电针治疗慢性炎症性疼痛伴抑郁小鼠的作用及机制

摘要

慢性疼痛和抑郁症（MDD）共病是常见的疾病。然而，电针（EA）的机制和大脑中N-甲基-D-天冬氨酸受体的反应尚不清楚。三次注射完全弗氏佐剂（CFA）可诱发慢性炎症性疼痛（CIP）从第14天到第28天，每隔一天进行一次EA。评估慢性疼痛和抑郁的行为测试，以确保成功诱导共病。我们使用Western印迹分析来自前额叶皮质（PFC）的脑组织、海马和下丘脑的磷酸化N-甲基-D-天冬氨酸受体亚单位1（pNR1）、NR1、pNR2B、NR2B和钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶II型α亚型（pCaMKII）水平α）.CIP组出现机械性痛觉过敏、热性痛觉过敏和抑郁。此外，n -甲基- d -天冬氨酸受体(NMDARs)水平也下降。不是假EA，而是EA逆转了慢性疼痛和抑郁以及信号通路中NMDA水平的下降。CFA注射成功诱导了一个显著的共病模型。EA通过上调PFC、海马和下丘脑的NMDA信号通路治疗共病。我们的研究结果表明慢性疼痛与MDD和EA-analgesia共病的重要机制涉及NMDAR信号通路的调控。这些发现可能与慢性疼痛和重度抑郁症共病的评估和治疗有关。

1.介绍

慢性疼痛和重度抑郁症是门诊病人的常见病[1，2］.2010年，MDD和疼痛在美国造成的经济负担为2105亿美元[3.]及3,000亿元[4),分别。据估计，2015年抑郁症和疼痛同时发生的比例高达80% [5］.疼痛对抑郁症的预后有不利影响，反之亦然。一项研究表明，慢性疼痛患者患抑郁症的几率(30%-54%)明显高于普通人群(5%-8%)[6］.此外，身体状况引起的慢性疼痛患者有更长的抑郁情绪[7］.同样，另一项研究表明，与健康对照组相比，重度抑郁症患者的疼痛发生率和强度不同[8］.抑郁症和疼痛共享生物学途径和神经递质，这表明同时治疗这两种疾病可能是有效的[9］.

我们之前的动物模型研究表明EA通过神经元和非神经元途径对炎症性疼痛的治疗作用[10，11］.EA通过中枢神经系统麻醉疼痛下行通路刺激内源性阿片类物质分泌[12］.此外，一些临床研究表明EA可以缓解慢性疼痛[13]，例如膝骨关节炎[14，下腰痛[15- - - - - -17，颈痛[18，19，肩痛[20］.根据以往对抑郁大鼠的研究，EA治疗的抗抑郁作用是通过增强5-HT合成的机制实现的[21]，提高磷酸化的细胞外调节蛋白激酶的蛋白水平[22，以及抑制炎症细胞因子[23在海马体中。此外，EA可能通过激活奖赏系统来调节多巴胺能突触信号通路[24］.

然而，在重度抑郁症患者中，大约有10%-30%的患者在使用抗抑郁药后没有好转[25］.此外，选择性5 -羟色胺再摄取抑制剂(SSRIs)通常需要数周才能发挥其治疗MDD的全部作用[26并给大多数患者留下相当多的残留症状。因此，研究人员一直在努力发现其他可能的机制，可用于治疗抑郁症。特别是，两项值得注意的研究发现了氯胺酮的快速抗抑郁作用[27，28］.钙/钙调素依赖性蛋白激酶II型的β型水平(βCaMKII)在抑郁动物模型的外侧缰上显著上调。的βCaMKII是NMDAR控制的下游因子之一。氯胺酮通过阻断外侧缰囊的nmdar依赖性爆发，可逆转奖赏中枢的抑制，产生快速的抗抑郁作用。

基于上述发现，我们假设EA可以改善疼痛和MDD。为了进一步揭示EA、共病和NMDARs之间的机制，我们建立了一个慢性疼痛和抑郁共病模型，并使用EA作为干预。这项研究通过行为观察和测量不同脑核的生物标志物，提高了我们对针灸治疗共病的理解。

2.方法

2．1．实验动物与伦理考量

所有动物均按照国家实验动物护理和使用健康指南进行治疗，研究方案经台湾台中中国医科大学伦理委员会批准(许可号:2017 - 374)。C57/B6雄性小鼠，体重约22-25克，8-12周龄，购自台湾台北市百乐asco动物中心。动物饲养在有机玻璃笼子内，温度控制(25±2℃)，相对湿度为60±5%，喂食标准鼠粮和随意饮水。

2．2.慢性炎性疼痛与抑郁模型

本研究分为四组。每组最少8只，作为实验所需的最小数量。所有的实验都是白天在实验室进行的。C57/B6小鼠随机(简单随机取样)分为4组，1%异氟醚麻醉，注射CFA, EA治疗。然后给老鼠注射20毫克μl生理盐水(pH值7.4，用20mm HEPES缓冲)或CFA 20μl(完全弗氏佐剂;0.5 mg/ml热杀结核分枝杆菌(Sigma, St. Louis, MO))作为以前的研究[29在后爪的足底表面。使用CFA诱导足底慢性炎症。20μL生理盐水和20μ在基线检查时、第7天和第14天三次给药1个CFA。四组及其治疗方法如下：（1）对照组：生理盐水注射麻醉；（2）慢性炎性疼痛（CIP）组：CFA注射麻醉，诱导慢性炎性疼痛和抑郁；（3）电针组：采用CFA注射和电针手法麻醉；（4）假电针组：采用CFA注射和假电针麻醉，以确定穴位所起的作用。

2．3.电针和假电针

电刺激治疗采用不锈钢针(1.5″寸，30G，郁光，台湾)刺入ST36穴肌层3 ~ 4mm深度。有几篇文章指出EA对ST36穴位的镇痛作用及途径[10，11］.由刺激器产生的电方波脉冲传送15 min -在2 Hz, 100μ在每个脉冲和1 mA振幅之间。第14天至第28天，每日上午2次(9:00-10:00)进行EA。对一个非穴位(距ST36 3毫米而不是GB34)进行同样的治疗[30，31])通过比较两组，我们旨在证明电针治疗下穴位的特异性[32]，研究人员证实，通过电针或手针不同的刺激部位，不同的传入纤维，如粗有髓鞘Aα和一个β有髓鞘的δ，刺激较薄的无髓鞘C纤维，其治疗效果不同。在本研究中我们不想探讨EA与手工针刺的不同效果，所以我们没有在ST36上建立手工针刺组。

２.４.慢性疼痛行为试验:冯·弗雷试验和哈格里夫斯试验

从足底注射CFA后第一天开始，每隔一天检测一次机械敏感性，连续28天。所有的实验都是在室温(约25°C)下进行的，刺激只在动物安静时进行，而不是在睡觉或梳理毛发时进行。通过测试三种von Frey电子细丝(North Coast Medical, Gilroy, CA, USA)对刺激的反应力来测量机械灵敏度。使用Hargreaves试验IITC镇痛仪(IITC Life Sciences, Woodland Hills, CA, USA)测量三种应用的平均热痛。

2．5．抑郁症行为测试:强迫游泳测试和开阔场地测试

采用EthoVision XT 8.5 (Noldus Information Technology, Wageningen, Netherlands)视频跟踪软件，在第28天的强迫游泳测试(FST)和开放场地测试(OFT)中自动对焦虑样行为进行评分。FST装置是一个塑料圆筒(高度47厘米，内径38厘米)，在25±1°C下包含38厘米的水。水位足够深(18厘米)，所以老鼠的尾巴永远不会碰到底部。每次试验之间都更换水。这些老鼠被暴露在强迫游泳的环境中，它们静止不动的行为被测量，并被认为是一种“类似抑郁”的表现型。FST包括两个阶段。在最初的15分钟习惯化阶段(作为一种训练过程，数据分析中排除了这一阶段)，小鼠被单独强迫在一个塑料圆筒中游泳。如果动物表现出严重的痛苦，如疲劳或漂浮的残疾，动物将被从水中移出，并被排除在实验之外。经过一段时间的剧烈游泳后，所有的老鼠都把它们的动作节省到只需要保持头部在水面上，没有其他的移动。24小时后开始5分钟的测试。 The duration of immobilization was measured. After the test, the mice were removed and dried with a towel before being returned to their home cages. Increased immobility in the forced swimming test was indicative of depression-like behavior.

OFT盒子由黑色丙烯酸塑料组成，形成一个30 × 30厘米的正方形，墙高15厘米。这个盒子被分成九个相等的正方形。开始时，每只老鼠被放置在一个开放区域的中心区域，允许它们探索迷宫15分钟。分析了穿越中心区的距离、在中心区的持续时间以及在开阔区域的总移动量。低频率穿过中心区或在中心区停留的时间较短被认为是抑郁症的验证。

2.6。组织取样和Western Blot

用一氧化碳处死小鼠₂以减轻他们的痛苦。在第28天收集前额皮质(PFC)、海马和下丘脑，然后立即切除以提取蛋白质。在含50 mM Tris-HCl pH 7.4、250 mM NaCl、1% NP-40、5 mM EDTA、50 mM NaF、1 mM Na3VO4、0.02% NaN的裂解液中制备总蛋白_3.，和1x蛋白酶抑制剂鸡尾酒(AMRESCO)。提取的蛋白质(30μ经8% SDS-Tris甘氨酸凝胶电泳，转移到PVDF膜上。在TBS-T缓冲液(10 mM Tris pH 7.5, 100 mM NaCl, 0.1% Tween 20)中，用5%脱脂乳阻断膜，用第一抗体(抗pnr1，抗nr1，抗pnr2b，抗nr2b和抗pcamkii)孵育α)，用1%牛血清白蛋白TBS-T，室温孵育1小时。二抗采用过氧化物酶偶联抗兔抗体(1:5000)。采用增强化学发光底物试剂盒(PIERCE)和LAS-3000 Fujifilm (Fuji Photo Film Co. Ltd.)进行标记。在适用的情况下，使用NIH ImageJ软件(Bethesda, MD, USA)对特定条带的图像强度进行定量。

2.7。免疫荧光染色

共4名受试者，来自Con、CIP、EA和假EA组，经吸入1%异氟醚麻醉，心内灌注生理盐水后再灌注4%多聚甲醛。立即解剖脑，用4%多聚甲醛在4°C下固定过夜。将固定后的组织置于30%蔗糖中过夜，4℃低温保护。大脑被嵌入OCT中，并在−80°C储存前立即用液氮冷冻。冠状面包括内侧PFC (mPFC)、海马CA1和下丘脑，切成16块μM厚切片。封闭液由3%牛血清白蛋白(BSA)、0.1% Triton X-100和0.02%叠氮化钠组成，室温下孵育2 h。阻断后，用一抗在4°C的BSA溶液中过夜孵育脑样本。二抗，过氧化物酶偶联抗兔抗体(1:5000)，室温孵育2 h，用盖片固定，免疫荧光显示。使用显微镜(Olympus, BX-51, Japan)，我们在mPFC、海马CA1和下丘脑切片中寻找免疫阳性神经元的存在。

2.8。统计分析

每组的实验结果都表示为平均值标准差。一个配对t组内、组间采用-检验和单因素方差分析进行统计分析。在单因素方差分析之后进行Tukey事后检验。如果 ．所有统计分析均使用SPSS for Windows (version 21.0, SPSS, Chicago, IL, USA)。

3.结果

3．1.电针显著减轻慢性疼痛和抑郁共病模型的机械和热痛觉过敏

如图所示1(一)在基础条件下，四组之间的机械敏感性没有差异。与对照组相比，CIP组和假电针组在第14天和第28天的痛阈显著降低，即机械性痛觉过敏（图1(一)， ，n= 8)。然而，EA显著减少机械性痛觉过敏(图)1(一)， ，n= 8)。数字1 (b)显示出类似的结果。在注射CFA前，各组的停药潜伏期无显著差异。然而，在第14天和第28天，CIP组和假EA组的戒断延迟(图1 (b)， ，n= 8)短于对照组(图1 (b)， ，n= 8)。有趣的是，EA也显著减少热痛觉过敏(图)1 (b)， ，n= 8)。

3．2.电针显著降低慢性疼痛和抑郁共病模型中的抑郁行为

第28天，oft的结果以图表形式公布1 (c)和1 (d)．四组小鼠在OFT总距离上表现相似。与对照组相比，CIP组和假手术组中央区域的距离明显缩短(图)1 (c)， ，n= 8)。EA显著增加了中心区域的距离(图)1 (c)， ，n= 8)。花费在OFT中心的时间百分比，如图所示1 (d)，显示了与图相似的结果1 (c)．第28天FST结果如图所示1 (e)和1 (f)．CIP组和假电刺激组固定时间百分比和计数固定频率均高于对照组。EA能降低小鼠的运动不稳定性。

3．3.电针可上调CIP小鼠脑内nmdar水平

为了检测CIP对NMDA水平的影响，我们研究了EA通过小鼠前额叶皮层(PFC)区域NMDA信号通路的影响。在CIP小鼠的PFC中，pNR1的表达明显降低(图)3.(一), ，n= 6)，经EA处理后，上述现象明显逆转(图6)3(一个)， ，n= 6)。此外，伪EA组pNR1表达显著降低(图)3(一个)， p小于0.05，n= 6)。在NR1蛋白水平上也得到了类似的结果(图)3 (b)，n= 6)。此外，与对照组相比，CIP组的pNR2B显著降低(图)3 (c)， ，n= 6)。相比之下，EA治疗显著逆转了这种下降(图)3 (c)， ，n = 6） .假电针手术对降低pNR2B蛋白水平没有影响（图3 (c)， ，n= 6)。值得注意的是，在NR2B蛋白表达中也观察到类似的趋势(图)3 (d)，n= 6)。沿着信号级联，我们接下来测试pCaMKII的蛋白质水平α．因此，我们发现pCaMKII的表达明显减少α在CIP组(图3 (e)， ，n= 6)。的pCaMKIIαEA组的蛋白水平显著升高(图3 (e)， ，n= 6)，但不是伪EA组(图3 (e)， ，n= 6)。上述结果表明，NMDA信号通路通常与慢性疼痛和抑郁共病小鼠相关。

我们接下来检查了小鼠海马中的NMDA信号通路。确定CIP诱导CIP小鼠中pNR1的显著减少（图4(一)， ，n = 6） .EA的pNR1水平显著增加（图4(一)， ，n= 6)，假EA组未观察到(图4(一)， ，n= 6)。在NR1蛋白水平上也有类似的趋势(图4 (b)，n= 6)。同样，pNR2B和NR2B的减少表明了在小鼠海马中观察到的类似趋势，显示CIP小鼠的蛋白质水平下降(图)4 (c)和4 (d)， ，n= 6)。此外，EA治疗对上述现象有效，而假EA组无效(图)4 (c)和4 (d)， ，n= 6)。的pCaMKIIα在CIP组中表达降低(图4 (e)， ，n= 6)，然后用EA治疗而不假EA治疗(图4 (e)， ，n= 6)。在小鼠的下丘脑中也观察到类似的趋势(图)5，n= 6)。

此外，我们利用免疫荧光技术鉴定pCaMKIIαmPFC、海马CA1和下丘脑的蛋白表达对慢性疼痛和抑郁至关重要。mPFC区图像显示pCaMKII明显降低α在CIP和伪EA组中。这些蛋白水平在EA组显著升高(图2(a))。此外，蛋白质pCaMKIIα海马CA1和下丘脑区域显示出相似的倾向(图)2(b)和2(c))。

4.讨论

机械和热痛觉过敏证实，注射CFA成功诱发炎症性疼痛。第28天，OFT期间中心广场的距离减少，FST期间的静止性增加，证明我们成功地诱导了抑郁症。从CIP组和EA组的差异可以看出，第14天至第28天EA组减轻了疼痛和抑郁。我们还通过对比电刺激组和假电刺激组的数据，证明了ST36穴位对改善共病的特异性。

抑郁和痛苦相互影响。它们还共享神经回路和分子信号通路;然而，相同的神经分子机制有时会在不同的大脑核心产生相反的效果[9，33］.例如，对左侧背外侧前额叶皮层进行高频重复经颅磁刺激(rTMS)是FDA批准的治疗耐药严重抑郁症的干预方法[34］.在接受rTMS的应答者中发现谷氨酸水平升高[35］.相比之下，外侧缰囊的谷氨酸兴奋性神经传递会导致抑郁[36，37通过抑制包括多巴胺能的腹侧被盖区和5 -羟色胺能的中缝背核等区域的奖赏中枢[27，28］.

一项研究报告称，在抑郁症患者的前PFC中，NMDAR亚基NR2A(- 54%)和NR2B(- 48%)表达减少[38］.磁共振波谱也显示PFC中谷氨酸/谷氨酰胺水平较低[39］.此外，一项研究指出，患有抑郁症的动物(1)海马区NMDAR亚基NR1和NR2A水平下降，(2)PFC中的NR1水平下降[40］.特别是，海马体积减少是MDD神经影像学研究中重复最多的发现[41］.下丘脑-垂体-肾上腺(HPA)轴过动和过动在抑郁症中已被报道，但使用HPA活动作为抑郁症生物标志物具有挑战性[42］.在慢性疼痛发展之前，HPA轴可能变得过度活跃;然而，长期过度活动可能导致压力系统衰竭，并最终导致HPA轴活性降低[43］.因此，我们(1)选择兴奋性谷氨酸受体家族的NMDAR亚型作为评价EA抗抑郁作用的主要生物标志物;(2)选择PFC、海马和下丘脑作为主要脑核进行研究。

在CIP组和伪EA组中，pNR1、NR1、pNR2B、NR2B和pCaMKII的水平α在注射三次CFA后，PFC、海马和下丘脑在第28天下降(图)3.- - - - - -5）.CIP组和假EA组的nmdar水平均低于对照组，EA扭转了下降趋势。在图中所示的大脑核中2，我们的免疫染色数据表明pCaMKII的蛋白水平α反映NMDA磷酸化控制的潜在下游信号机制在CIP组和假电针组中较低，并被EA逆转。本研究部分揭示了EA的抗抑郁作用，表明EA逆转了降低的谷氨酸兴奋性神经递质，如NMDARs和pCaMKIIα．我们的研究有一些局限性。首先，我们没有研究杏仁核、扣带皮层和腹侧被盖区等大脑区域，这些区域与慢性疼痛和抑郁相关。一些神经递质，如去甲肾上腺素和多巴胺，也可能受到共病的影响。其他神经递质拮抗剂的研究应该了解EA的进一步机制。

目前的研究为NMDA和相关分子如何参与慢性疼痛和抑郁行为提供了证据。EA显著逆转了小鼠PFC、海马和下丘脑中NMDA和相关分子的下降，表明参与了多个水平，并强调了在功能性治疗干预中利用它们的可能性。应进行临床试验，以明确TRPV1作为慢性疼痛和抑郁症共病治疗靶点的后续应用。

数据可用性

用于支持本研究发现的数据可由通讯作者要求提供。

的利益冲突

作者声明没有任何商业或金融关系的潜在利益冲突。

作者的贡献

黄红玉和廖先银构思了研究设计，进行了实验，并收集和分析了数据。手稿由廖宪银和林怡文撰写。所有的作者都审阅了手稿并同意提交。

致谢

本研究由中国医科大学附属医院资助，编号为:DMR-107-010、CMU108-MF-28、MOST 108-2320-B-039 -028 -MY3;“中国医科大学”，来自教育部“高等教育萌芽计划”框架下的特色领域研究中心项目。

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