重复经颅磁刺激改善神经病变和氧化应激水平在大鼠实验性脑梗死Nrf2信号通路

文摘

缺血性中风对人类健康构成了严重的威胁。其高发病率、残疾和杀伤力利率导致它成为一个研究热点。脑缺血再灌注损伤是治疗缺血性中风的难点。近年来,研究表明,重复经颅磁刺激(rTMS)可以增强脑缺血性宽容和对缺血后再灌注损伤有显著的保护作用,但其具体机制尚不清楚。Nrf2 /通路在缺血再灌注损伤中起着至关重要的作用在体内环境。因此,在这个实验中,大脑中动脉闭塞(MCAO)再灌注模型的SD大鼠实验性脑梗死的发生进行了数值模拟的缝合方法。rTMS治疗后,研究了是否能调节的表达Nrf2 HO-1,影响MDA的含量和SOD活性,然后激活Nrf2通路发挥脑保护。结果表明,MCAO再灌注后,大鼠的神经功能缺损评分增加,和时间消除双边贴纸和时间交叉平衡木增加,表明实验的成功建立脑梗死模型。检测实验脑梗塞大鼠的脑组织发现Nrf2的表达和HO-1下降,MDA含量增加,SOD酶活性降低。rTMS治疗后,实验性脑梗塞大鼠的神经运动的功能改善,Nrf2和HO-1脑组织的表达逐渐增加,MDA含量降低,SOD的活性增加。 It indicates that the expression of Nrf2 and HO-1 in experimental cerebral infarction rats is reduced. After treatment with rTMS, it can improve the neuromotor function damage of the rats and reduce the level of oxidative stress. The mechanism may be through promoting the activation of the Nrf2 signaling pathway, acting on the expression of antioxidant proteins, such as HO-1 and SOD1, reducing oxidative stress damage, and playing a protective effect on brain tissue.

1。介绍

也称为缺血性中风,脑梗塞是由于脑部血液供应的中断,从而导致缺乏氧气和葡萄糖的供应大脑组织,导致局部组织坏死和软化。它的特点是高发病率和高死亡率,伤残率、高复发率、高死亡率,烟民的年龄越来越年轻,甚至是(1]。目前,对于缺血性中风的治疗,我们喜欢溶栓治疗急性治疗时间窗。然而,溶栓疗法产生一系列的副作用而recanalizing血管。最困难的是脑缺血再灌注损伤(2]。缺血再灌注损伤的核心病理环节主要包括氧化应激损伤和自由基的连锁反应(3]。因此,治疗缺血性脑病的主要方法包括抗氧化应激治疗,阻断脑缺血性损伤的级联,减少缺血半影神经元损伤。氧化应激是一种病理过程,身体产生过多的活性氧自由基(ROS)时受到各种有害刺激引起内源性抗氧化反应。这种不平衡会导致氧化损伤的积累,包括脂类的修改,翻译后蛋白质和核酸。大脑是特别容易受到氧化损伤由于其高脂质含量和高耗氧量。脑缺血再灌注损伤过程中,会产生大量的活性氧产品。在活性氧的大量增加产品将加重缺血再灌注损伤在许多方面,包括血脑屏障破坏,炎症和细胞凋亡。干扰线粒体呼吸链会产生大量超氧化物阴离子自由基(4]。通过基因或药物抑制ROS的生成机制可以保护脑组织中风后,降低血脑屏障的破坏,减少炎症(5]。丙二醛(MDA)是人体的代谢产物过氧化反应由氧自由基引起的,它可以反映出细胞损伤的程度。作为一种天然抗氧化剂酶、超氧化物歧化酶(SOD)可以清除体内的活性氧,及其活动反映了身体清除氧自由基的能力(6]。

核转录因子E2-related因子2 (Nrf2)属于Cap-n-collar (CNC)亮氨酸拉链转录因子家族。它由589个氨基酸组成,包含6个高度保守的领域Neh (Neh1-Neh6) [7]。在生理条件下,Nrf2 Keap1绑定稳定在细胞质中,处于不活跃状态。当发生氧化应激时,从Keap1 Nrf2相像,Nrf2进入细胞核结合抗氧化反应元素(是)8),激活下游相关基因,促进各种酶的表达和nonenzyme抗氧化基因,包括血红素加氧酶1 (HO-1), SOD,谷胱甘肽过氧化物酶,醌氧化还原酶1 (NQO-1)和过氧化氢酶(CAT)、增强细胞抗氧化损伤应力能力(9]。一些研究[10相信Nrf2的使用,一个兴奋性药物,pinacidil,可以显著增加心脏病的抗氧化压力和改善心肌功能。Nrf2蛋白质的表达的机制是调节上述治疗后,从而激活Nrf2 /途径,发挥其抗氧化应激效应。另一项研究[11]表明,亲电试剂的使用落实的活化剂Nrf2 /通路激活Nrf2 /下游通路可以移植各种抗氧化酶在脑缺血再灌注模型中,确认Nrf2 /通路对大脑有保护作用。

重复经颅磁刺激(rTMS)是一种新的neuroelectrophysiological技术开发的基础上,于1992年经颅磁刺激。它可以影响地方和遥远的皮质的功能,实现功能区域重建,并影响多种神经递质和基因的表达水平(12]。目前,它已逐渐被用于治疗研究,它已被证明有一个明确的影响神经精神疾病,如抑郁症和运动障碍13]。近年来,rTMS已逐渐应用于治疗缺血性脑血管疾病,越来越多的研究证实,rTMS能促进经济复苏的锻炼,学习和记忆的脑梗死患者,促进减少神经功能评分与脑缺血再灌注大鼠(14]。它对脑损伤有明显的保护作用缺血和再灌注后,但其具体机制尚不清楚。这个实验将建立一个短暂闭塞(大脑中动脉闭塞,MCAO)的右大脑中动脉,观察模型的影响,rTMS MCAO大鼠神经运动的功能变化。分析Nrf2的表达和HO-1缺血性脑组织中MDA含量和SOD活性的影响缺血性脑组织匀浆探索rTMS能否激活Nrf2 /信号通路来实现神经保护。具体报告如下。

2。材料和方法

2.1。动物分组和动物模型制备

45成年雄性SD大鼠(250克- 280克)(江苏Ailingfei生物技术有限公司)被随机分配到实验组3根据随机分配的原则,也就是说,虚假的组,模型组,和rTMS治疗组,每组15个老鼠。MCAO再灌注模型是由缝合方法。虚假的组使用相同的操作,但没有插入缝合。与rTMS rTMS治疗组开始介入手术后第一天,直到手术后14天,每天在同一时间点刺激,刺激每天3组,每组有20序列,每个序列隔开1 s,每组由1分钟分隔。模型组,虚假的rTMS被用来刺激MCAO模型(15在相同的条件下)SD大鼠。

2.2。具体的测试

2.2.1。神经功能评分

巴隆的潜油电泵系统[16缺血再灌注后24小时内)来评估神经功能:0分,没有神经系统损伤的症状;1点,轻微的局部神经赤字(前瘫痪和后肢不能完全扩展);2点,温和的局部神经赤字(圆瘫痪侧);3点、严重神经赤字(倾销到瘫痪而爬行);4点,不能自发地,意识丧失;和5分,不能走路。在上述情况下,基于点的累积分数将是最终的得分。

2.2.2。运动功能评价

运动功能评估的双面贴纸去除实验和平衡木行走实验。双面贴纸去除实验:动物手术后14天,两块边长的平方胶粘纸10毫米被用来把手掌表面两个前肢的老鼠(粘度的程度时最好是胶粘纸被咬掉在10 s正常老鼠的),和老鼠被放置在测试气缸。河鼠会本能地咬掉。观察和记录的总时间老鼠把纸两边。如果论文不是删除在120年代,它是记录为120年代。平衡木行走实验:实验进行了手术后14天。平衡木是105厘米×4厘米×3厘米木带。两端是固定的,所以木带离地面80厘米。起点是一个陡峭的平台,终点是一个平台,记录的时间,老鼠的四肢通过整个平衡木。未能通过整个平衡栏记录超过120年代120年代,和一只老鼠从平衡条记录作为超过120年代的失败。 Before the test, the rats are trained once a day for a total of 2 days.

2.2.3。组织标本的制备

在每组大鼠麻醉后,胸腔开放在剑突下,和主动脉弓插管的顶点的心,和右心房附件被割开。大约500毫升无菌生理盐水用于灌注冲洗,直到颜色很清楚,和500毫升的4%多聚甲醛用于灌注,直到整个身体僵硬。然后,大脑被放置在4%多聚甲醛溶液固定在4°C 24 h。在常规脱水石蜡块嵌入后,组织切片机(德国徕卡)是用来制造连续冠状切片前囱位置(脑梗塞)的网站,厚度2 - 5μm。大脑切片被存储在一个冰箱在−20°C。

2.2.4。免疫印迹蛋白质量化

老鼠的脑组织提取的总蛋白质,蛋白质含量和总决心BCA蛋白质浓度测定设备。电泳后,膜转移、阻塞和相应的抗体Nrf2 (1: 1000), HO-1 (1: 1000)β肌动蛋白(1:1000),Nrf2和HO-1蛋白质的表达水平在每一组被检测到。

2.2.5。rt - pcr

Nrf2的表达和HO-1决心通过rt - pcr方法。与试剂盒试剂提取总RNA, RNA的数量被紫外分光光度计测量,是反向转录成RNA cDNA,然后,进行PCR反应来执行相应的靶基因PCR扩增。给出了特定的引物序列表1。2^−ΔΔCt被用来计算相对目标基因的mRNA的表达。

2.2.6款。检测脑组织SOD活性和MDA含量

严格按照说明酶联免疫试剂盒。吸光度值为450 nm波长酶联仪器,以及SOD和MDA的质量浓度的样品被绘制标准曲线计算。

2.3。统计分析

SPSS17.0软件是用于统计分析。结果被表示为( )。测量数据,采用方差分析和卡方检验统计数据的使用。测试水平α= 0.05,双面的测试, 显示统计差异。

3所示。结果

3.1。对神经运动的脑缺血再灌注损伤大鼠的影响

神经运动功能评估结果表明,与虚假的组相比,模型组的神经功能缺损评分增加,删除和时间两国贴纸和平衡木的时间增加。差异具有统计学意义( )。它表明,脑梗死的实验大鼠模型已成功建立,如图1(一)和1 (b)。

3.2。的表达Nrf2 HO-1和氧化应激水平实验性脑梗塞大鼠的脑组织

免疫印迹和rt - pcr检测Nrf2的表达和HO-1实验性脑梗塞大鼠的脑组织发现与虚假的集团相比,Nrf2的表达,HO-1蛋白质,信使rna在模型组脑组织的减少。差异具有统计学意义( ),如数据所示2(一个)- - - - - -2 (d)。氧化应激测试发现,模型组的脑组织SOD水平和MDA水平的增加而减少。差异具有统计学意义( ),如数据所示2(e)和2(f)。

3.3。重复经颅磁刺激的影响与实验性脑梗塞大鼠的神经运动的功能

神经运动功能评估结果表明,与模型组相比,rTMS治疗组的神经功能缺损评分减少,消除双边贴纸的时间和时间平衡梁传递时间减少。差异具有统计学意义( )。建议rTMS可以改善与实验脑梗塞大鼠的神经运动的功能,如图3(一个)和3 (b)。

3.4。重复经颅磁刺激的影响Nrf2的表达和HO-1实验性脑梗塞大鼠的脑组织

免疫印迹和rt - pcr检测Nrf2的表达和HO-1实验性脑梗塞大鼠的脑组织中发现,与模型组相比,Nrf2的表达,HO-1蛋白质,信使rna的脑组织rTMS治疗组增加。差异具有统计学意义( ),如数据所示4(一)- - - - - -4 (d)。

3.5。重复经颅磁刺激对氧化应激的影响在实验性脑梗塞大鼠的脑组织

氧化应激测试发现,与模型组相比,脑组织中SOD水平rTMS治疗组的增加,MDA水平降低了。差异具有统计学意义( ),如数据所示5(一)和5(b)。

4所示。讨论

脑梗死是指脑组织缺血性坏死或软化,导致脑血液循环障碍,组织缺血和缺氧。预后有益轻微病例和危及生命的严重情况。脑梗死是最常见的脑血管疾病,约占70%的急性脑血管疾病,它是更常见的在中年和老年病人17]。根据最近的研究,疾病越来越年轻,严重影响社会的发展(18]。治疗脑梗塞、脑缺血再灌注损伤往往是引起。脑缺血再灌注损伤的机制包括兴奋性氨基酸毒性、大规模生成氧自由基、细胞内钙离子超载、线粒体损伤,细胞凋亡和免疫炎症损伤(19- - - - - -21]。氧自由基是导致缺血再灌注损伤的机制之一。在神经退行性疾病,铁积累导致线粒体氧化应激损伤。近年来,氧化应激已经收到了广泛关注的主要链接脑缺血和再灌注。

Nrf2通路是最重要的体内抗氧化压力系统(22]。HO-1是一个重要的heme-degrading酶与抗炎和抗凋亡作用[23]。在我们的研究中,人们发现MCAO再灌注后,大鼠的神经功能缺损评分增加,删除和时间两国贴纸和平衡木的时候穿过杆增加,表明大鼠神经运动功能异常,和实验性脑梗死大鼠模型成功建立。检测Nrf2的表达和HO-1实验性脑梗塞大鼠的脑组织发现Nrf2的表达,HO-1蛋白质,和mRNA的脑组织模型组降低,表明在实验性脑梗塞大鼠的脑组织,Nrf2 HO-1处于低水平。HO-1是一种应激蛋白与铁代谢有关。HO-1血红素分解成胆绿能公司和铁。在压力下,它可以防止氧化应激。然而,当长期过表达,它能促进铁沉积,产生更多的有毒的羟基自由基芬顿反应(24]。氧化应激检测发现,SOD水平实验脑梗塞大鼠的脑组织减少,和MDA水平增加,表明有严重氧化应激现象在实验性脑梗塞大鼠的脑组织。脑缺血和再灌注损伤会导致大量的活性氧。的速度和SOD过氧化氢酶和其他抗氧化酶活性中和活性氧是有限的,导致活性氧失衡;未还原的活性氧会导致严重的氧化损伤细胞膜。MDA是这一过程的最终产品(25]。

rTMS可以促进经济复苏的锻炼,学习,记忆在脑梗死患者和改善大鼠的神经损伤与脑缺血和再灌注(26,27]。在我们的实验中,发现在老鼠rTMS处理,神经功能缺损评分减少,和时间来消除双边贴纸和交叉平衡木的时间减少,证实rTMS可以改善与实验性脑梗塞大鼠的神经运动的功能。通过观察,我们还发现,Nrf2的表达,HO-1蛋白质,和老鼠的脑组织mRNA rTMS治疗组增加,SOD水平增加,而MDA水平降低了。建议rTMS可以诱导Nrf2通路的激活,增加HO-1水平,改善氧化应激反应。这可能是由于缺血性损伤和缺血再灌注损伤可引起机体的氧化应激反应,Nrf2通路作为防御信号转导通路人体抵抗内部和外部的氧化和刺激。内源性抗氧化反应机制发挥作用的过程中氧化应激(28]。当机体氧化应激反应,Nrf2可以迅速磷酸化,激活并转移到细胞核。通过作用于下游蛋白质,它能促进抗氧化蛋白的表达如HO-1 SOD1,抑制MDA的表达,减轻脑组织。氧化应激损伤是由于过量的活性氧(29日]。

5。结论

Nrf2的表达和HO-1降低实验性脑梗死大鼠。rTMS治疗之后,它能提高神经运动的功能损害,降低大鼠的氧化应激水平。机制可能是通过促进Nrf2信号通路的激活、表演等抗氧化蛋白的表达HO-1 SOD1,减少氧化应激损伤,脑组织发挥保护作用。本研究首次探索Nrf2信号通路的作用由rTMS治疗脑梗塞,这可以提供一个新的理论参考临床脑梗塞的治疗。在后续的研究中,实验可以扩展研究更多的途径与脑梗死和找到靶向治疗的方法。

数据可用性

和/或使用的数据集分析在当前研究可从相应的作者。

伦理批准

研究了海南总医院医学伦理委员会的支持。伦理批准文号:Med-Eth-Re - [2021] 203。这个项目符合有关法律、法规,批准实施。

信息披露

回族梁和徐Congjie co-first作者。作者想声明描述的工作是原始研究没有发表之前,并不考虑发表在其他地方,在全部或部分。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

回族梁和Congjie徐同样对本文亦有贡献。作者通过这篇文章。

确认

这项研究是支持的学校项目海南青年学者综合医院(海南海南医科大学附属医院)(QN202002)。

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