R-induced细胞周期在SH-SY5Y细胞G0 / G1逮捕。

3.4。TGF - Punicalin效果β在SH-SY5Y细胞信号通路

TGF -β信号通路激活通常是通过生物刺激,引起的磷酸化和核本地化Smad2 Smad3,诱导相关基因表达后,随后导致生理病理学包含IRI的发生。评估的影响确定候选人punicalin TGF -β信号通路,免疫印迹和免疫荧光试验被用来检查TGF -水平β,磷酸化Smad2 Smad3, Smad3核本地化。图4(一)表明OGD / R诱导TGF -β表达较正常对照组和20μ米的感应punicalin抑制TGF -β表达式由OGD / R SH-SY5Y细胞。同样,Smad2的磷酸化和Smad3引起OGD / R,和高剂量的punicalin改善磷酸化的感应。此外,免疫荧光图像(图4 (b))表明,OGD / R促进了易位的Smad3细胞质细胞核;与此同时,punicalin 20μM浓度缓解Smad3提拔的核易位OGD / R。综上所述,OGD / R可以激活TGF -β信号通路,punicalin拥有的能力减弱TGF -的激活β在SH-SY5Y细胞途径OGD / R。

3.5。TGF -的作用β在Punicalin的影响途径OGD / R-Induced细胞损伤

上述数据表明,punicalin可以缓解OGD / R-induced神经母细胞瘤损伤和TGF -β信号通路。结合的碎片TGF -的证据β调节脑损伤进展,推测了TGF -β途径可能参与的影响上punicalin OGD / R-induced神经母细胞瘤损伤。确认TGF -的作用β通路punicalin减轻OGD / R-induced细胞损伤,LY2157299采用抑制TGF -作为一种工具代理β在SH-SY5Y细胞通路。MTT分析折线图所示(图5(一个)),扩散比率punicalin组高于OGD / R组,和p值分别 48小时, 为72小时。结合补充punicalin LY2157299表现出只有一窝促进细胞增殖而OGD / R组和无显著差异甚至72小时SH-SY5Y细胞。此外,EdU公司化验(图5 (b))表明,punicalin相比大大提高了DNA合成OGD / R组( ),和合并后的补充punicalin LY2157299没有提出对DNA合成的影响。这些结果表明,TGF -β通路参与的影响punicalin减轻OGD / R-induced神经母细胞瘤在SH-SY5Y细胞损伤。

3.6。上Punicalin OGD / R-Induced氧化应激的影响

此外研究punicalin对氧化应激的影响在OGD / R-induced神经母细胞瘤损伤,ROS的指标,猫,销售税,SOD(图反映了氧化应激水平6(一))使用ELISA试验检测。见数据6 (b)- - - - - -6 (e),OGD / R ROS的相对含量,抑制猫谷胱甘肽的相对水平,减少了SOD酶活性较正常对照组。最少、punicalin抑制活性氧含量的感应OGD / R的抑制和缓解猫,谷胱甘肽水平和SOD酶活性。这些数据暗示punicalin可以改善OGD / R-induced人类神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞氧化应激的计划总结机制punicalin衰减OGD / R-induced神经母细胞瘤损伤如图7。

4所示。讨论

缺血/再灌注损伤被认为是大脑和血管并发症三角的溶栓治疗缺血性中风,这严重威胁了人类的健康和幸福。最近的研究表明,一些中药和食用植物,如Qingkailing注入(16),益气Tongluo颗粒(17),而Crepidiastrum denticulatum提取(18),可以减轻缺血/再灌注损伤。石榴l。是一种可食用的水果与数百年来大量的生物活性。据报道,石榴l .可以防止肺的损伤,肾脏、心肌(10,19]。然而,的影响石榴l .提取及其对缺血/再灌注损伤的活性成分仍然很少报道。在当前的研究中,OGD / R SH-SY5Y细胞模型建立了模拟IRI。这是应用于屏幕IRI的保护剂石榴l获得的战略孤立。有趣的是,一个活跃的组成部分punicalin发现抑制OGD / R-induced细胞损伤。这一发现扩展的营养价值石榴l .,还提供了一个可能和替代机会缺血/再灌注损伤的预防和治疗。

Punicalin被公认为单宁家族的一个成员存在明确的壳,种子和叶子石榴l .药理研究表明punicalin拥有抗氧化的功能,防止肝损伤和消除炎症20.,21]。据报道,punicalin可以缓解对乙酰氨基酚或碳tetrachloride-induced肝损伤通过其抗氧化和王亚南活动(22,23]。然而,punicalin对缺血/再灌注损伤的影响及其潜在的机制了解甚少。在这个研究中,我们发现punicalin可能缓解OGD / R-induced通过TGF -细胞损伤βpathway-mediated SH-SY5Y细胞氧化应激和细胞周期。

TGF -β/ Smad途径广泛存在于多种组织和细胞,在癌症的发展起着至关重要的作用,糖尿病和脑损伤。TGF -β/ Smad通路引发的磷酸化Smad2 / smad3和触发器的转变smad3从细胞质到细胞核,唤起后相关基因表达,导致病理过程。在目前的研究中,我们发现OGD / R诱导的表达TGF -β的磷酸化Smad2 / Smad3和核易位SH-SY5Y细胞;与此同时,punicalin逆转这些变化趋势。结果表明,TGF -β/ Smad途径可能参与OGD / R-induced细胞损伤和punicalin通过TGF -可以减轻细胞损伤β/ Smad通路。

细胞周期的特点是细胞生物过程划分成两个子细胞,其中包括监管蛋白质的充足和编程事件包括CDKs和细胞周期蛋白的表达和互动24]。它参与所有的生理行为的分化、增殖,发展和增长的受精卵和胚胎个人死亡24- - - - - -26]。细胞周期的失调会导致许多疾病,癌症和缺血/再灌注损伤(27- - - - - -29日]。一些碎片的证据也表明,TGF -β/ Smad通路可能发挥监管作用控制细胞增殖的细胞周期和细胞死亡30.,31日]。在当前的研究中,细胞周期分布分析显示,OGD / R诱导细胞周期G1期逮捕和punicalin可以缓解诱导细胞周期阻滞。它进一步证实punicalin可以反向OGD / R-regulated CDK1的表达和细胞周期蛋白B1,细胞周期G1 phase-related蛋白质。结合上述数据的TGF -β/ Smad途径,推测TGF -β/ Smad通路可能涉及OGD / R-induced细胞周期G1逮捕,punicalin可以缓解OGD / R-evoked通过TGF -细胞损伤β/ Smad pathway-mediated细胞周期阻滞。

氧化应激被认为是其中一个关键贡献个人衰老和疾病进展。时的氧化平衡身体倾斜,这将引发大量的中性粒细胞的浸润炎症,产生氧自由基,并导致大分子的障碍,包括蛋白质、DNA和脂质氧化应激。ROS增加内容,减少谷胱甘肽含量和SOD酶活性氧化应激的指标。新兴碎片的证据显示,缺血/再灌注损伤与氧化应激有关。很多代理,包括薯蓣皂苷,α生育酚,irisin,据报道对缺血/再灌注损伤起到保护作用通过氧化应激(32- - - - - -34]。

此外,有一个可接受的氧化应激和TGF -之间的串扰β/ Smad通路。它被报道,TGF -β/ Smad途径可以调节许多病理行为与氧化应激损伤有关。我们的数据显示,OGD / R活性氧含量和抑制谷胱甘肽含量,猫和SOD酶活性,而punicalin松了一口气的规定OGD / R SH-SY5Y细胞。在一起,这些结果表明punicalin可能缓解OGD / R-evoked通过TGF -细胞损伤β/ Smad pathway-mediated氧化应激。

5。结论

总之,目前的研究发现punicalin的活性成分石榴l .对抗OGD / R-induced细胞损伤和澄清的底层机制punicalin可以缓解OGD / R-induced通过TGF -细胞损伤β/ Smad pathway-regulatory氧化应激和细胞周期阻滞。这项研究扩展的营养价值石榴l,improves the understanding to the bioactivities and mechanism of punicalin, and provides a potential and alternative choice to the prevention and treatment to ischemia/reperfusion injury.

数据可用性

使用的数据来支持本研究的结果包括在本文中。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

确认

本研究由国家自然科学基金支持(82074539,82074539,81873378)和黑龙江省自然科学基金(LH2020H092)。