比较Ethanolic Aqueous-Polyethylenglycolic蜂胶提取物:化学成分和抗氧化特性

文摘

近年来,一直特别关注的天然抗氧化剂。蜜蜂产品,特别是蜂胶,特点是多功能(抗氧化、抗炎、抗菌、抗病毒和食品防腐剂)的影响,可用于功能性食品或食品防腐剂的发展。蜂胶提取物通常产生ethanolic;因此,某些群体的消费者,例如,儿童和酒精敏感的群体,他们的适用性是有限的。本研究的目的是开发替代的蜂胶aqueous-polyethylenglycolic蜂胶提取物(AQUA-PEG)和比较化学成分以及抗氧化(自由基清除和减少属性)活动的ethanolic蜂胶提取物(保留)。聚乙二醇是一个很好的溶剂,可以成功地用于棉结的准备。酚类化合物的总量中确定AQUA-PEG (400.36µg / mL),根据我们的技术准备,非常类似于燃灯(433.53µg / mL),而酚酸的量大了1.31倍AQUA-PEG和类黄酮的燃灯的2.38倍。抗氧化活性依赖于使用的方法:通过应用abt和CUPRAC方法,提取展示类似的抗氧化剂(反激进主义的和减少)活动,而在DPPH和收紧方法的情况下,显著提高抗氧化活性检测在燃灯。这应该是由研究人员考虑尤其是解释结果和结论对蜂胶提取物的抗氧化活性。AQUA-PEG结果的基础上,由发达的技术,可以作为另一种形式ethanolic蜂胶提取物,因为它含有大量的抗氧化剂,也就是说,黄酮和酚酸的含量。我们相信nonethanolic蜂胶提取物已被应用的前景发展的功能性食品为了减轻氧化应激的某些症状或一些oxidative-stress-related疾病的预防。

1。介绍

关心他们的健康,消费者选择食品,不仅为身体提供必要的营养物质,也能帮助预防疾病。食物可能富含各种组件,如维生素、矿物质、抗氧化剂、氨基酸。这样的食品与传统不同的生物价值,是为了满足特定的身体机能。这类功能食品对人体的一个或多个功能有积极影响由于成分,改善健康。蜜蜂产品,特别是蜂胶,特点是多功能(抗氧化、抗炎、抗菌、抗病毒)效果和可以成为一个有用的原料等的开发和浓缩产品。此外,蜂胶具有一定的属性作为食品防腐剂的杀菌和抑菌性能保证的蜂胶(1]。这是特别相关的食品行业的时候寻找天然防腐剂。近年来,一直特别注意寻找天然抗氧化剂。重要的是要注意,蜂胶的主要成分表现相对强劲的抗氧化活性,也与茶多酚和黄酮类物质的总含量2]。此外,大多数组件蜂胶是天然成分的食品和不被认定为安全物质。问题仍然是蜂胶活性物质的溶解度主要溶于乙醇。

因此,蜂胶提取物通常ethanolic生产和使用,这意味着广泛应用特定的一组消费者,例如,慢性疾病的儿童和酒精敏感的群体,由于可能的药物相互作用,是有限的。因此,越来越多的研究发展nonethanolic蜂胶提取物在实践中正在进行为了发展一个同样或更有效的蜂胶提取ethanolic蜂胶提取物。

它已经表明,nonethanolic蜂胶提取物具有抗菌(3],抗病毒[4),和抗炎症(5]属性。还报道,nonethanolic蜂胶提取物可防止细胞损伤引起的电离辐射(6]。保护作用的新发现提供证据表明nonethanolic蜂胶提取物对肠道辐射损伤涉及不仅其消炎和抗氧化的效果,而且其凋亡属性(7]。研究证实,nonethanolic蜂胶提取物可能是有效的作为辅助治疗哮喘病人。好处可能与咖啡酸衍生物的存在和其他有效成分的提取8]。

蜂胶替代形式的发展的一个基本方面是它的溶解度,自大约50 - 70%的蜂胶质量只能溶解在70%乙醇和水(5%9]。因此,溶剂的选择是最重要的一个阶段,一个成功的技术的发展为nonethanolic蜂胶提取物的制备。随着聚乙二醇(PEG)被广泛用作溶剂和防腐剂在许多nonparenteral和肠外的改进形式的药物水溶性差,乙醇蜂胶提取物(保留)及其aqueous-polyethylenglycolic蜂胶提取物(AQUA-PEG)准备本研究的目的。问题是是否AQUA-PEG燃灯一样有效的生物效应和化学成分。因此,本研究的目的是确定和比较的化学成分和抗氧化剂(自由基清除和减少属性)活动的燃灯和AQUA-PEG。四种不同的方法(DPPH、abt、收紧和CUPRAC)确定燃灯和AQUA-PEG以及抗氧化活性的比较方法的优点和缺点。

2。材料和方法

2.1。试剂

蒸馏水是纯化使用Milli-Q系统(微孔,贝德福德,妈,美国)。乙醇(96%)来自Vilniaus Degtine(立陶宛维尔纽斯)。乙腈(质等级),甲酸为质2,2′-azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic酸(abt)、过硫酸钾(K₂年代₂O₈),2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH)、醋酸钠、无水乙酸(99.8%)、盐酸(37%)、铁(III)氯化六水合物(FeCl₃×6小时₂O), 2, 4, 6-tripyridyl-s-triazine (TPTZ),二水氯化铜(II) (CuCl₂×2 h₂O)、醋酸铵和neocuproine是从Sigma-Aldrich收购(圣路易斯,密苏里州,美国)。所有标准用于UPLC-ESI-MS / MS分析也从Sigma-Aldrich购买(圣路易斯,密苏里州,美国),除了异鼠李亭3-O-glucoside,这是来自Extrasynthese (Genay、法国)。

2.2。蜂胶的原料和制备蜂胶提取物

生蜂胶获得JSC Bitute(立陶宛维尔纽斯)。分析前,蜂胶样品在室温下保持在黑暗中。下次准备:燃灯是由添加乙醇(70%)(1:10 (w / v)样品溶剂比)蜂胶磨成粉。提取在室温下进行了72小时的震动。那么下次绘画纸1号滤纸过滤,留在冰箱里(7^°C) 24小时将蜡。之后,通过绘画纸燃灯又过滤了一号滤纸和用于实验。制备AQUA-PEG:蜂胶原料磨成粉。AQUA-PEG是准备通过添加一个溶剂系统,即混合水和30%聚乙二醇400(聚乙二醇),1:10样品溶剂比(w / w)。拔牙70年进行了10分钟^°C温度在35赫兹频率的超声波浴。两种解决方案都是清晰的黄色液体,保持稳定的存储;也就是说,颜色保持不变;没有观察到沉淀;他们不把白色的。前UPLC-ESI-MS / MS分析,提取过滤膜过滤器(孔隙大小0.22µ米)由卡尔罗斯GmbH(卡尔罗斯GmbH & Co . KG,卡尔斯鲁厄,德国)。

2.3。UHPLC-ESI-MS / MS条件

酚类化合物的定性、定量分析是根据之前执行验证和UHPLC-ESI-MS / MS方法描述10]。酚类化合物的质谱参数分析和奎尼酸是展示在表1。

2.4。抗氧化活性评价

2.4.1。DPPH方法

DPPH溶液在96.3%乙醇(3毫升,v / v 6×10⁻⁵10米)是混合μL的提取物。减少吸光度测定λ= 515海里使用双光束紫外/ VIS分光光度计M550(液体CamSpec, Garforth,英国)(11]。这分光光度计采用的所有antioxidant-related实验。所有抗氧化测试的结果表示为µ摩尔Trolox等效(TE)每克。

2.4.2。abt方法

3毫升的abt⁺的解决方案是混合10μL的提取物。减少吸光度测定λ= 734 nm (12]。

2.4.3。CUPRAC化验

CUPRAC解决方案包含CuCl₂×2 h₂O在水中(0.01米),乙酸铵缓冲溶液(0.001米,pH = 7)和neocuproine乙醇(0.0075)(1:1:1的比例)。3毫升CUPRAC试剂混合10μL的提取物。吸光度的增加记录λ= 450 nm (13]。

2.4.4。收紧化验

收紧的解决方案包含TPTZ(盐酸溶解在0.01米和0.04米),FeCl₃×6小时₂O在水中(0.02米),醋酸缓冲(0.3 M, pH值3.6)(1:1:10比)。3毫升刚做好的收紧试剂混合10μL的提取物。吸光度的增加记录λ= 593 nm (14]。

2.5。统计分析

所有spectrophotometrical实验进行了一式三份,他们的平均结果表示为±标准差。统计上显著的差异研究蜂胶提取物测定采用单向方差分析方法和使用SPSS 25.0软件(美国芝加哥,IL)。

3所示。结果与讨论

3.1。酚类化合物的识别和量化UHPLC-ESI-MS /女士

由于传统生产的适用性ethanolic蜂胶特定的一组消费者(例如,儿童和慢性疾病患者)是有限的,生产nonethanolic提取物的选项,将可媲美(有效)乙醇提取物的化学成分及其生物效应,正在寻求。nonethanolic蜂胶提取物的生产成为一个主要的挑战是由于蜂胶的水溶性非常有限。正在努力寻找各种技术来提高活性化合物的提取蜂胶的nonethanolic溶剂。本研究的目的是准备nonethanolic蜂胶提取物通过挂钩作为溶剂和比较定性和定量成分和抗氧化(自由基清除和减少属性)活动AQUA-PEG和保留。准备从蜂胶中提取的化合物分离收集在立陶宛是Acquity h级UPLC三重四极杆串联质谱仪系统配备有电喷雾电离(ESI)获得MS / MS数据来源。质谱参数的分析酚类化合物和奎尼酸如表所示1。

表2说明了黄酮类化合物的化学成分在AQUA-PEG和保留。需要注意的是,在23日酚酸和类黄酮的基础上确定高效液相色谱方法,总(总和)内容非常相似(433.53µ在AQUA-PEG和400.36 g / mLµ在下次g / mL)。通过使用一个nonethanolic溶剂,其提取范围是1.31倍大的酚酸比ethanolic溶剂,而黄酮类化合物的提取(2.38倍的乙醇比nonethanolic溶剂。UPLC-ESI-MS / MS分析表明,最大的化合物中确定AQUA-PEG和燃灯是黄酮类化合物,即,芹黄素、槲皮素、异鼠李亭hyperoside,和山柰酚,其内容变化在2.02和14.03之间µg / mL AQUA-PEG和在6.04和37.5之间µ在燃灯(表g / mL2)。异鼠李亭的内容,芹黄素、槲皮素和山柰酚在保留大约是2-3-fold高于AQUA-PEG,而hyperoside相似(表的内容2)。以下flavonoids-rutin、galangin isorhamnetin-3-O-rutinoside、isorhamnetin-3-O-glucoside kaempferol-3-O-glucoside,儿茶素,广寄生甙,根皮苷,和vitexin-were也发现,虽然其内容是低得多,变化在0.012和0.32之间µg / mL AQUA-PEG和在0.014和1.12之间µ在燃灯(表g / mL2)。galangin的内容和isorhamnetin-3-O-rutinoside 14和16倍比AQUA-PEG燃灯,分别和isorhamnetin-3-O-glucoside的内容,kaempferol-3-O葡萄糖苷,广寄生甙,根皮苷确定还在燃灯比AQUA-PEG高出2 - 5倍。Orientin AQUA-PEG和tiliroside没有发现,只有在燃灯(表2)。因此,类黄酮的总含量中确定燃灯(72.5高出2.3倍µ比在AQUA-PEG (30.9 g / mL)µg / ml)。

比较结果与别人的数据,采集蜂胶的成分特性的样本在立陶宛被确定。法夫里等人发现galangin是蜂胶的主要酚类化合物在达吉斯坦[收集15]。galangin很低的浓度在立陶宛和蜂胶样品收集与这种化合物的浓度蜂胶样品,收集在索契地区、俄罗斯(15]。槲皮素是一种黄酮类化合物中主要化合物立陶宛蜂胶样品,而Kalogeropoulos等人的研究发现这种化合物的低浓度蜂胶收集在希腊和塞浦路斯(16]。

此外,5酚酸(p-coumaric、咖啡、芥子、绿原和rosmarinic酸)测定在燃灯和AQUA-PEG(表3)。的总内容确定酚酸及其衍生物为430.44µ在AQUA-PEG和326.87 g / mLµ在下次g / mL。重要的是要注意,咖啡的内容,芥子,绿原酸在AQUA-PEG高出3 - 5倍比燃灯(表3),rosmarinic酸相似的内容,和内容p-coumaric酸在保留更高(1.44倍)。最主要的化合物的所有分析物识别和量化是p-coumaric酸、咖啡酸、芥子酸(表紧随其后3)。此外,奎尼酸中检测出AQUA-PEG和保留。奎尼酸的数量在AQUA-PEG高出1.52倍。

Hegazi et al .,收集研究蜂胶的化学成分在奥地利,德国和法国,表明p-coumaric酸成为主流中酚酸(17]。这些研究数据协议与我们的研究结果。蜂胶样品收集在立陶宛也由p-coumaric酸。阿尔安尼等人提供研究数据略有不同。欧洲式的蜂胶样品研究了这些研究,p-coumaric酸定性检测只在蜂胶样品收集在捷克共和国,虽然并不确定在蜂胶样品收集在德国和爱尔兰(18]。

3.2。测量提取物的抗氧化活性

生物活性化合物的积极作用与抗氧化活性的身体已经被众多科学研究的结果证明(19,20.]。最重要的一个天然植物化合物具有较强的抗氧化剂(21,抗炎22,抗过敏药23),抗菌24],抗病毒[25],antithrombogenic [26,抗癌27),和心血管system-protective效应(28酚类化合物。之间的关联的摄入食物富含酚类化合物和发病率的肿瘤(29日)、心血管(30.),和神经退行性疾病31日已经建立。

因此,评价蜂胶的抗氧化活性提取物原料至关重要。这提供了一个科学依据的使用蜂胶制剂预防和治疗的疾病引起的氧化应激。天然提取物包含各种各样的化合物作为抗氧化剂通过不同的反应机制28,29日]。在科学文献中指出,单一的性能测试,以评估抗氧化活性可能是不够的,因为它取决于实验条件、方法,等等;因此,建议使用至少两种不同的方法(32]。为了获得最全面和准确的结果,来确定哪些方法是至关重要的抗氧化活性的测定在体外最好的反映生物活性化合物的反激进主义的和还原效果有不同的结构和属性蜂胶中找到。出于这个原因,确定抗氧化活性的时候,燃灯的反激进主义的活动和AQUA-PEG使用4种不同的评估在体外方法(abt、CUPRAC DPPH,捆牢)。abt和DPPH化验是基于抗氧化剂清除自由基的能力(11,12),而收紧和CUPRAC化验衡量抗氧化剂的减少活动13,14]。

尽管显著差异在内容(酚酸和类黄酮)的生物活性化合物在燃灯,AQUA-PEG相比,减少反激进主义的活动(abt方法)和属性(CUPRAC方法)非常相似的提取。然而,减少活动的评价研究蜂胶提取物在体外通过光度收紧的应用方法,表明减少活动ethanolic提取是2倍,AQUA-PEG提取(表4, )。更重要的是,这些提取的反激进主义的活动的评价采用DPPH法显示,燃灯以高达12倍DPPH-free自由基清除活性比AQUA-PEG(表吗4, )。因此,它清楚地表明,抗氧化活性高度依赖用于评估抗氧化活性的方法,根据该方法可以有很大区别。这应该是考虑到当时的研究。然而,下面的问题是:这种差异的原因是什么蜂胶提取物的抗氧化活性。

因此,这项研究的结果表明,抗氧化活性取决于使用的方法:在abt的方法,它在AQUA-PEG高出5倍和三倍高燃灯比收紧的情况下的方法。看来,由于方法论上的条件(酸性介质),减少一些蜂胶的抗氧化活性化合物。时应该考虑进行研究和应用不同的方法,以及解释结果。这项研究的作者研究的意义在于它演示了各种antioxidant-related方法的优缺点。因此,作者认为它适合应用几种不同方法在执行评估的多组分提取物,尤其是蜂胶等,特别是在这种情况下,当提取包含不仅疏水亲水化合物。作者的知识,这是第一个研究蜂胶的抗氧化活性进行比较的基础上多达四个不同的方法。

应该注意,DPPH-free激进分子只在有机溶剂溶解,这限制了反激进主义的亲水活动的评价抗氧化剂的基础上这个方法。当用于提取乙醇,与亲脂性的属性提取多酚类化合物,这也解释了为什么燃灯的反激进主义的活动在体外决定的基础上DPPH方法显著强于AQUA-PEG的情况。这项研究的结果显示,亲水化合物的数量(咖啡、芥子、绿原酸)在AQUA-PEG高出3 - 5倍比燃灯(表1),而各种黄酮类化合物的数量要高得多(高2.3倍)燃灯比AQUA-PEG(表2)。异鼠李亭的数量,芹黄素、槲皮素和山柰酚在燃灯高出2 - 3倍的数量galangin isorhamnetin-3-O-rutinoside是14和16倍AQUA-PEG。

同样重要的是要注意,酚类化合物的结构与抗氧化活性的生物系统或生物要复杂得多,因为每个化合物的抗氧化活性是高度依赖于它的物理化学性质,如亲油性、溶解度、亲脂性的之间的分布和亲水性的媒介。蜂胶是一种天然的多组分产品,提取其中的酚类化合物与不同的亲油性的特点是不平等的力量和各种机制的抗氧化效果的行动。

4所示。结论

总之,本研究的结果表明,酚类化合物的总量在燃灯和AQUA-PEG相似,但抗氧化活性显著不同,这取决于antioxidant-related研究使用的方法。通过应用abt和CUPRAC方法,extracts-EEP和AQUA-PEG-demonstrate相似的抗氧化剂(反激进主义的和减少)活动,而在DPPH和收紧方法的情况下,显著提高抗氧化活性检测在燃灯。这应该是考虑尤其是口译研究蜂胶的属性的结果和结论蜂胶提取物的抗氧化活性。然而,重要的部分由作者的研究结果,聚乙二醇是相当足够好的溶剂,可以成功地用于nonethanolic蜂胶提取物的制备,特别是在情况ethanolic蜂胶提取物不应使用(儿童和对乙醇的人敏感,等等)。目前的研究结果的基础上,提取propolis-ethanolic和nonethanolic-can用作功能性食品或膳食补充剂包括生物活性化合物,因为ethanolic和nonethanolic蜂胶提取物含有大量的抗氧化剂,也就是说,黄酮和酚酸的含量。这项研究的作者认为,这已经被应用的前景,作为一个额外的措施在预防疾病和某些症状的减轻氧化应激的条件下。

缩写

abt:	2,2′-Azino-bis (3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic酸)
CUPRAC:	减少铜抗氧化能力
DPPH:	2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl
燃灯:	Ethanolic蜂胶提取物
应急服务国际公司:	电喷雾电离源
收紧:	铁降低抗氧化能力
质:	液相色谱-光谱法
女士/小姐:	串联质谱
米/z:	质荷比
棉结:	Nonethanolic蜂胶提取物
挂钩:	聚乙二醇
TE:	Trolox等效
TPTZ:	2、4、6-Tripyridyl-s-triazine
UHPLC:	Ultrahigh-performance液相色谱
UHPLC-ESI-MS /女士:	Ultrahigh-performance液体chromatography-electrospray串联质谱分析
UV / VIS:	紫外可见光。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的结果包括在本文中。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

奏鸣曲Trumbeckaitė和Loreta Kubilienė负责这项研究的概念和设计并监督项目。Mindaugas Liaudanskas和VaidotasŽvikas进行实验并获得数据。Mindaugas Liaudanskas进行了统计分析。奏鸣曲Trumbeckaitė,Loreta Kubilienė,Mindaugas Liaudanskas分析和解释数据和写论文。

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