2。材料和方法
2.1。<斜斜肌的超声提取物的口服液体制备斜体>
黄常山 根源从兰州黄河中药市场购买,并确定为干燥的根
黄常山 在属中
伯格尼亚 甘肃中医药大学李云教授对石杉科植物进行了研究。代金券标本保存在药学院植物标本室(药用植物收藏)
黄常山 (优惠券号:GUCM 621222130517114 LY)。两百克干
黄常山 使用电动研磨机,将根部研磨成粉末,然后提取
黄常山 使用超声提取方法进行根。使用两种盐酸作为萃取溶剂,固体液体比为1:6(g / ml,w / v)。超声波功率在80W下使用,在50℃下提取1小时,使用3个提取阶段。将从每个阶段收集的上清液聚集在一起,用少量氯仿除去杂质,然后用强氨酸调节pH值至10。用氯仿萃取溶液3次,并含有含有提取物的回收的氯仿提取物
黄常山 浓缩,干燥,研磨成粉末。最终产品约为25.80 g干浸提粉,总收率为12.90% (w/w)。总生物碱的平均含量
β -二氯碱的含量分别为4.79%和0.18%。口服溶液制备的最优生产条件UERD 120毫克UERD粉末溶解在100毫升的一个解决方案,准备解决1.5%渐变- 80和0.5%苯甲酸钠在蒸馏水(1.20毫克/毫升,w / v)获得的测试溶液的pH值5 - 6是储存在4°C到使用。阳性对照药物为托曲祖利(2.5%,w/v,中国拜耳(四川)动物卫生有限公司),推荐剂量为0.10% (v/v)。
2.2.实验动物
选取来自兰州华龙商业孵化场的90只1日龄岭南黄肉鸡,在无球虫分离设施中饲养,在以下条件下自由饲喂不含抗球虫药物和抗生素的商品饲料14 d:温度(23±2℃)、相对湿度(55±15%)、通风(18次/h的换气率)。为确认鸡在实验接种前无感染,采用盐浮法和光镜法对粪便样本进行分析,以确保没有卵囊。所有动物护理程序均按照《兽医实验室生物安全指南》(中国农业部指南,2012)执行[
15. ].研究议定书由兰州救世和中国农业科学院制药学院动物研究伦理委员会(CAAS)批准。
2.3。<斜斜体> e的制备。tenella 斜体>卵囊
卵囊
大肠tenella (广东株)是从死于鸡群中分离得到的
大肠tenella 中国农业科学院兰州兽医研究所,动物病原生物学国家重点实验室,1996年在广东花都感染,经rRNA基因内转录间隔区镜检和序列分析证实。将卵囊在不含卵囊的肉鸡体内繁殖
大肠tenella 口服感染,粪便收集在发电(PI)天6,7,8和9上收集。通过在合适的湿度和温度(28°C)下将孢子料中施放在2.5%的二铬酸钾溶液中.用水清洗孢子般的卵囊,并由Foreyt提到的McMaster技术计数[
16. ].
2.4。学习规划
共有九十岭南黄色肉鸡(14天老),单独称重枸杞感染,并随机分为九个群体(
n = 10). At 14 days of age, the chickens in groups IC (infected/positive control group; nontreated and
大肠tenella DC(阳性药物对照组),A、B、C、D、E、F口服7.0 × 104 孢子化
大肠tenella 卵囊。在实验期间每天观察和记录临床迹象。根据Holdsworth等人的方法,感染迹象被定义为粪便中的粪便中的卵囊存在血液腹泻。[
17. ].15日龄时,除HC组(健康/阴性对照组;未治疗和未感染),IC组开始药物治疗。DC组(药物对照组)饲喂饮水中剂量为0.10% (v/v)的妥曲祖利,连续饲喂7 d。A、B、C、D、E、F组鸡用6种UERD口服液处理,分别以0.25、0.50、1.50、2.50、3.50、5.00% (v/v)的水剂灌胃7 D。每组分配到一个大型网箱中,每组设置一个托盘捕捉粪便物质。22日龄时,对存活的鸡分别称重后,人道处死所有鸡进行盲肠病变分级,计算各组的存活率。
2.5。数据采集
2.5.1。体重、增重和粪便评分
每只鸡在14天前称重
大肠tenella 感染和试验结束时(感染后8天);此外,所有存活的鸡在扑杀前都被单独称重。计算14-22天的个体和平均体重增重。相对体重增重(rBWG)的计算公式如下:BWG =最终体重-初始体重;体增重率(%)=(最终体重-初始体重)÷初始体重× 100%;rBWG(%) =(感染对照组或药物治疗组BWG率÷健康对照组BWG率)× 100%。在整个试验期间,每天记录所有鸡的血痢和死亡率。存活率(%)=(各组存活鸡数÷各组初始鸡数)× 100%。根据莫尔豪斯和巴伦的方法,在感染后4-7天内肉眼检查粪便是否有血性腹泻[
18. ],根据所、李的评价标准分为5个等级(0、1、2、3、4)[
19. ].等级为:0(正常),无血样本;25%的血性腹泻;2、50%痔疮血性腹泻;3、75%痔疮血性腹泻;4次或4次以上的带血腹泻。
2.5.2。卵囊计数和盲肠病变评分
分别于感染后第5、6、7天收集各组日粪便总量,采用McMaster法测定日卵囊产量[
16. ].在感染后第8天对幸存的鸡实施安乐死,并立即使用Johnson and Reid的病变评分技术检查和评估盲肠病变评分[
20. ].采用级别评分系统(从0到4)。病变得分=每个组×10的平均病变得分。
粉碎盲肠内容物,采用麦克马斯特法测定每只鸡盲肠汇集内容物中的卵囊计数。根据JIAO方法,结果以每克卵囊数(OPG)表示[
21 ].卵囊值计算功能基于以下值:一个功能给出了一个卵囊值0≤0.1,0.1和1.0之间的功能给出了卵囊的值为1,2.0和5.0之间的功能给一个卵囊值为10,6.0和10.0之间的功能给出了卵囊的价值20,功能和一个40给一个卵囊值≥11.0。
美国默沙东公司建立的抗球虫指数(ACI) [
22 ],被计算为ACI =(RBWG +存活率)×100-(病变得分+卵囊值)。
2.6。统计分析
使用SPSS 17.0软件(SPSS Inc.,Chicago,IL,USA)分析数据。通过Kruskal-Wallis H试验比较血淋淋的腹泻,结果表达为中值频率(四分位数,95%置信区间)。The parameters of mean body weight for each time point, body weight gain, and mean lesion score were conducted using one-way analysis of variance, followed by a LSD (least significant difference) test, Dunnett’s post hoc test, or Duncan’s multiple range test, which were used to test the significance between different groups at the level of
P
<
0.05
.结果表示为平均值±SD。
3.结果
3.1。临床症状和血淋淋的腹泻
一旦感染了孢子
大肠tenella 鸡卵囊感染后3天出现不同程度的临床症状,包括抑郁、食欲不振、嗜睡、羽毛紊乱、怕冷、蜷缩等。所有感染组在感染后第4至7天均见血性腹泻。血性腹泻最严重的是IC组(感染/未治疗组),其血性得分高于其他任何组(血性得分(中位数)= 4,
P
<
0.05
),其次为A组(血血评分(中位数)= 4,
P
<
0.05
)、F组(血常规评分(中位数)= 2)、妥曲祖利组(血常规评分(中位数)= 2)。出血性腹泻,粪便的程度评分与UERD四个治疗组口服溶液(0.50,1.50,2.50,3.50%)被打火机和温和7药物治疗组,和血腥的分数在5.00% UERD口服液组类似于toltrazuril组。注射UERD口服液和妥曲祖利的肉鸡血分数低于感染/未处理组(除A组外<3分),身体状况和采食量均有明显改善。阳性感染对照组(IC组)3只鸡死于球虫感染;0.10%妥曲祖利组和4个UERD口服液治疗组(0.25、1.50、3.50、5.00%)1只鸡死于
大肠tenella 各组间感染情况(表
1 ).
表1
肉仔鸡在感染后第4至7天出现血性腹泻及死亡情况(
n = 10).
组 药物水平(v / v, %)
死亡人数
死亡率(%)
发布日子
总血腥粪便
血腥的分数(中位数)
4th
5th
6th
7th
HC组 参与和未感染 健康控制(HC)
0
0
0
0
0
0
0
0一个
IC组未治疗且感染 感染控制(集成电路)
3.
30.
3.6
4.0
4.0
4.0
15.6
4c
组DC. 0.10% toltrazuril 阳性药物管制(DC)
1
10.
2.8
2.8
2.0
1.2
8.8
2英航
A组 0.25%uerd口腔解决方案
1
10.
3.0
3.0
2.8
2.8
11.6
4c
B组 0.50% UERD口服液
0
0
2.4
2.0
2.0
1.0
7.4
0一个
C组 1.50% UERD口服液
1
10.
2.4
2.4
1.6
1.6
8.0
0一个
D组 2.50%uerd口腔解决方案
0
0
2.4
2.0
1.6
1.6
7.6
0一个
E组 3.50% UERD口服液
1
10.
2.4
2.4
2.0
2.0
8.8
0一个
F组 5.00% UERD口服液
1
10.
2.8
2.8
2.4
2.4
10.4
2英航
UERD:超声波提取
黄常山 .不同上标的列有显著差异(
P
<
0.05
).
3.2。病理解剖学,OPG和卵囊计数
8日th 接种后的一天,对粘椎间病变的分级,人道地牺牲了所有存活的鸡,并且病变评分结果如表所示
2 .阳性受感染对照组(组IC)中的鸡在剖视区显示出显着的肿胀,含有大量的血液样品内容物,并且在十二指肠区发现出血斑点和点。在实验组中的所有鸡中也发现肠道损伤;然而,胃溶液治疗组六个胃肠病变的程度低于感染对照组的胃肠溶液处理基团和耐受性对照组。发现其他器官中没有明显病变,只有少数感染的鸡显示严重的宏观可见病变。在7个药物治疗组中,施用0.10%耐药尿的病变评分最高;然而,6个宿尿治疗组和Toltrazuril对照组之间的病变评分没有显着差异。
表2
UERD口服液对肉鸡卵囊排出量、损伤评分及抗球虫活性的影响
大肠tenella (广东菌株)(
n = 10).
组
初始体重(g)
最终体重(g)
BWG(g)
伯明翰线规率(%)
rBWG (%)
存活率(%)
意思是病变评分
病变评分
功能(×106 )
卵囊的价值
反闭经指数(ACI)
药物水平(v / v, %)
HC组 参与和未感染 健康控制(HC)
247.9±16.8一个
366.7±24.0.b
118.8±12.4.b
48.0
100.
100.
0
0
0
0
200
IC组未治疗且感染 感染控制(集成电路)
239.6±22.6一个
319.4±15.9一个
78.6±8.0一个
32.9
68.5
70
3.85±0.21一个
38.5
6.79
20.
80.0
组DC. 0.10% toltrazuril 阳性药物管制(DC)
244.9±23.1.一个
347.3±18.9b
98.0±8.8.b
39.6
82.5
90
3.55±0.46一个
35.5
3.11
10.
127.0
A组 0.25%uerd口腔解决方案
256.4±24.3一个
316.3±29.5一个
64.3±11.1.一个
25.5
53.1.
90
3.40±045.一个
34.0
5.22
10.
99.1.
B组 0.50% UERD口服液
251.3±19.7一个
355.9±34.2.b
104.6±19.9b
41.6
86.7
100.
3.30±0.38一个
33.0
4.30
10.
143.7
C组 1.50% UERD口服液
255.7±24.6一个
371.2±26.5.b
115.5±9.22b
45.6
95.0
100.
3.40±0.36一个
34.0
4.44
10.
151.0
D组 2.50%uerd口腔解决方案
247.8±20.2.一个
352.3±40.2b
104.5±21.6.b
41.9
87.3.
100.
3.30±0.49一个
33.0
4.80
10.
144.3.
E组 3.50% UERD口服液
248.7±18.8一个
339.4±31.0一个
94.3±19.9b
38.4
80.0
90
3.20±0.45一个
32.0
6.11
20.
118.0
F组 5.00% UERD口服液
252.9±17.5一个
336.2±25.2一个
85.7±14.8一个
33.9
70.6
90
2.95±1.20一个
29.5
8.11
20.
111.1.
A-B. 意味着±SD;表示同一栏内不同上标有显著差异(
P
<
0.05
).BWG:体重增加;rBWG:相对体重增加;OPG:每克卵囊数;UERD:超声波提取
黄常山
如表所示
2 除健康对照组(HC组)外,UERD口服液和妥曲祖利处理组的鸡卵囊数均下降。感染对照组(IC组,OPG = 6.79 × 106 )在孢子感染组中最高
大肠tenella 卵囊。0.10%妥曲祖利组(DC组)卵囊产量最低,OPG为3.11 × 106 .B组B,C和D中的OPG和卵囊值(0.50,1.50和2.50%uerd口服溶液)和组DC(0.10%Toltrazuril)显着低于IC(感染/非生成基团)。然而,在3.50%的剂量为3.50%和5.00%的杂志中施用腔室的口腔溶液,显示出与受感染对照组(Group IC)的OPG和卵囊值相似。
3.3。增长促进
C组的RBWG施用1.50%宫腔液溶液(95.0%)与HC(100%)的胃溶液(95.0%)相似,比群体DC(0.10%Toltrazuril; 82.5%)高12.5%。患有0.50,1.50和2.50%的宫腔溶液和0.10%耐药菌治疗的组中的鸡与群体HC的平均最终重量没有显着差异,而与IC组相比,差异有显着差异(
P
<
0.05
).此外,用5.0%宫腔溶液处理的F组中的鸡具有类似且较低的RBWG与Gloup IC相比。
3.4.Anticoccidial指数(ACI)
六个宿群口服溶液处理和耐苯唑啉处理中的ACI值均高于受感染对照组(组IC)。在C组(1.50%uerto溶液,ACI = 151.0)中观察到最高的ACI值,然后是D组(2.50%uerto溶液,ACI = 144.3)和B组(0.50%腔室口服溶液,ACI = 143.7).此外,这三个宿腔处理基团中的ACI值优于Toltrazuril处理(ACI = 127.0)。然而,随着腔室的剂量增加,e组(3.50%uertAl溶液,ACI = 118.0)和F组(5.00%uertAl溶液,ACI = 111.1)显着下降,并且ACI值最低的ACI值从A组(ACI = 99.1)中观察到六个uerd治疗组(表
2 ).
4.讨论
球虫病是全球禽业面临的最大挑战之一,每年造成损失,包括生产力下降和抗虫药和疫苗的使用,估计全球损失约30亿美元[
13. ,
23 ,
24 ].目前,除了具有优异效率的药物的化学合成之外,化学丙基和反递送饲料添加剂用于控制椰子症的蔓延,除了预防和治疗鸡球虫病,包括Diclazuril,Toltrazuril和Halofuginone。已经对上述药物的抗痛作用和机制进行了许多研究[
25 ].然而,由于抗药性的出现以及这些添加剂对动物健康的毒性作用,这些方法变得复杂起来[
10. - - - - - -
12. ].此外,家禽产品中的药物残留是一种潜在的限制,可能对消费者造成危害。迄今为止,已对32种植物和40种植物化合物的抗球虫活性进行了科学评价[
26 ,
27 ].由于中药和化学合成药物来源不同,在鸡球虫病防治过程中,中药和化学合成药物的作用、作用机理和治疗理论存在较大差异;此外,中医对疾病具有多靶点、多途径、协同作用的特点。根据循证医学理论,鸡球虫病的附属证候由外感向湿热发展,湿热在大肠内积聚后,脾立即出现功能障碍。因此,鸡球虫病的治疗原则应以祛热湿为主,以凉血止泻。
黄常山 是一个着名的草药,用作中药中的抗疟疾,祛痰和抗真用药,并通过Jang等人研究了其抗疟药性的药理学活动。1948年[
28 ].此外,单用或复配为主药对球虫病鸡也有抗球虫作用。前人的研究结果表明
黄常山 和
β 在其中发现的二聚体氨酸可以促进脾脏T淋巴细胞和B淋巴细胞的增殖,并具有更好的小鼠巨噬细胞的免疫增强活性[
9 ].此外,Wang et al.(2018)的毒理学试验结果表明,超声提取的黄芩提取物
黄常山 根具有较低的毒性,在长时间给药后,高剂量对肝、肾、脾和肺的毒性表现出剂量依赖性[
29 ].因此,本研究的目的是研究由超声波提取液制备的口服液的抗球虫活性
黄常山 (uerd)在鸡中确定uerd口服溶液是否可在常规剂量条件下用作有效和安全的中药,也可以确定是否适合于对椰子症的长期临床用途。
考虑到家禽与反刍动物相比具有不同的胃肠道结构,鸡是不可能完全消化并吸收原油提取物
黄常山 .此外,它容易导致胃肠功能障碍,这又大大降低了其抗癌效果,导致原始药物的大量浪费。因此,开发口腔悬浮液的超声提取物
黄常山 可以确保使用最高药物含量并满足口服给药的流动性要求。其次,口服溶液制备具有稳定的质量,快速吸收,良好的疗效以及安全和卫生临床应用,这方便吸收和利用鸡,因此可以更好地施加抗突动力。
大肠tenella 是最致病的鸡孢子和主要寄生在剖宫产中,其中有源感染的特征在于腹泻和大规模的尾病毒出血。感染
大肠tenella 通常导致粘颈壁肿胀和损伤,这改变了鸡肉肠的正常功能[
30. ].在本研究中,感染对照组的血性腹泻延长且严重,特别是在感染后(PI)第4、5、6和7天(表)
1 ),这是生命周期中最重要的日子
大肠tenella 当时有3只鸡死于球虫病。通过饮水补充UERD口服液和妥曲祖利缓解了感染症状。与感染对照组相比,UERD口服液和妥曲祖利治疗组盲肠病变的严重程度明显改善,且药物治疗组的卵囊值和OPG均降低(5.00% UERD口服液治疗组除外)。本研究结果表明,肉鸡口服UERD口服液0.50、1.50和2.50%的剂量可显著提高菌孢子攻毒后的rBWG
大肠tenella .此外,按上述推荐剂量给予UERD口服液后,鸡血粪量、OPG和卵囊评分均有改善。可以证实超声波提取的是单一的草药
黄常山 根提取物对
大肠tenella 肉鸡感染。0.25%和5.00% UERD口服液组鸡的rBWG较其他药物组低,而与感染对照组的rBWG相似;rBWG的减少可以推断为UERD口服液的低剂量造成的影响,其中含有的有效成分(如
β -dichroine)。然而,对于较高剂量的UERD口服液,过量活性成分的毒性反应可能会阻碍鸡的生长,造成较高的OPG值(上文提到)。
损伤评分、OPG和ACI值是评价动物药物抗球虫疗效的常用参数。本研究中,感染对照组的病变评分最高,ACI值最低,其次为0.25%、3.50%、5.00% UERD口服溶液治疗组,病变评分较低,ACI值较高。另外,3个UERD口服液治疗组(0.50、1.50、2.50%)和0.10%妥曲祖利治疗组(0.10%妥曲祖利治疗组)的病变评分和卵囊值相似,但ACI值较高,其中0.10%妥曲祖利治疗组OPG和ACI值较低。以上结果表明,UERD口服液和妥曲祖利对肠道黏膜具有较好的保护作用,且UERD口服液浓度在0.50% ~ 2.50%范围内的抗球虫效果优于本研究中0.10%妥曲祖利。另外,两种最高的UERD口服液治疗(3.50%和5.00%)的抗球虫作用均优于两种治疗方法
大肠tenella - 在感染对照组,高剂量饮用UERD口服液可能产生药物毒性,对门诊鸡有害。在本研究中,所有药物治疗组的ACI值均小于160,这可能与毒力有关
大肠tenella 试验中选择的菌株(广东菌株)。磁场隔离
大肠tenella (广东株)从动物病原生物学国家重点实验室获得,长期被Li等用于鸡球虫病的研究。[
31 ].该菌株毒力较强,接种7 × 10种鸡后,死亡率在10% ~ 20%之间4 卵囊的形成孢子
大肠tenella 在一个月内。通常,在感染对照组中的5%至10%的死亡率在抗癌药物的实验设计中被认为是最佳的。但是,在这项研究中,挑战7×10后4 卵囊的形成孢子
大肠tenella (广东株),感染对照组的死亡率达到30%,由此可以推断,8个药物处理组的鸡都倾向于接种较高剂量的孢子化剂
大肠tenella 卵囊。虽然本研究中妥曲祖利和6种UERD口服液治疗的ACI值较低,但仍可从结果中得出药物剂量与抗球虫作用之间的关系;即UERD口服液按推荐剂量0.50% (ACI = 143.7)、1.50% (ACI = 151.0)、2.50% (ACI = 144.3)饮水给药,其抗球虫效果优于0.10%妥曲珠利(ACI = 127.0)。考虑到临床用药成本和肉鸡生长性能,1.50% UERD口服液应作为肉鸡临床推荐剂量。