文摘
针灸可以显著改善炎症性疼痛急性内脏痛觉过敏。痛觉过敏炎症介质衰减,激活瞬时受体电位辣椒1 (TRPV1)和TRPV1受全身的神经生长因子(神经生长因子)磷脂酰肌醇3-kinase PI3K / Akt途径。然而,未知是否NGF-induced PI3K / Akt通路与手工针灸(MA)相关联。在这项研究中,马的效果和机制Shangjuxu (ST37)和Quchi (LI11)检查使用醋酸段大鼠模型与内脏痛觉过敏。我们证明了马ST37显著减少腹部撤军反射(心田)分数,促炎细胞因子(TNF -表达式α,il - 1β,il - 6)和TRPV1蛋白在大鼠急性内脏痛觉过敏和mRNA表达与未经处理的控制相比,在马LI11显示没有影响。马在ST37逆转的影响与PI3K受体激动剂治疗后igf - 1马前30分钟。在大鼠内脏痛觉过敏,神经生长因子的upregulation, tropomyosin-receptor-kinase (TrkA), PI3K,和phosphorylation-Akt ST37马(p-Akt)下降,表明TRPV1监管通过NGF-induced PI3K / Akt通路起着至关重要的作用的影响MA-mediated改善急性内脏痛觉过敏。
1。介绍
内脏痛是一种常见的类型的疼痛引起的潜在疾病,患者经常寻求医疗干预。据世界卫生组织统计,22%的初级护理患者持续疼痛(1,全球约11%的病人有腹痛的肠易激综合征(IBS) (2]。最常见的药物目前用于治疗急性和慢性内脏疼痛障碍包括止痛药、抗痉挛、抗抑郁药。然而,这些经常与不利影响成瘾和便秘等(3]。
针灸、中药治疗,已应用于临床改善内脏功能(4和改善急性5- - - - - -7)和慢性(8- - - - - -11)疼痛。ST37和LI11是两个最有效的穴位治疗肠道疾病(12- - - - - -18];然而,他们显示不同的镇痛效果的模型zymosan-induced结直肠过敏(19]。先前的研究发现ST37在溃疡性结肠炎的治疗效果优于LI11改善溃疡得分,其机制是减轻潜在的肿瘤坏死因子(TNF)α和增加胆碱乙酰转移酶的水平(聊天)和α7烟碱乙酰胆碱受体(α7乙酰)(20.]。
促炎细胞因子如TNF -α可以激活TRPV1受体外围疼痛传输(21]。痛觉过敏引起的炎症和postinflammatory介质激活TRPV1,表明TRPV1在炎症性疼痛中发挥作用(22,23]。最近,许多研究探讨了EA的功效治疗不正常的慢性内脏痛过敏(24,25)和急性内脏痛觉过敏(7,26]。EA的效率被认为是与TRPV1的规定(10,27]。神经生长因子可以绑定TrkA受体激活PI3K和Src激酶磷酸化TRPV1 [28]。然而,针灸效应的机制仍不清楚。在这项研究中,我们旨在确定马LI11和ST37的影响是不同的,和TRPV1的表达的调控NGF-induced PI3K / Akt马参与的机制,使用醋酸段大鼠模型内脏痛觉过敏。
2。材料和方法
2.1。动物
参照研究Qi et al。26),36岁男性的雄性sd大鼠中重300 - 380克从机构获得动物保健和使用委员会福建中医药大学(许可证号码,SYXK(福建)2014 - 0005)。所有的老鼠都提供随意获得水和食物和被安置在特定病原体免费(SPF)设施在12 h光/暗周期和标准条件在23°C±2°C。所有试验程序进行按照美国国立卫生研究院指导实验室动物保健和使用的。
2.2。仪表
ABI StepOnePlus rt - pcr仪器购买从应用生物系统公司(美国福斯特,CA),高速冷冻离心机是来自埃普多夫(德国汉堡),和化学发光成像分析系统,电泳系统,Trans-Blot涡轮增压输送系统,微型板块吸光度系统从Bio-Rad购买(美国大力神,CA)。
2.3。试剂
PI3K兴奋剂igf - 1是购自Biovision(苗必达、钙、美国),和0.1毫克/毫升股票准备在盐水中。肿瘤坏死因子(TNF)α白介素(IL) 1β,白介素6 (IL)鼠ELISA试剂盒获得来自南京建成生物工程研究所(中国南京)。神经生长因子、TrkA PI3K TPRV1,β肌动蛋白抗体买来Abcam(英国剑桥)。Akt, p-Akt (Ser473)抗体,抗体和二级山羊anti-mouse免疫球蛋白是来自Proteintech(美国Rosemont, IL)。二次抗体山羊anti-rabbit免疫球蛋白是从Huabio购买(杭州)。
2.4。建模过程和分组
急性内脏痛觉过敏是诱导据Qi et al。26]。36个老鼠被随机分配到组,每组6:(1)正常,模型(2),(3)ST37, LI11 (4), (5) ST37 + igf - 1和igf - 1 (6)。1.5毫升的生理盐水或2%醋酸(AA)慢慢地注入到远端结肠。运用针灸治疗急性内脏痛觉过敏的诱导后1小时15分钟。针灸的应用后,心田;30分钟内进行评估。然后,结肠组织样本收集4小时后滴剂2% AA老鼠牺牲后(图1)。
(一)
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2.5。针灸刺激
正常组大鼠没有给予任何其他形式的治疗与1.5毫升的生理盐水灌注后却被当作动物模型的组。模型组的老鼠接受了同样的治疗的ST37集团没有针灸治疗后急性内脏痛觉过敏的感应。ST37组对待马ST37(5毫米外侧前胫骨结节和15毫米低于膝关节)等15分钟我们之前研究[29日- - - - - -31日),1小时后诱导急性内脏痛觉过敏,通过使用一个小(长度:13毫米,直径:0.3毫米)针灸针(苏州华佗医疗器械有限公司、苏州、中国)。针头插入的深度5毫米到穴位,每隔5分钟和旋转操作进行了30年代。每个针双向旋转180°的速度2赫兹。LI11集团接受了同样的治疗在LI11点,位于大萧条前外侧肘部的方面。ST37 + igf - 1组,PI3K igf - 1受体激动剂(4119 - 1000年,Biovision, 0.5毫克/公斤/鼠,溶解在盐水)是腹腔内注入大鼠30分钟前在ST37针灸穴位,剩下的操作ST37组的水平是一样的。igf - 1组老鼠相同的方式对待那些ST37 + igf - 1组,但并不用针灸治疗。
2.6。心田的分数
评估痛觉过敏的反应,心田;观察结束后30分钟内进行针灸治疗。结直肠扩张刺激(CRD)进行同时监测的心田如前所述[32]。光下用无水乙醚麻醉诱导(使用2 - 3棉花球蘸无水乙醚)放在一个透明的盒子里,一个6厘米膨胀的气球(构造使用6厘米避孕套与空气膨胀)插入到结肠。防止气囊导管滑动,尾巴用胶带固定。动物被关在一个20×5×8厘米丙烯酸凯奇和允许恢复意识为30分钟,适应环境。逐渐产生四种不同水平的恒压(20、40、60和80毫米汞柱),CRD气球导管连接,手边有一台便携式血压计。CRD每个老鼠进行了三次5分钟的间隔,与所有的测量进行了20年代的表示压力。心田;分数记录按照发表评分标准(32):0,没有CRD的行为反应;1、固定在CRD;2,轻微的腹部肌肉收缩,但没有提升腹部;3,一个强大的腹部肌肉收缩和解除的腹部,但没有取消骨盆结构;4、身体拱起和盆腔结构的提升。
老鼠被牺牲在预定的采样时间,1厘米的结肠组织样本6厘米从肛门边缘收集4小时后滴剂2% AA。所有操作进行冰,1厘米结肠组织被分为三个部分,删除迅速在液氮冷冻保存管和存储直到用于ELISA、免疫印迹、定量实时PCR。
2.7。炎性细胞因子评估ELISA
肿瘤坏死因子(TNF)的水平α白介素(IL) 1β,白介素6 (IL)在结肠癌组织中使用商用鼠ELISA试剂盒测定根据制造商的指示,在结肠组织均质后,上层。标准或样品溶液(100μL)是应用于96孔聚苯乙烯微型板块和孵化90分钟37°C。然后,10μL生物素化的抗体应用于井和孵化60分钟37°C。混合物在每个好,然后吸气,每个洗了1×洗缓冲区的三倍。接下来,100年μL (tetramethylbenzidine(三甲)底物添加到每个孵化10分钟。100年μL停止解决方案应用于停止反应,和井在450海里。
2.8。定量实时聚合酶链反应
我们使用了一个RNA提取工具包(美国表达载体)提取完整的RNA。高容量cDNA逆转录工具包(豆类、日本)被用来合成互补。反转录的过程如下:42°C fo 900年代和98°C 15 s。放大的多个样本进行了使用SYBR绿色(豆类、日本)。每个反应混合物(20μL)包含4μL的底漆,4μL反向引物2μL (cDNA, 10μL(混合SYBR绿色。PCR协议使用ABI StepOnePlus rt - PCR仪(美国应用生物系统公司)如下:40 95°C的周期30年代,95°C 5 s, 30年代和60°C, GAPDH作为内部控制(30.]。神经生长因子的引物,TrkA、PI3K和TRPV1信使rna检测是预先设计(GenScript,中国)如下:神经生长因子F: 5ʹ-行动GGA CTA AAC TTC AGC ATT CC-3ʹ,R: 5ʹ-GGG CAG CTA TTG GTT CAG CA-3ʹ;TCG TrkA F: 5ʹgcc TAA CCA TGA AGA GTG-3ʹ,R: 5ʹCCA亚美大陆煤层气有限公司猫TGG gg AGA GAT-3ʹ;PI3K F: 5ʹccc行动TCT ATA GCC AAC AAC-3ʹ,R: 5ʹ手枪ATC太极拳CCA GTA CCA TT-3ʹ;Akt F: 5ʹCAC gg TCG CTA CTA TGC猫棉酚三大ʹ,R: 5ʹ- GCA GGA CAC GGT TCT CAG TAA GC-3ʹ;TRPV1 F: 5ʹccc GGA AGA CAG ACA GCC TGA-3ʹ,R 5ʹttc AAT GGC AAT GTG CAG TGC TG-3ʹ;和GAPDH F: 5ʹaga TGG TGA gg TCG GTG TGA-3ʹ,R: 5ʹ玻纤棉酚手枪GGT手枪GGG TTT CC-3ʹ。使用2数据处理−ΔΔCt方法。
2.9。免疫印迹分析
神经生长因子的水平,TrkA, PI3K p-Akt / Akt, TRPV1结肠组织的老鼠用免疫印迹试验检测。结肠样本均质蛋白质裂解缓冲(里帕),和等量的蛋白质(50μg)被electrophoretically解决钠十二烷基sulfate-polyacrylamide凝胶(8%的分离胶和5%的浓度凝胶)。解决蛋白质转移到PVDF膜,并与下面的抗体进行免疫印迹:神经生长因子(1:1000年,ab6199 Abcam) TrkA(1: 1000年,ab76291 Abcam), PI3K(1: 1000年,ab151549 Abcam),一种蛋白激酶(1:1000、10176 - 2美联社Proteintech), p-Akt (Ser473) (1: 2000、66444 - 1 - ig Proteintech),和TPRV1(1: 500年,ab6166 Abcam)。第二抗体是山羊anti-mouse免疫球蛋白g(1: 5000年,SA00001-1 Proteintech)和山羊anti-rabbit免疫球蛋白g(1: 5000年,HA1001 Huabio),和β肌动蛋白是作为内部控制(1:2500年,ab8227 Abcam)。
2.10。数据分析
每项研究的结果表示为均值±SD。多集团研究与单向方差分析进行了分析,其次是图基诚实的显著差异(HSD)事后考验。 被认为是具有统计学意义。
3所示。结果
3.1。影响得分心田;
应对CRD的心田;分数压力为20,40岁,60岁,80毫米汞柱被记录在案,并且明显高于动物急性内脏痛觉过敏比正常对照组。ST37马治疗后,心田ST37组的得分显著低于模型组( )。但马在LI11点显示模型组相比没有明显的影响( ),和之间的显著差异观察LI11 ST37集团( )。此外,马的影响在ST37抑制PI3K受体激动剂igf - 1的管理;ST37 + igf - 1组相比,显示显著差异ST37组( ),但不是igf - 1组( ;图2)。
(一)
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(c)
(d)
3.2。Downregulation TNF -α,il - 1β马在ST37后,il - 6
肿瘤坏死因子-α,il - 1β,il - 6表达明显高于冒号的大鼠急性内脏痛觉过敏比健康的老鼠( )。马在ST37治疗,但不是LI11,可以降低TNF -α,il - 1β,il - 6表达(图3)。
(一)
(b)
(c)
3.3。马治疗ST37 TRPV1 mRNA水平降低引起的结肠通过PI3K通路中的神经生长因子
神经生长因子、TrkA PI3K和TRPV1 mRNA表达大鼠的结肠急性内脏痛觉过敏显著高于正常对照组。在LI11 ST37马治疗,但不是,可以降低神经生长因子,TrkA, PI3K, Akt, TRPV1 mRNA的表达。Downregulation PI3K的一种蛋白激酶,TRPV1 mRNA表达由于马治疗ST37 + igf - 1组被igf - 1治疗;显著差异PI3K Akt, TRPV1 mRNA表达之间的观察ST37 + igf - 1和ST37 ( )组。PI3K, Akt, TRPV1 mRNA表达调节PI3K在igf - 1受体激动剂igf - 1组,模型组相比( )。马Downregulation神经生长因子和TrkA mRNA表达的治疗ST37还观察到,与ST37 + igf - 1与模型组之间的显著差异( )。神经生长因子和TrkA mRNA表达ST37 + igf - 1组并不影响igf - 1治疗,尽管没有神经生长因子的差异和TrkA mRNA表达igf - 1与模型组( ;图4)。
(一)
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3.4。马治疗ST37 TRPV1的蛋白表达减少结肠通过NGF-Mediated PI3K通路调制
神经生长因子的表达,TrkA, PI3K p-Akt, TRPV1蛋白质明显高于冒号的大鼠急性内脏痛觉过敏比健康对照组( )。马在ST37治疗,但不是LI11,可以降低神经生长因子,TrkA, PI3K p-Akt, TRPV1蛋白表达。PI3K和TRPV1的差别,对这些基因的蛋白表达马治疗后ST37 + igf - 1组被igf - 1治疗逆转。显著差异PI3K p-Akt, TRPV1蛋白表达之间的观察ST37 + igf - 1和ST37组( ),而且没有观察到的差异之间的ST37 + igf - 1和模型组( )。PI3K p-Akt, TRPV1 igf - 1组蛋白表达显著增加和PI3K igf - 1受体激动剂治疗后,模型组相比,( )。神经生长因子和TrkA差别不过,对这些基因的蛋白表达ST37还观察到,由于马治疗之间的显著差异ST37 + igf - 1和模型组( )。神经生长因子和TrkA蛋白质表达并不影响igf - 1治疗,并没有明显的差异之间的神经生长因子和TrkA表情igf - 1和模型组( )(图5)。
(一)
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4所示。讨论
针刺疗法被广泛用于缓解内脏疼痛在中国,由于它能够提供缓解疼痛与一些副作用如能让人上瘾33,34]。一些临床研究证明acupuncture-moxibustion内脏疼痛治疗的疗效[10]。马是常用的传统的针灸师,穿透针头插入穴位以及手动旋转的针灸能增强其临床益处35- - - - - -37]。增加使用针灸的疼痛控制,其影响机制吸引了大量关注。
Qi et al。7,26)建立了一个急性内脏痛觉过敏模型用2%醋酸结直肠滴注法,这是一个可靠的动物模型研究机制的影响针灸治疗急性内脏痛觉过敏。在这项研究中,我们证明了心田;分数的恒压20岁,40岁,60岁,80毫米汞柱气球结肠刺激内脏痛觉过敏模型组高于正常组(图2),确认急性内脏痛觉过敏的建立模型是适用于后续实验。
刺激在特定体细胞组织(穴位)可以长期冷淡地调节内脏器官生理、和EA somatotopy依赖特性的抗炎实验最近报道(38]。ST37是最有效的穴位治疗肠道疾病,包括肠易激综合症(12,13),功能性便秘(14],肠道功能障碍[15),炎症性肠病(16,17]。EA在ST37 Zusanli (ST36)可以显著减少异常增加的心田分数和肌电图的大小(emg)记录从腹直肌在20 CRD刺激,40岁,60岁,80毫米汞柱在慢性内脏过敏24,25)和急性内脏痛觉过敏(7,26]。LI11也是一个常见穴位在腹痛的临床治疗他- - - - - -海点hand-Yangming大肠经,和针灸在LI11 ST37或其他穴位能有效改善功能性便秘(14,18,39]。然而,针灸在近端结肠运动LI11显示没有明显的影响(40),其效果弱于针灸在治疗溃疡性结肠炎(ST3720.]或zymosan-induced结直肠过敏(19]。在这项研究中,我们发现了类似的结果。马在ST37心田;降低分数,但LI11没有显著影响治疗急性内脏痛觉过敏(图2)。ST37的镇痛效果优于LI11和可能与不同神经段。结肠神经段位于T水平6- l3,圣37的L4- s2(41从C]和LI11包含传入5脊髓背角[42]。神经段结肠和圣37相对较近,虽然LI11不是。因此,马英九在圣37比LI11更好的镇痛效果。
针灸的抗炎作用的结果减少促炎细胞因子(TNF -α,il - 1β和il - 6)和改进的宏观炎症(43- - - - - -46]。在这项研究中,马治疗ST37可以降低TNF的表达-α,il - 1β,il - 6,调节大鼠的结肠急性内脏痛觉过敏(图3)。外围损伤或炎症诱导的分泌大量的炎症介质,和il - 1的表达,il - 6、TNF -α和前列腺素E2(铂族元素2)显著升高在急性炎症醋酸诱导的大鼠内脏疼痛,这导致周边的敏感受体参与疼痛传输TRPV1的水平和降钙素相关基因肽(CGRP怎样)增加21]。
TRPV1表达外在初级传入纤维在应对兴奋剂,如辣椒,芥末油和热(23]。也是高度表达的肠子和作为一个关键调节器内脏痛觉过敏(10,27,47- - - - - -49]。我们先前表明,刺激ST37可以增强空肠的能动性在老鼠和老鼠50],TRPV1部分参与胃蠕动的acupuncture-mediated调制(48,51]。然而,TRPV1在镇痛的作用在急性内脏痛觉过敏的情况下还不清楚。在这项研究中,我们发现TRPV1蛋白在大鼠急性内脏痛觉过敏和mRNA表达高于正常,降低了马后,表明,针灸可以缓解内脏痛的调停TRPV1的规定,正如前面观察到(10,27]。
TRPV1活动可能是受神经生长因子(52,53]。受体酪氨酸激酶,神经生长因子的高亲和性受体TrkA,传统信号通过激活磷脂酶C (PLC)γ),第42页/ p44增殖蛋白激酶(ERK),或PI3K [53]。PI3K / Akt通路,而不是PLC通路,是一个主要的神经生长因子通路下游可以参与感觉过敏症在各种动物模型53- - - - - -56]。治疗急性神经生长因子或外围注射辣椒素后,TRPV1活动是通过PI3K / Akt介导的通路(53,57]。Akt活动(磷酸化)增加在结肠炎结肠传入细胞状态和与TRPV1 coexpressed TrkA [58]。因此,NGF-PI3K-TRPV1轴可能在结肠痛觉过敏中起着重要的作用。先前的研究发现,激活PI3K / Akt途径提高p-Akt的表达(Ser473)可以起到抗炎作用[59],EA会影响PI3K / Akt信号通路通过调节p-Akt水平和p-Akt / Akt的比率(60]。最近的一项研究发现,在ST36刺激可能引发肥大细胞活动,激活神经生长因子/ TrkA TRPV1外围传入通路,和减轻内脏过敏在化学炎症模型大鼠61年]。但它仍然是未知是否针灸调和TRPV1的表达通过下游通路的神经生长因子/ TrkA。在目前的研究中,马在ST37可以大大减少神经生长因子的水平,TrkA, PI3K, p-Akt,和TRPV1,而LI11穴位治疗不能(数字4和5)。的影响在ST37比LI11马;也许原因是脊髓神经节段ST37 colorectum相邻,虽然LI11不是[19]。
igf - 1, PI3K受体激动剂,经常被用于验证PI3K / Akt通路的机制(62年- - - - - -64年]。IGF-I的生理功能主要是由IGF-I受体。IGF-I受体的内源性的激活受体激动剂引起自身磷酸化,激活内在酪氨酸激酶受体,后来磷酸化宿主细胞内基质包括胰岛素受体底物(IRS-1)。的磷酸化IRS-1导致刺激PI3K和丝氨酸/苏氨酸激酶的活化Akt [65年]。我们发现马ST37可以减少PI3K的水平,p-Akt, TRPV1。PI3K的效果被治疗兴奋剂IGF-1before妈,PI3K p-Akt, TRPV1蛋白表达显著增加(图5)。马治疗的效果在ST37心田;分数降低igf - 1马前处理(图2),这表明,针灸可以缓解急性大鼠内脏痛觉过敏的令人沮丧的TRPV1的表达通过NGF-induced PI3K / Akt途径。
5。限制
我们目前的研究结果提供了证据表明马镇痛急性内脏痛觉过敏有关穴位特异性,为马ST37改善行为痛觉过敏的TRPV1通过NGF-induced PI3K / Akt通路在大鼠急性内脏痛觉过敏,而马LI11显示没有影响。但也有一些当前研究的局限性。这两个穴位的镇痛效应的剂量对内脏疼痛是未知的。和现在仍不知道如何针灸信号传输,导致靶器官PI3K / Akt通路的变化来达到镇痛的效果。TRPV1是受许多因素,其潜在的机制减轻炎性疼痛是复杂的(66年- - - - - -68年]。为了进一步证实马TRPV1在镇痛的作用,更多的家庭成员PI3K / Akt通路和其他TRPV1激活物质应该探索,而急性内脏痛觉过敏的发病机制很复杂,不同。
6。结论
在ST37马,但不是LI11,可以显著降低大鼠急性内脏痛觉过敏的心田的分数。我们的研究结果表明,针灸镇痛作用的机制在ST37急性内脏痛觉过敏可能包括减少TRPV1的表达,这是由PI3K / Akt通路,诱导神经生长因子。这可能有助于理解的机制针灸治疗急性内脏疼痛。
数据可用性
使用的数据来支持本研究的结果包括在本文中。
的利益冲突
每个作者声明没有利益冲突的结果提出了相关研究。
作者的贡献
徐本构思和设计实验。Caiyi Chen Xuejun张,玲玲他和冯记进行了实验。之余,林董,玄王分析数据。Caiyi陈写的手稿。
确认
这项研究得到了国家自然科学基金(81503638号,81673883,和81873238)和中国福建省自然科学基金(2017 j01842和2020 j01741号)。