临床和抗菌评价Copaifera langsdorffiiDesf。儿童牙齿清漆的临床研究

摘要

背景．本研究的目的是评价(c . langsdorffii)在患蛀牙风险高的儿童身上涂上牙漆。方法．这是一项纵向、随机、对照的临床试验。选取90例无龋高危儿童(ICDAS II = 0)，随机分为3组:c . langsdorffii氯己定或氟化物。在第二颗乳牙上涂刷三次:基线(D0)、90天后(D90)、180天后(D180)。分别于D0、D90、D180、D360采集唾液进行评价变异链球菌减少。通过方差分析、Tukey检验和配对进行统计t以及。结果.科帕伊巴清漆显示出显著的变异链球菌削减:360对0 ，D180与D0 ，D360与D90 ，D180与D90 ，D360和D180 ．洗必泰清漆明显减少变异链球菌D180对D0 ．氟在D180和D0时降低 ．结论.该清漆的三次年度应用表明其对细菌具有显著的抗菌活性变异链球菌以及长达12个月的蛀牙预防。

1.介绍

药用植物具有巨大的生物多样性和药理多样性，是药物开发的重要目标[1]．目前已编目的生物活性分子超过1亿，由于尚未开发的可能的化学排列和资源，这个数字可以被认为是无限的[2]．

科柏属豆科，凯撒亚科，科Copaifera属，树龄可达400年。该油树脂呈黄褐色，含有倍半萜和二萜等多种活性成分，具有抗炎、镇痛、抗菌和抗肿瘤的特性[3.]Copaiba油树脂已被广泛使用，尤其是在新热带地区发现，那里的蜜蜂的蜜蜂物种是主要的传粉媒介。科派巴油树脂的使用已有近400年的记录，多项研究证明其具有无数的生物活性，对多种微生物都有有效的防治作用，并在传统医学中广泛用于防治多种疾病[3.，4]．

属Copaifera广泛分布于南美、中美洲、印度和西非。物种最丰富的是巴西，在那里，树木可以在东南部、中西部和亚马逊地区发现。在72种被分类的物种中，已有20种在巴西发现，其中16种是巴西独有的，被认为是一种食物，因此证明了其广泛的传统流行用途证明了其安全性。其中有Copaifera officinalisLCopaifera guianensisDesf。，Copaifera试Ducke,Copaifera multijuga海黄连Benth。Copaifera langsdorffiiDesf。（c . langsdorffii)，Copaifera coriacea集市。,黄连［3.，5，6]．

c . langsdorffii油树脂对革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌有效，特别是外用。此外，亦强调其对致龋细菌的有效作用[7]．由于主要口腔疾病、龋病和牙周病与口腔生物膜密切相关，因此科拜巴油树脂对口腔细菌具有较高的活性，可适当配方使用。然而，必须对这些制剂的体外和体内试验进行充分研究[5]．

龋齿是世界上最流行的疾病，当它发生在6岁以下儿童时被称为幼儿龋病(ECC)。这种情况特别影响乳齿第二磨牙，因为它们的咬合形态有利于细菌菌斑的积累[8，9]．即使扩大了获得保健服务的机会，幼儿蛀牙(ECC)仍然是一个公共卫生问题[10，是乳牙过早脱落的主要原因，对语言、美学、咀嚼系统和牙弓有负面影响[11]．

预防口腔疾病的主要产品有氟化物、氯己定、三氯生、氯化十六烷基吡啶以及天然产品，特别是具有抗菌活性的提取物和精油。它们也被用作治疗龋齿的替代方法[12- - - - - -14]．

牙齿生物膜是龋齿发生的主要生物学决定因素，唾液微生物群与龋齿有关[15，16]．几种微生物在牙科生物膜上定植变异链球菌与龋齿密切相关，在唾液、舌头、口腔粘膜和牙菌斑等所有生态位中均有发现[17]．摄入蔗糖后，变异链球菌产生胞外多糖，具有产酸和酸性，能在不利条件下生存。口腔呈现几种基因型变形链球菌（变异链球菌)具有不同毒力能力[10，18]．因此，尽管它们不是参与这一过程的唯一因素，但它们是形成牙科生物膜的关键因素，可以被认为是唾液生物标志物[19，20.]．

除了公共饮水加氟等政策和对难以获得牙科和含氟服务的高危群体的战略之外，还应实施健康行为方法和宣传，以预防公共卫生中的龋齿[9]．我们也知道，防止乳牙的龋坏会防止恒牙的形成。在目前的微创牙科发展模式中，认为龋齿可以通过几种产品以非侵入性的方式来控制和预防，其中可以提到清漆[17，21]．

为六岁以下的儿童还没有适当的习惯“冲洗和随地吐痰,”最合适的配方对预防龋齿病在这个年龄会清漆,而不是一个冲洗援助或凝胶,也因为他们的高保留能力和活动原则的缓慢释放。

在文献中未发现关于使用基于copaiba的清漆的报道，因此，本发明专利申请是根据BR 1020160212628协议提交的。本研究的目的是评价其临床和微生物学效果c . langsdorffii儿童牙齿清漆易患龋齿。

2.材料和方法

2．1．苦配巴香脂Oilresin

科派巴油树脂样品从Copaifera langsdorffiiDesf。(豆科:Caesalpinioideae)植物材料沉积在马托格罗索州联邦大学的植物标本,席尔瓦,r . r . et al . 1749年,马托格罗索州和联邦大学的接收最初来自纳瓦莱(中西部地区:纬度:10°19日05”年代,经度:58 21°32”W和高度:300米)。化学成分由西阿拉联邦大学化学系的专家鉴定(GC-MS QP 5050，岛津，日本)。生物活性成分总含量为84.69%。主要化合物为氧化石竹烯(54.2%)、β-caryophylene (6.08%),β-元素(4.43%),，α-顺式佛手烯(4.56%)和ar-姜黄烯(4.63%)。

2．2．临床研究

这是一项纵向、平行、随机、双盲对照临床试验。为了改进研究方法，遵循CONSORT检查表的规则。

２．３．本地和人口/伦理方面

这项研究得到了塞亚拉联邦大学伦理委员会(UFC)的批准，编号为195.096。临床阶段发生在Aracati-CE-Brazil市，该市只有0.8%的人口使用了含氟公共水。家长被邀请参与他们的搜索，然后被告知，以便签署明确和知情的同意书。人口选择(90名儿童)是通过临床检查的病人在公立学校和日托中心,在那里孩子们免费龋齿(ICDAS 2 0) 4主要爆发第二磨牙,36岁至71个月,无论男女,都包括在内。检测由单一研究人员进行，校准ICDAS II (kappa指数0.78)。高危龋病分类依据美国儿科牙科学会(AAPD, 2014)的标准进行[22例如，一天吃糖三次以上、缺乏含氟水、存在可见菌斑、口腔卫生差以及没有去看专业牙医。排除标准为研究开始前3个月存在任何颊部或全身疾病或使用任何抗生素或抗菌素。

２.４.清漆的准备

科帕伊巴油树脂是在塞阿拉联邦大学药剂学、牙科和护理学院药剂学课程的药理学实验室以标准化的方式配制成一种清漆，以获得颜色、气味、稠度和味道的相似性。

最初进行了一项初步研究，以获得剂量-反应曲线[23]。首先检查主要研究中使用的浓度（1%）是否具有最大的细菌相对还原能力（%）。所有清漆均储存在试管中，并用字母表的字母编码，以确保本研究中的盲法。

2．5．分类，涂漆和唾液收集

在Excel程序中随机分组后，将儿童分为3组，每组30名参与者。考虑到90%的幂和5%的显著性水平，计算每组的样本量。满足本研究要求所需的样本量计算为每组24名受试者。然而，在t他的价值，以弥补可能的随访损失；然后，最终样本量估计为每组30名患者。所有参与者接受同一品牌的直柄、小头、软毛牙刷和含氟牙膏，每天使用三次。

ⅰ组涂1%洗必泰清漆，ⅱ组涂5%氟清漆，及1%氟清漆c . langsdorffiioilresin集团(古巴香)。每位患者最初咀嚼一块3 × 3厘米的塑料薄膜^®)，刺激唾液的产生，并将细菌从牙科生物膜中释放出来。所有的参与者都得到了相同类型的牙刷和含氟牙膏。标准化的口腔卫生指导是通过一个讲师为所有家长进行的，他们收到了书面的建议，以加强指导。

使用塑料装置收集唾液并储存在无菌微量离心管（Eppendorf）中^®)，然后存放在装有冰的聚苯乙烯盒中。为尽量减少昼夜节律对唾液流的影响，所有样本均由同一操作人员在同一时段和条件下采集，采集时间为上午9:00至11:00。在收集唾液后，每个患者在第四颗乳牙上涂上对应于他们组的清漆。在使用清漆之前，牙齿是由专业的罗宾逊刷和浮石清洁的。用微刷将相对绝缘的清漆涂在选定的磨牙上。10秒后，清漆通过三针筒的空气微妙地干燥。为了避免唾液污染，棉卷在25秒后被取下。每颗牙齿涂三次清漆:基线时，90天后，180天后开始治疗。在每次评估期间和基线后，评估的牙齿以及其他牙齿中也记录龋齿的存在或不存在。每个患者的唾液收集时间为4个时刻:基线时、90天后、180天后和360天开始治疗后。

2.6。微生物分析

样品被运送到实验室进行微生物分析，在一个密封的盒子里装有冰。

唾液在试管振动筛上均质30秒。取0.1 mL的每个样品，用无菌方法取出并转移到一个含有0.9 mL生理盐水的无菌试管中。重复2次，稀释倍数分别为1:10和1:100。相应的体积为10μ将每种稀释液的L分别涂于mitis salivarius-bacitracin (MSB)琼脂培养基上，共3个重复。然后将培养皿在37°C的微嗜氧条件下在罐子中培养48小时。细菌计数以菌落形成单位(CFU)/mL的唾液表达，然后进行表型菌落鉴定，如其他地方所述。

2.7。临床评价

在相同的唾液收集期，应用ICDAS II方法对儿童龋病进行监测。

2.8。统计分析

关于CFU数量的数据最初使用对数变换(log10)进行了转换，以实现正态分布。转换后的CFU数通过Kolmogorov-Smirnov检验进行初步分析，验证分布的正态性。因此，对描述性统计进行均值和标准差计算，并使用参数检验进行数据分析。每次采用方差分析(ANOVA)对三组进行比较(组间分析)，并结合Tukey的多重比较检验验证两两组间的差异。各组不同时间间比较(组内分析)采用重复测量方差分析(repeated measures analysis of variance, ANOVA)，结合Tukey’s multiple comparison test，验证配对时间间的差异。所有分析的显著性水平均设定为0.05 (5%)小于0.05的值被视为具有统计显著性。GraphPad Prism®软件版本5.00 for Windows®（GraphPad software，San Diego，California，USA，2007）用于统计程序和绘图。

3.结果

我们将90名儿童随机分为三组(图)1）.所有的参与者都完成了研究。

桌子1显示了变异链球菌，表示为每mL唾液菌落形成单位数(CFU)的对数，在第0天(基线)、90、180和360天用洗必泰、氟化物和科拜巴清漆治疗的患者的唾液样品中以1:10的稀释量测量。数据对应于各治疗组患者唾液样本中验证的CFU数对数的均值和标准差。在处理结束时，各组用科派巴清漆处理 和氟化物 与洗必泰组相比，在治疗开始时有更大的统计学差异 ．

桌子2显示了变异链球菌,表示为对数的集落形成单位(CFU)的数量每毫升唾液,以唾液样本的稀释1:0(预处理)100天,90年,180年和360年患者洗必泰,氟化物,苦配巴香脂清漆,第二稀释(1:100)。数据对应于各治疗组患者唾液样本中验证的CFU数对数的均值和标准差。治疗结束时，对照组给予洗必己定治疗 和古巴香 清漆与D0有统计学差异。

关于不同处理牙釉质组的临床资料(表)3.)，观察2例洗必泰清漆治疗组5个初期龋损的外观。用科拜巴和氟化物清漆治疗的组在ICDAS II评分中没有出现龋损。

4.讨论

在本研究中，我们评估了一种含科拜巴油树脂的新型清漆在360天内的临床和抗菌效果，并与含氟和洗必泰的清漆进行比较，以预防高危儿童龋齿。

ECC的风险标志包括变异链球菌和乳酸杆菌是口腔微生物群的一部分的物种[22]。这些可能反映龋病过程的不同阶段，并揭示口腔微生物群的变化[15]．虽然有一些物种与龋齿有关，变异链球菌它们仍然与该疾病密切相关；其在口腔中的高度定植可能与该疾病有关，因为它们是微生物失衡的指标[12，13，24]．链球菌，虽然不是唯一与龋齿有关的，是口腔的主要殖民者之一，在牙齿萌出后不久开始殖民[17]．唾液是口腔微生物群的一种代表性培养基，它可以反映口腔微生物群的变化，之所以选择它是因为它是一种可接近的培养基[15]．

评估氯己定使用6个月的研究不足以证实其对蛀牙的效果，因为大多数研究并没有显示其对疾病控制有任何效果[25]．Vale et al. (2014) [26评估了重新殖民的时间变异链球菌用1%洗必泰凝胶连续治疗2天后。在研究前和第1、7、14、21和28天收集唾液进行评估变异链球菌的水平。水平下降，但没有统计学意义。在本研究中，洗必泰清漆降低CFU达6个月之久 ，但在最后的分析(D360)中，观察到CFU恢复到初始时期的相同水平。

局部使用高浓度的氟化物产品(>2 500 ppm)会产生氟化物储存库，向牙齿表面提供氟化物并促进其渗透到生物膜中，有效地减少脱矿和增加再矿化。氟化物可能具有杀菌活性，经常在专业场合使用。在本研究中，氟清漆处理组在整个研究期间CFU降低 ．

科拜巴油树脂的抗菌活性可能与倍半萜和二萜的结合有关，从而影响细菌细胞壁的完整性。经科学证明，这种油对多种病原体都有活性，尤其是革兰氏阳性细菌，比如葡萄球菌种虫害和链球菌在气相色谱的研究和验证中，使用合适的方法稀释油树脂是很重要的[3.]．在本研究中，科拜巴显示了在所有时期的CFU的显著降低 ．在每一研究期间的组间分析中，只有用科拜巴清漆处理的组对两种稀释剂的结果显示有统计学意义。

根据Diefenbach等人(2018)[5]，大多数评价科拜巴油树脂抗菌活性的研究将其与氯己定进行比较，氯己定是阳性对照变异链球菌是研究最多的生物体，以及牙科领域其他有关天然产物的研究[14]．

Pieri等人（2010年）[27]评估β-从椰子油树脂中分离出的石竹烯对树脂粘附性能的影响变异链球菌其中，它的作用优于洗必泰。Pieri et al. (2016) [28的抗菌活性β-石竹烯对牙菌斑细菌的体外抑菌作用。结果表明β-石竹烯阻止形成斑块的细菌增殖。

牙科清漆在预防龋齿方面表现突出，被儿科患者广泛接受，特别是6岁以下的儿童。这一年龄组的患者没有足够的唾液喷射能力，因此选择了科派巴油树脂的清漆配方[29，30.]．它们由聚合物基体、赋形剂和活性成分组成。在目前的清漆的情况下，所选的基质是不可溶的(在这种情况下，是乙基纤维素)，用来调节活性成分的释放，因此，它的质性较高[21，23]．这种剂型附着于牙痕和牙缝，逐渐释放活性原理，破坏牙体生物膜，成为一种适合抗菌剂型的长效治疗剂[29，31]．

目前大多数龋齿随机临床试验的结果都集中在修复材料的性能上，在样本中存在许多偏差。在目前的微创牙科阶段，研究材料和预防替代品是很重要的[32]．

在copaiba牙科清漆的初步研究中，所有油树脂浓度均显示出抗菌活性；然而，只有1%的油树脂浓度显示抗菌活性降低变异链球菌菌落形成单位[23]．人们认为，科派巴是一种较低浓度的药物形式，其化学成分越复杂，配方中使用的药物赋形剂之间的相互作用就越小。此外，科拜巴的活性成分可能保留在清漆基体中，并在局部释放。我们还观察到，高浓度的科拜巴油树脂失去了保持其活性原理的能力，在这些情况下，活性原理释放得如此之快，以至于清漆部分失去了抗菌活性。

在临床应用方面，科派巴和氟化物清漆在预防蛀牙方面的效果相似。然而，重要的是要考虑到这是一个小样本的研究，只考虑了一年的随访。

5.结论

经过3年的应用，科派巴清漆显示出显著的抗菌活性变异链球菌对患龋齿风险高的儿童进行长达12个月的治疗。氟化物和科派巴清漆在预防龋齿方面有很好的效果。未来的研究需要确定的抗龋作用，以建立使用清漆预防龋。

数据可用性

用于支持这项研究结果的数据可在存储库中找到http://repositorio.ufc.br/bitstream/riufc/44474/1/2019_tese_larvmarques.pdf．

披露

数据为主要作者塞阿拉联邦大学博士论文的一部分。

的利益冲突

作者声明他们没有利益冲突。

致谢

作者想感谢“Fundação Cearense de Apoio ao Desenvolvimento Científico e Tecnológico (FUNCAP)”和“Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)(206/2018)”。

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