口服溶液从超声提取物中制备的疗效黄常山对根艾美球虫属tenella在肉仔鸡

摘要

本研究旨在确定超声波提取物口服液的最佳剂量黄常山(UERD)，为肉鸡抗球虫治疗的安全临床剂量提供实验支持。黄常山采用超声波提取法制备根提取物。超声提取液制备的口服液的抗球虫活性黄常山根在肉鸡测试在用的场分离物的口腔感染大肠tenella．选用14日龄岭南黄肉仔鸡90只，随机分为9组(N= 10)，包括6个UERD口服溶液治疗(0.25、0.50、1.50、2.50、3.50、5.00%)，一个妥曲祖利组(0.10%)，一个大肠tenella感染的对照组和健康对照组。All groups were inoculated orally with 7 × 10^4.形成孢子大肠tenella除健康对照组外，广东株除外。7个药物治疗组的鸡被给予UERD口服溶液或toltrazuril在饮用水中连续7天。通过血痢严重程度、相对体重增加(rBWG)、病灶评分、每克卵囊数(OPG)和抗球虫指数(ACI)评价UERD口服液的抗球虫效果。与感染对照组相比，UERD口服液或妥曲祖利治疗组盲肠区病变变化无显著性差异( ）;然而，三个UERD口服液治疗组（0.50%、1.50%和2.50%）的血液含量、OPG和卵囊评分显著降低，血性腹泻也得到缓解。三个UERD口服液治疗组（0.50%、ACI = 143.7；1.50%，ACI = 151.0%和2.50%，ACI = 144.3）高于托曲苏利组（ACI） = 127.0），1.50%UERD口服液治疗组（95.0%）的rBWG与健康对照组（100%）相似，也比托曲苏利组（82.5%）高12.5%。本研究结果表明，UERD口服液（0.50% ～ 2.50%剂量范围）的预防、抗球虫疗效和促进生长效果优于托曲珠利（0.10%），根据目前的研究条件，1.50%剂量水平的乌尔德口服液在水中是临床推荐剂量。

1.介绍

鸡球虫病是一种由细胞内原生动物寄生虫引起的肠道疾病，属于球虫属艾美球虫属，而对鸡危害最严重的往往是由艾美球虫属tenella（大肠tenella)[1-3.]，导致盲肠上皮广泛破坏，粪便出血，体重增加减少，饲料转化率降低，发病率和死亡率增加。草药产品已被有效地用于控制和治疗家禽和人类的疾病。黄常山(RD)是干的根常山febrifuga不悦之色。那which belongs to the family of Saxifragaceae and is widely distributed in humid mountainous and other subtropical areas, such as the Sichuan, Guizhou, and Yunnan provinces in China.黄常山是著名的草药和传统上被用作抗疟药，祛痰，并根据张和黄[以前的报告数百年来在中国退热复合4.]和kirandeep等人。[5.].分析数据显示β-dichroine和α-二色胺是其主要抗球虫有效成分黄常山,β-二氯碱的有效药理活性高于α-dichroine [6.那7.］．此外，霍食酮氢溴酸盐是一种合成类似物β- 已用作预防欧盟和美国食品和药物管理局批准的家禽生产中的抗竞争饲料添加剂，以防止家禽生产中的椰子菌病。7.-9.］．然而，由于合成路线复杂，合成成本高，在临床上的应用受到了限制。不幸的是，随着化学预防和抗球虫饲料添加剂的广泛使用，球虫病得到了控制，但也伴随着耐药性的出现[10那11]及对动物健康的毒性影响[12]此外，家禽产品中的药物或抗生素残留可能会给消费者带来麻烦。因此，正在寻求替代策略，以更有效、更安全地控制鸡球虫病，这已成为家禽业的当务之急[13那14]，植物治疗已被研究作为控制球虫感染的替代方法，一些草药提取物已被证明对控制球虫病有效。黄常山作为一个单一的草药或在治疗过程中的草药制剂复杂主草本植物使用时具有抗球虫鸡性能;然而，活性成分的含量（即，总生物碱和β-二氯碱)的粗提物黄常山在上述抗球虫药物(单一黄常山或黄常山复杂)一直较低。因此，在本研究中，从干根中提取总生物碱作为有效成分黄常山采用改良的植物药提取分离技术，提高了植物药的含量β-dichroine。此外，考虑到口服液中的成分比粉末固体中残留的成分更容易接触并与寄生虫相互作用，优化了生产工艺，制备了超声提取的口服液黄常山(UERD)以改善治疗效果和在临床环境中使用的便捷性。因此，本研究的目的是确定UERD口服液潜在的抗球虫活性;复制了鸡球虫病的病理模型大肠tenella为进一步探讨UERD口服液的疗效，并确定临床应用的最佳剂量。采用标准的寄生虫学程序作为替代植物药物和处方将有助于控制鸡球虫病。

2.材料和方法

2．1.超声波提取液的制备黄常山

黄常山根源从兰州黄河中药市场购买，并确定为干燥的根黄常山属Bergenia从中国医学甘肃工业大学家庭虎耳草科蕴借李教授。凭证标本保存在药学院标本馆（药用植物采集）的黄常山(凭证号:GUCM 621222130517114 LY)。两百克干的黄常山使用电动研磨机，将根部研磨成粉末，然后提取黄常山采用超声波提取法提取根。提取溶剂为2%盐酸，料液比为1:6 (g/mL, w/v)。采用80 W的超声波功率，在50℃下提取1 h，共分为3个提取阶段。将各阶段收集的上清液汇集在一起，用少量氯仿去除杂质，然后用强氨调节pH值至10。该溶液用氯仿提取3次，回收的氯仿提取物中含有该提取物黄常山浓缩，干燥，研磨成粉末。最终产品约为25.80 g干浸提粉，总收率为12.90% (w/w)。总生物碱的平均含量β-dichroine在其中分别为4.79％和0.18％。The optimal production conditions for the oral solution preparation of UERD were 120 mg UERD powder dissolved in 100 mL of a solution, by a prepared solution of 1.5% Tween-80 and 0.5% sodium benzoate in distilled water (1.20 mg/mL, w/v) to obtain the test solution with a pH value of 5–6 that was stored at 4°C until use. The positive control drug was toltrazuril (2.5%, w/v, Bayer (Sichuan) Animal Health Co. Ltd, China), administered in drinking water at the recommended dose of 0.10% (v/v).

2.2.实验动物

选取来自兰州华龙商业孵化场的90只1日龄岭南黄肉鸡，在无球虫分离设施中饲养，在以下条件下自由饲喂不含抗球虫药物和抗生素的商品饲料14 d:温度(23±2℃)、相对湿度(55±15%)、通风(18次/h的换气率)。为确认鸡在实验接种前无感染，采用盐浮法和光镜法对粪便样本进行分析，以确保没有卵囊。所有动物护理程序均按照《兽医实验室生物安全指南》(中国农业部指南，2012)执行[15］．本研究方案经中国农业科学院兰州畜牧与药物研究所动物研究伦理委员会批准。

２.３.的制备大肠tenella卵囊

的卵囊大肠tenella(广东株)是从死于鸡群中分离得到的大肠tenella中国农业科学院兰州兽医研究所，动物病原生物学国家重点实验室，1996年在广东花都感染，经rRNA基因内转录间隔区镜检和序列分析证实。将卵囊在不含卵囊的肉鸡体内繁殖大肠tenella于感染后第6、7、8、9天收集粪便。在适宜的湿度和温度(28°C)下，将未生孢子的卵囊置于2.5%重铬酸钾溶液中形成孢子。用Foreyt提到的McMaster技术用水清洗孢子状卵囊并进行计数[16］．

２.４.研究设计

选取未感染球虫的14日龄岭南黄肉仔鸡90只，分别称重，随机分为9组(N= 10)。14日龄时，鸡分为IC组(感染/阳性对照组;参与和大肠tenella感染的），DC（阳性药物对照组），A，B，C，D，E和F口服感染7.0×10^4.形成孢子大肠tenella卵囊。在实验过程中每天观察并记录临床症状。根据Holdsworth等人的方法，感染的迹象被定义为带血腹泻的粪便中存在卵囊[17］．15日龄时，除HC组(健康/阴性对照组;未治疗和未感染)，IC组开始药物治疗。DC组(药物对照组)饲喂饮水中剂量为0.10% (v/v)的妥曲祖利，连续饲喂7 d。A、B、C、D、E、F组鸡用6种UERD口服液处理，分别以0.25、0.50、1.50、2.50、3.50、5.00% (v/v)的水剂灌胃7 D。每组分配到一个大型网箱中，每组设置一个托盘捕捉粪便物质。22日龄时，对存活的鸡分别称重后，人道处死所有鸡进行盲肠病变分级，计算各组的存活率。

2．5．数据收集

2.5.1。体重、增重和粪便评分

每只鸡在14天前称重大肠tenella感染和试验结束时(感染后8天);此外，所有存活的鸡在扑杀前都被单独称重。计算14-22天的个体和平均体重增重。相对体重增重(rBWG)的计算公式如下:BWG =最终体重-初始体重;体增重率(%)=(最终体重-初始体重)÷初始体重× 100%;rBWG(%) =(感染对照组或药物治疗组BWG率÷健康对照组BWG率)× 100%。在整个试验期间，每天记录所有鸡的血痢和死亡率。存活率(%)=(各组存活鸡数÷各组初始鸡数)× 100%。根据莫尔豪斯和巴伦的方法，在感染后4-7天内肉眼检查粪便是否有血性腹泻[18]，根据所、李的评价标准分为5个等级(0、1、2、3、4)[19］．排名如下：0（正常），没有血腥样本;1,25％血腥腹泻;2,50％血腥腹泻;3,75％的血腥腹泻;4，4或更多堆血淋淋的腹泻。

2.5.2.卵囊计数和盲肠病变评分

上天5，6，和感染后7中，每个组的日总粪便收集，并使用麦克马斯特室[测定每日卵囊产16］．在感染后第8天对幸存的鸡实施安乐死，并立即使用Johnson and Reid的病变评分技术检查和评估盲肠病变评分[20.］．采用等级评分系统(0 - 4)。病灶评分=各组病灶平均评分× 10。

然后，盲肠内容物被磨碎，并使用麦克马斯特的方法确定每个鸡的盲肠池内容的卵囊数。结果被表示为基于焦[方法每克卵囊（OPG）21］．基于以下OPG值计算卵囊值：一个OPG≤0.10.1之间给了一个卵囊值0，一个OPG和1.0给出的1的卵囊值，2.0和5.0之间的OPG得到的10的卵囊值，6.0和10.0之间OPG得到20的卵囊值和OPG≥11.0得到的40的卵囊值。

美国默沙东公司建立的抗球虫指数(ACI) [22]，计算为ACI = (rBWG +生存率)× 100−(病变评分+卵囊值)。

2.6。统计分析

使用SPSS 17.0软件（SPSS Inc.，Chicago，IL，USA）分析数据。通过Kruskal-Wallis H试验比较血淋淋的腹泻，结果表达为中值频率（四分位数，95％置信区间）。The parameters of mean body weight for each time point, body weight gain, and mean lesion score were conducted using one-way analysis of variance, followed by a LSD (least significant difference) test, Dunnett’s post hoc test, or Duncan’s multiple range test, which were used to test the significance between different groups at the level of ．The results are expressed as the means ± SD.

3.结果

3．1.临床症状和带血腹泻

一旦感染孢子菌大肠tenella卵囊、鸡用了3天时间来显示不同程度的感染临床症状，包括抑郁、食欲不振、嗜睡、羽毛紊乱、怕冷和蜷缩。从感染后第4天到第7天，所有感染组均观察到血性腹泻。IC组出现最严重的血性腹泻（感染组/未治疗组），其血球得分高于任何其他组（血球得分中位数） = 4. )，followed by group A (bloody score (median) = 4, )，F组（血腥分数（中位数）= 2）和Toltrazuril组（血腥分数（中位数）= 2）。用尿道口服溶液（0.50,1.50,2.50和3.50％）处理的四组中血性腹泻和粪便评分的程度较轻，在7种药物治疗组中较轻，较高，血腥分数为5.00％腔室口服溶液组类似于Toltrazuril组中的组。肉鸡鸡施用的腔室口服溶液和耐苯甲尿显示出低于感染/非生成基团的血腥的分数（<3点，除A组），并且物理条件和饲料摄入量明显改善。在阳性感染对照组（组IC）中的三只鸡死于可触诊感染;在0.10％Toltrazuril组和四个宿尿道溶液治疗组（0.25,1.50,3.50和5.00％）中，一只鸡已死亡大肠tenella各组间感染情况(表1)．

3.2.病理解剖、OPG和卵囊计数

在8^th接种后第一天，将所有存活的鸡人道处死进行盲肠病变分级，病变评分结果见表2．阳性受感染对照组（组IC）中的鸡在剖视区显示出显着的肿胀，含有大量的血液样品内容物，并且在十二指肠区发现出血斑点和点。在实验组中的所有鸡中也发现肠道损伤;然而，胃溶液治疗组六个胃肠病变的程度低于感染对照组的胃肠溶液处理基团和耐受性对照组。发现其他器官中没有明显病变，只有少数感染的鸡显示严重的宏观可见病变。在7个药物治疗组中，施用0.10％耐药尿的病变评分最高;然而，6个宿尿治疗组和Toltrazuril对照组之间的病变评分没有显着差异。

如表所示2，除健康对照组（HC组）外，乌尔德口服液和托曲苏利治疗组的所有鸡的卵囊数均减少。感染对照组（IC组、OPG组）的OPG和卵囊输出量减少 = 6.79 × 10^6.)在孢子感染组中最高大肠tenella卵囊。0.10%妥曲祖利组(DC组)卵囊产量最低，OPG为3.11 × 10^6.．B、C、D组(0.50、1.50、2.50% UERD口服液)和DC组(0.10%妥曲祖利)的OPG和卵囊值均显著低于IC组(感染/未治疗组)。而UERD口服液剂量为3.50%和5.00%时，鸡的OPG和卵囊值与感染对照组(IC组)相似。

３．３．经济增长促进

C组给予1.50% UERD口服液的rBWG(95.0%)与HC组(100%)相似，比DC组(0.10%妥曲祖利;82.5%)。0.50、1.50、2.50% UERD口服液和0.10%妥曲祖利处理组鸡的平均末重与HC组无显著差异，与IC组有显著差异( )．此外，5.0% UERD口服液处理F组鸡的rBWG与IC组相似且较IC组低。

3.4.抗球虫指数（ACI）

6种UERD口服液治疗和妥曲祖利治疗的ACI值均高于感染对照组(IC组)。ACI值以C组(1.50% UERD口服液，ACI = 151.0)最高，其次为D组(2.50% UERD口服液，ACI = 144.3)和B组(0.50% UERD口服液，ACI = 143.7)。此外，三个uerd治疗组的ACI值均优于妥曲祖利治疗组(ACI = 127.0)。然而,随着剂量的增加UERD口服溶液,ACI的值在E组(3.50% UERD口服溶液,ACI = 118.0)和F组(5.00% UERD口服溶液,ACI = 111.1)显著降低,和从六UERD-treated ACI价值最低的团体在A组(ACI = 99.1)(表2)．

4.讨论

椰子症是全球家禽业所面临的最大挑战之一，并导致年损失，包括降低生产力和抗癌药物和疫苗的使用，估计在全球约有30亿美元[13那23那24］．目前，除化学合成防治鸡球虫病效果良好的药物外，还采用化学预防和抗球虫饲料添加剂来控制球虫病的传播。对上述药物的抗球虫作用及机制进行了大量的研究[25］．然而，由于抗药性的出现以及这些添加剂对动物健康的毒性作用，这些方法变得复杂起来[10-12］．此外，家禽产品中的药物残留是潜在的约束，可能对消费者有害。迄今为止，科学评估了32种植物和40种植物植物中的抗痛活性[26那27］．由于来自中药（TCMS）和化学合成药物的不同来源，这两种药物之间的功能，机制和治疗理论在预防和控制鸡球率衰期的过程中很大程度上不同;此外，TCM通常被特征为呈现多元，多通道和对疾病的协同影响。根据循证医学理论，从外源性情感到潮湿的鸡椰子症的下级综合征，脾脏在大肠中潮湿后立即显示功能障碍。这导致急性毒性急性出血，表达血腥的腹泻，因此鸡球虫病的治疗原则应该优先消除热量和潮湿，这将冷却血液并阻止腹泻。黄常山是一个着名的草药，用作中药中的抗疟疾，祛痰和抗真用药，并通过Jang等人研究了其抗疟药性的药理学活动。1948年[28]此外，当它单独使用或作为复合配方中的主要草药使用时，它对感染球虫病的鸡也有抗球虫作用。先前研究的结果表明黄常山和β-二氯碱能促进小鼠脾脏T淋巴细胞和B淋巴细胞的增殖，对小鼠巨噬细胞有较好的免疫增强活性[9.］．此外，Wang等人的毒理学测试结果。（2018）证明超声波提取物黄常山根具有较低的毒性，并且在长期给药后，在高剂量下在肝脏、肾脏、脾脏和肺中显示出剂量依赖性毒性[29]因此，本研究的目的是研究一种口服液的抗球虫活性，该口服液是由黄常山研究UERD口服液在常规剂量条件下是否可作为一种有效及安全的中药使用，以及是否适合长期临床应用以对抗球虫病。

由于家禽与反刍动物具有不同的胃肠道结构，鸡不可能完全消化吸收其粗提物黄常山．此外，它容易导致胃肠功能障碍，这又大大降低了其抗癌效果，导致原始药物的大量浪费。因此，开发口腔悬浮液的超声提取物黄常山可以确保使用最高药物含量并满足口服给药的流动性要求。其次，口服溶液制备具有稳定的质量，快速吸收，良好的疗效以及安全和卫生临床应用，这方便吸收和利用鸡，因此可以更好地施加抗突动力。大肠tenella是最具致病性的鸡球虫，主要寄生在盲肠区，在盲肠区活动性感染以腹泻和大量盲肠出血为特征。感染大肠tenella通常导致粘颈壁肿胀和损伤，这改变了鸡肉肠的正常功能[30.］．在本研究中，感染对照组的血性腹泻延长且严重，特别是在感染后(PI)第4、5、6和7天(表)1)，这是生命周期中最重要的日子大肠tenella当三只鸡死于球虫病感染。感染的迹象，通过饮水补充UERD口服液和妥曲珠利缓解。与感染对照组相比，盲肠损伤的严重程度与UERD口服溶液和妥曲珠利，和卵囊值和OPG药组中显著改善了药物处理组中都降低（除了5.00％UERD口服溶液治疗组）。在本研究中的研究结果表明，剂量为0.50，1.50和肉鸡能显著提高rBWG这一挑战后感染对照组相比，2.50％是UERD口服液与孢子大肠tenella．此外，按上述推荐剂量给予UERD口服液后，鸡血粪量、OPG和卵囊评分均有改善。可以证实超声波提取的是单一的草药黄常山根提取物具有针对一个疗效大肠tenella肉鸡的感染。然而，与其他药物治疗组相比，服用0.25%和5.00%UERD口服液的鸡的rBWG较低，而rBWG与感染对照组相似；这种rBWG降低可能是由于较低剂量的UERD口服液（含有活性成分含量不足（例如β-dichroine)。然而，对于较高剂量的UERD口服液，过量活性成分的毒性反应可能会阻碍鸡的生长，造成较高的OPG值(上文提到)。

病变评分，OPG和ACI值是通常应用参数，用于评估动物药物的抗癌疗效。在该研究中，在感染的对照组中观察到最高病变评分和最低的ACI值，其次是0.25％，3.50％和5.00％的腔室口服溶液处理，其显示出低损病变分数和更高的ACI值。此外，在3个宿群口服溶液处理基团（0.50,1.50和2.50％）和0.10％耐药尿治疗组中，观察到类似的病变评分和卵囊值，但较高的ACI值，其中0.10％Toltrazuril具有较低的OPG和ACI值．这些结果表明，腔室口服溶液和Toltrazuril对肠粘膜产生了更好的保护作用，并且腔室口服溶液在0.50％〜2.50％范围内的浓度显示出比本研究中的0.10％耐药菌在0.10％的耐受性效果。此外，尽管两个最高宿尿道溶液治疗的抗痛作用（3.50％和5.00％）优于那些大肠tenella -感染对照组，高剂量饮用水给药的UERD口服液可能产生药物毒性，对临床上的鸡有害。在本研究中，所有药物治疗组的ACI值均小于160，这可能与药物的毒性有关大肠tenella在测试（广东株）菌株选择。的场分离大肠tenella(广东株)从动物病原生物学国家重点实验室获得，长期被Li等用于鸡球虫病的研究。[31］．The virulence of this field isolate is stronger, and the mortality caused by it ranged from 10% to 20% after the chickens were inoculated with 7 × 10^4.的孢子化卵囊大肠tenella在一个月之内。一般而言，在抗球虫药物的实验设计中，感染对照组的死亡率在5%至10%之间被认为是最优的。然而，在本研究中，7 × 10的攻毒后^4.的孢子化卵囊大肠tenella(广东株)，感染对照组的死亡率达到30%，由此可以推断，8个药物处理组的鸡都倾向于接种较高剂量的孢子化剂大肠tenella卵囊。虽然本研究中妥曲祖利和6种UERD口服液治疗的ACI值较低，但仍可从结果中得出药物剂量与抗球虫作用之间的关系;即UERD口服液按推荐剂量0.50% (ACI = 143.7)、1.50% (ACI = 151.0)、2.50% (ACI = 144.3)饮水给药，其抗球虫效果优于0.10%妥曲珠利(ACI = 127.0)。考虑到临床用药成本和肉鸡生长性能，1.50% UERD口服液应作为肉鸡临床推荐剂量。

5.结论

本研究发现，UERD口服液治疗组(0.50、1.50和2.50%)的保护率高于妥曲祖利治疗组(0.10%)。添加UERD口服液可提高感染雏鸡的体重和成活率大肠tenella(广东株)，减少出血腹泻、卵囊排出量和盲肠区病变评分。结果表明，UERD口服液在0.50% ~ 2.50%剂量范围内的抗球虫作用和促生长效果优于妥曲祖利大肠tenella卵囊。用超声波提取液配制的口服液黄常山口服UERD口服液可预防、治疗、间断性治疗，治疗7 d后疗效良好大肠tenella -被感染的鸡。

数据可用性

用来支持这项研究的结果的数据是可用的，请相应的作者。

伦理批准

中国农业科学院兰州畜牧与药学研究所动物研究伦理委员会批准了本研究使用的方案。所有适用的国际、国家和/或机构指导方针的照顾和使用动物。

的利益冲突

作者声明他们没有利益冲突。

作者的贡献

郭志廷对这项工作做出了贡献。

致谢

甘肃中医药大学的支持与合作得到了感谢地承认。作者谨此感谢Yun Li，Hang Zhang博士和重点实验室的员工。该研究得到了甘肃省（18JR398）的自然科学基金，以及中国中央政府的专门基础科学研究机构（1610322017018）。本研究的资助者（Ling Wang和Zhiting Guo）设计和执行了实验工作，分析了统计数据，解释了结果，并在稿件被接受出版后提供页面费用。

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