基于网络的多组分药物的协同作用：复合柳埠配方对非小细胞肺癌的研究

抽象的

肺癌是最常见的癌症死亡原因，发病率和死亡率都很高，其中非小细胞肺癌(non-small-cell Lung cancer, NSCLC)占多数。中医在治疗复杂疾病方面是有效的，尤其是癌症。然而，中医仍处于概念阶段。由于其多组分、多目标的特点，不同组分之间的相互作用尚不清楚。本研究以复方六菊方为例，通过系统药理学策略分离出具有协同生物活性的化合物。通过药代动力学评价，筛选出37个潜在活性化合物。同时，结合目标预测模型得到化合物的116个靶标。通过网络分析，我们发现多组分药物可以通过调节炎症信号通路、侵袭通路、增殖通路和凋亡通路而表现出协同效应。最后，证实复方六菊方生物活性化合物不仅对NSCLC肿瘤细胞具有杀伤作用，而且对TNF-等相关炎症介质的分泌具有协同抑制作用α和IL-1β．在该研究中应用了系统药理学方法，提供了分析中医机制的新方向。

1.介绍

随着发病率和死亡率的不断上升，癌症已成为人类死亡的主要原因，并在世界范围内造成了严重的公共卫生问题。其中，肺癌是最常见的癌症类型[1，2］．非小细胞肺癌(NSCLC)占所有肺癌的80-85% [3.］．目前，降低非小细胞肺癌死亡率的主要有效方法包括化疗、放疗、靶向治疗和手术[4］．尽管如此，NSCLC的总体5年生存率仍然低，只有18％[5，而耐药性和副作用正变得越来越严重[2］．因此，迫切需要进行有效和安全的NSCLC的新方法。

近年来，中医（TCM）广泛应用于世界各地。由于多组分，多级和多级特征，TCM已经有效地缓解了超过4000年的复杂疾病[6］．例如，复方六菊方在中国被广泛用于治疗肺部疾病。临床复方六菊片、复方六菊颗粒等含含含苦六叶(柳树matsudanaKoidz。，SMK), Yejuhua (野菊花L.， CIL)和百花社草(hedyotis diffusa.中文字典中使用了SMK[7]是一种传统的抗炎镇痛药[7，8)药。研究表明，CIL已被用于治疗炎症相关疾病和恶性肿瘤[9，10］．据报道，Eehdw通过抑制细胞增殖和还原细胞活性对人肺癌细胞具有有效的抑制活性[11]中药具有副作用少、有效性广、疗效好的特点，能有效改善非小细胞肺癌患者的生活质量。然而，我们面对一个庞大复杂的中药配方体系，很难解释协同成分之间的相互作用。

随着生物网络等分析工具的发展[12、网络药理学[13]，以及系统生物学[14]，复杂而全面的中医辨证机制有望迅速而有效地厘清。在以往的研究中，我们已经成功构建了一种新的系统药理学方法来探索中药的潜在机制。该方法结合药代动力学(药物的吸收、分布、代谢、排泄和毒性(ADME/T)特征)、分子评价、靶点预测和途径分析等方法来探讨药物的作用[15，16，为识别药物的多种作用机制提供了一个平台。这个平台已经成功开发了包括川楝在内的四种草药Astragali Mongolici.，基数Puerariae Lobatae，基数ophiopogonis japonici.和板蓝根Salviae miltiorrhiza［17]，适用于心血管疾病的综合治疗。系统药理学已成为一种广泛使用的新工具，以揭示药物作用和药物开发的机制。

在我们目前的工作中，系统药理学方法用于研究从NSCLC的化合物柳氏配方处理中分离的协同生物活性化合物。通过通过ADME筛选由构造的化合物柳氏配方的生物活性成分，通过计算药代动力学性能并评估口服生物利用度（OB）和药物肖像（DL）。然后，使用组合生物模型和数学模型的综合目标预测方法来预测所选生物活性成分的同源靶。接下来，通过功能性富集分析和靶疾病相互作用分析验证所得靶标。最后，系统揭示了通过系统药理学理论和NSCLC相关信号通路评估的生物活性成分，活性靶标和途径之间的潜在协作相互作用。和，在体外进行实验以进一步验证潜在生物活性成分对肿​​瘤细胞的抑制作用。这些结果不仅提供了非小细胞肺癌新疗法也是促进中医药的分子机制的阐明和发展。

2.材料和方法

2.1。分子数据库的构建和Adme筛查

从我们以前建立的数据库获得了名为中医系统药理学数据库（TCMSP，）的所有化合物（TCMSP），获得所有SMK，CIL和HDW。http://lsp.nwu.edu.cn/) [18]人为地检测到。因为糖基分子通常水解成游离糖苷体内，易被肠粘膜吸收，我们将无糖基粘胶的分子写成_qt [19］．为了获得具有生物活性的分子，我们采用预测OB(口服生物利用度)和DL(药物相似度)的综合模型来评价药物的药动学和药物性质。

2.1.1。口服生物利用度

口服生物利用度（OB）是指速度和药物的吸收程度进入人体循环，这反映了药物在人体循环的比重，发挥在药物筛选的重要作用。在这项工作中，OB值由一个内部模型计算OBioavail1.1 [18］．通过以下条件确定OB值的阈值为25%:首先，从化合物最少的药材中获取尽可能多的信息。其次，获得的模型被报道的药理学数据正确解释[20］．在这项工作中，为了进一步分析，我们将OB阈值限制为25％。

2.1.2。药物相似

药物相似性（DL）是指化合物与已知药物之间的相似性，这是决定药物最终临床试验成功与否的一个重要因素。在这项工作中，我们使用了先前开发的内部模型（Tanimoto系数）[20来预测预期分子的类药物性质。DL评价公式如下:

他们之中，一个表示草药化合物的分子描述符，以及B表示数据库中所有化合物的平均分子性质(http://www.drugbank.ca/) [21］．为进一步研究，我们将DL≥0.18(药物库平均值)作为筛选候选化合物的标准。

为了获得潜在的生物活性成分，筛选标准被定义为OB ≥ 25%，DL ≥ 0.18.

２.２.药物的靶向

为了构建潜在的生物活性成分和目标之间的直接联系，我们利用自主开发的系统靶向给药工具（SysDT）22[加权集成相似性（WES）[23]算法对化合物的目标进行预测，提高目标数据库的全面性和准确性。

首先，利用加权集成相似度(WES)和系统药物靶向工具(SysDT)探索活性化合物的靶标信息;而SysDT包含随机森林(Random Forest, RF)和支持向量机(Support Vector Machine, SVM)两种数学工具，可以更完整地确定复合目标之间的相互作用[22］．还有另一种计算模型WES，它结合CDK参数、Dragon参数和CDK-Dragon混合参数来预测实际生物活性成分的直接靶标[23］．其次，将收集到的蛋白靶标映射到UniProt数据库(http://www.uniprot.org.)标准化[24].最后，将标准化的复合靶点映射到治疗靶点数据库（TTD，http://database.idrb.cqu.edu.cn/TTD/) [25]，比较毒素组织数据库（CTD，http://ctdbase.org/) [26药物基因组学知识库(pharmacgkb，https://www.pharmgkb.org/) [27]和京都基因和基因组的百科全书（Keggg，http://www.kegg.jp/) [28]，得到其相应的疾病和筛选出目标和疾病网络之间的关系。

2.3。基因本体（GO）分析和途径富集

为了进一步分析我们获得的潜在靶点的具体生物学过程和方法，我们将靶点与KEGG连接进行了Gene Ontology (GO)富集分析。KEGG是一个用于系统分析基因功能、生物途径、疾病、药物和化学品的数据库集合[29］．最后，通过使用ForeScape进行途径和过程富集分析（ForeScape，http://metascape.org) [30，31)软件。

２.４.网络建设

为了可视化活性化合物治疗NSCLC的作用机制，进一步阐明活性靶点与化合物之间的关系，我们构建了两个关系网络:化合物-靶点网络(Compound-Target network, C-T network)和靶点-通路网络(Target-Pathway network, T-P network)。在这些网络中，化合物、靶标和通路用节点表示，它们之间的关系用线段表示。度表示与一个节点相关联的边数，这个数越大，表示的节点关系就越多。使用Cytoscape 3.6.0分析了这些网络的拓扑特性[32]，这是时尚的生物信息学软件。

2.5.通道建设

在通路方面，为了探索复方六菊方对非小细胞肺癌的整合作用机制，在现有非小细胞肺癌病理学知识的基础上，建立了一条与非小细胞肺癌相关的整合通路。首先，为了获得该通路的基本信息，我们将筛选出的人类靶蛋白定位到KEGG数据库e、 其次，通过注释、可视化和综合发现数据库中的Fisher精确检验，错误发现评级（FDR）小于0.05的目标的综合KEGG路径（DAVID，http://david.abcc.ncifcrf.gov)（根据Fisher精确试验进行评估，FDR < 0.05）进行检查[33］．最后，我们手动组装了相对完整的NSCLC相关途径，以进一步分析分子作用机制。

2.6。实验检测

2.6.1。样品处理

化学药品芹菜素(B20981, HPLC≥98%)、山奈酚(B21126, HPLC≥98%)、熊果酸(B21403, HPLC≥98%)购自上海源业生物技术有限公司(中国上海)，原二甲基亚砜(DMSO)(美国Sigma)溶液浓度为100 mmol/L。为了保证细胞的存活不受影响，DMSO的最终浓度不应超过0.1%。

2.6.2。细胞培养

鼠巨噬系RAW264.7细胞和人非小细胞肺癌细胞系H1975细胞从细胞资源中心，上海生命科学研究院，和CAS获得。RAW264.7和H1975细胞在DMEM和RPMI 1640分别（GIBCO，USA）中，进行培养。有10％热灭活的补充胎牛血清（FBS）和抗生素（100个单位/ mL青霉素和100 μg / mL链霉素)。细胞在5% CO的培养箱中存活₂在37°C时。培养培养基每隔一天改变。

2.6.3。炎症模型的建立

Raw264.7细胞用于构建炎症模型。首先，将细胞在150mM培养皿中培养24小时并用药物处理2小时。然后，0.1 μg/mL脂多糖(LPS)培养18小时。最后收集细胞，检测炎症介质的表达水平。

2.6.4。细胞细胞毒性分析

通过细胞计数试剂盒-8（CCK-8）测定（CCK-8）测定（最佳Bio，Shanghai，China）进行细胞细胞毒性的测定。简而言之，H1975细胞在96孔板中以1×10的密度培养⁵细胞/。24小时训练后，细胞暴露于不同浓度的芹菜素、山奈酚和熊果酸。治疗48 h后，10μ将L的CCK-8测定加入每个孔中，并将细胞在37℃和5％CO 2下阴影为1-4小时。使用微孔板读取器（USA）调查550nm处的吸光度值。将细胞活力计算为：治疗的OD /控制×100％。

2.6.5。TNF-的表达水平α和IL-1β

ELISA试剂盒(R&D Systems, USA)检测TNF-的表达α和IL-1β．按规范方案收集药物处理后的细胞上清，50μ用于检测样品中的L.样品浓度根据在该试剂盒中提供的标准来计算。

2.7。统计分析

变量采用学生问卷进行分析t-检验、单因素方差分析和事后方差分析(GraphPad Prism版本7)。结果以平均值S.E.报告 ； ，和 ．

结果

3．1.活性化合物筛选

为了筛选出SMK、CIL和HDW的潜在生物活性成分，我们对其中的OB和DL等成分的ADME特性进行了评价。如支持信息表所示1，the results showed that among 156 compounds, 37 compounds reached the standard of OB ≥ 25%, DL ≥ 0.18. It was worth noting that 6 shared compounds met the screening conditions of SMK, CIL, or HDW, such asβ-谷甾醇、芹菜素、木犀草素、山奈酚、熊果酸和谷葡糖苷-qt，提示这些活性化合物可能对非小细胞肺癌具有有效的药理作用。此外，为了验证虚拟筛选结果是否与NSCLC一致，我们对潜在成分进行了文献综述。37种活性成分中有许多已被报道具有显著的抗肿瘤和抗炎作用。例如,β-谷甾醇(MOL004, OB = 36.91%， DL = 0.75)诱导A549细胞G0/G1周期阻滞，抑制细胞增殖[34］．研究表明，熊胆酸（MOL074，OB = 37.73％，DL = O.75）通过激活卵巢癌细胞中的糖原合酶激酶3β的激活和磷酸化诱导细胞凋亡[35］．证实芹菜素(MOL009, OB = 45.09, DL = 0.21)通过抑制Snail/ slug介导的EMT，抑制具有不同EGFR状态的NSCLC细胞的迁移/侵袭[36］．这些潜在的化合物可以是治疗NSCLC的关键组分。

３．２．药物定位与分析

为了探讨NSCLC化合物的靶，我们富集了化合物的靶标。因此，我们通过WES和SYSDT算法确定了116个这些活性化合物的靶标（如表所示）1)结果表明，大多数化合物作用于多个靶点，并表现出生物活性分子的多种药理作用。例如，靶点过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARG）对应于23种化合物，占总活性化合物的62%。研究表明，激活PPARG，γ亚型可能引起肿瘤细胞的增殖抑制或分化[37］．此外，PTGS2和NOS2的升高（分别为总体化合物的51％和48％）蛋白质是癌症患者中存活不良的强预测因子[38］．因此，将进一步研究参与NSCLC生物过程的这些目标。

３．３．途径和过程富集分析

接下来，我们利用Metacape软件对靶向潜在生物活性成分的蛋白的基因本体(GO)进行丰富和分析，验证这些蛋白是否与NSCLC相关，并设定阈值值≤0.05。如图所示1，我们发现它们都参与了“细胞对有机环化合物的反应”、“炎症反应”、“对无机物的反应”和“细胞对氮化合物的反应”等生物过程。因此，我们从复方六聚方中筛选出的活性分子的靶点可以作为NSCLC的治疗靶点。

3．4．Compound-Target网络分析

在本节中，我们使用Cytoscape 3.6.0生成C-T关系网络图(图2）其中37分子和116个靶标的950个相互作用，以揭示靶和化合物之间的关系更直接。随后，C-T网络拓扑分析显示化合物的平均程度为31，平均目标度分别为8。这可能意味着每种活性化合物与多种靶标和疾病机制中的所有作用相关联。

尤其是芹菜素（MOL009，度 = 51）通过靶向CD26 Akt Snail/Slug信号通路有效抑制肺癌进展[36］．并且，研究表明，Kaempferol（Mol023，Degete = 48）通过抑制Akt / pi3k和Erk途径增加了肿瘤细胞杀伤效果[39］．熊果酸(MOL047, Degree = 14)是蓖麻提取物和HDW提取物中存在的作用成分之一。近年来，人们发现熊果酸具有抗癌、抗炎和调节免疫细胞的作用[40- - - - - -42］．因此，这三种成分在NSCLC治疗中发挥着至关重要的作用。值得注意的是，前列腺素内过氧化物合酶2 (PTGS2, Degree = 19)已被发现在许多癌症类型中高表达，并通过抑制凋亡、增加血管生成和侵袭性促进肿瘤发生[43］．这表明化合物可能通过抑制肿瘤细胞周期、抗炎和抑制肿瘤血管生成来治疗非小细胞肺癌。

3.5。目标路径网络分析

结果如表所示2；24种显著富集的途径(值≤0.05，多个目标≥8）可能是动作的主要途径，并在NSCLC病中发挥关键作用。如图所示3.在美国，T-P网络包括88个节点(64个靶点和24个通路)和232条边。同时，多种途径受到多种靶蛋白的调控，这可能是该中药复方抗NSCLC作用的主要因素。癌症的途径(价值= 7.7  10^（-12）， hsa05200, degree = 28)， PI3K-Akt信号通路(value = 1.0  10⁽⁻⁵⁾，hsa04151，学位= 18），癌症中的microRNA（value = 1.0  10⁽⁻³⁾， hsa05206, degree = 13)，蛋白多糖在癌症中的作用(值= 7.2  10⁽⁻⁴⁾， hsa05205，度= 11)，TNF信号通路(价值 = 1.7  10⁽⁻⁴⁾， hsa04668, degree = 9)可能是关键途径。例如，PI3K-AKT通路可能是调控NSCLC细胞增殖和凋亡的关键通路[44]同时，炎症信号激活TNF信号在肿瘤的发生发展中起着重要作用[45］．此外，在癌症途径中的蛋白多糖中，硫酸肝素蛋白多糖(HSPGs)是介导细胞增殖、侵袭和细胞信号转导的细胞外基质的关键成分[46，47］．因此，肿瘤侵袭是肿瘤生长和转移的重要过程。因此，我们推断该化合物激活多个信号通路以抑制炎症，增强免疫应答和延迟侵袭NSCLC。值得注意的是，这些途径的多元富集为治疗NSCLC提供了进一步的理论支持。

3.6。非小细胞肺癌的疾病途径分析

为了在通路水平上解释活性成分的治疗机制，基于KEGG数据库中获得的靶通路信息，将T-P网络分析获得的关键通路进行整合，构建一个完整的“NSCLC通路”。如图所示4，“NSCLC途径”包括三种信号通路HSA04151：PI3K-AKT信号通路，HSA05205​​：癌症中多糖，HSA04668：TNF信号通路。集成通路反映了多种模块，例如细胞增殖，细胞凋亡，血管生成和迁移。

3.6.1。细胞周期进程模块

PI3K-AKT通路和TNF信号通路参与调控细胞周期进程。正如我们在图中提到的4，芹菜素(MOL009)可影响细胞周期蛋白依赖性激酶2 (CDK2)。它在细胞周期进程中起着关键作用，可以加速从G1期向S期的过渡，CDK2的失调与许多癌症密切相关[48］．此外，预计叶黄素（MOL022）会影响热休克蛋白90（HSP90），其调节DNA甲基转移酶转录和沉默肿瘤抑制剂和DNA修复基因甲基化在肿瘤发育，生长和治疗反应中起重要作用[49］．上述结果表明该化合物可以有效地调节PI3K，CDK / Cyclin，GSK3和其他基因的表达，从而激活途径并调节细胞周期进展。

操作。炎症影响模块

炎症介质和炎症细胞是肿瘤微环境的重要组成部分，在肿瘤的发生、发展和转移中发挥着重要作用[50］．因此，抗炎是复合治疗的重要策略。作为炎症的重要指标，转录因子p65 (NF-κB)通过激活木犀草素(MOL022)降低下游蛋白前列腺素G/H合成酶2 (COX-2)和一氧化氮合成酶(iNOS)的表达[51］．研究表明，COX2可能受到全身炎症的影响，而COX2表达对预后的影响取决于肿瘤特征[52］．此外，iNOS是炎症的主要介质，iNOS可增强炎症，在细胞凋亡中发挥重要作用[53］．因此，分析表明，该化合物通过调节NF-κB、cox-2和iNOS的抗炎活性，缓解了NSCLC患者的炎症症状。

3.6.3。入侵模块

肿瘤细胞的侵袭和转移对肿瘤的发生发展至关重要，并加剧了肿瘤的进展。如图所示的“NSCLC通路”4，肿瘤通路中的多糖参与调控肿瘤的侵袭转移过程。研究表明，肿瘤细胞的迁移与αγβ3 (MOL022，木犀草素)整合素蛋白酶体降解[54，55］．同时，FGF2，也称为碱性成纤维细胞生长因子（BFGF）和FGF-β，是由FGF2基因编码的生长因子和信号蛋白。它涉及各种生物过程，包括细胞生长，组织修复，血管生成，肿瘤生长和侵袭[56，57］．此外，VEGFA由Apigenin（MOL009）和叶黄素（MOL022）调节。在文献中据报道，VEGFA具有许多功能，例如增加血管渗透性，诱导血管生成，血管生成和内皮细胞生长，促进细胞迁移和抑制细胞凋亡[58- - - - - -60.]因此，上述分析表明，该化合物可能通过调节血管生成、迁移和侵袭来治疗NSCLC。

3.7。在体外实验检测

3.7.1。细胞细胞毒性测定

在本节中，我们使用H1975细胞系来验证该化合物的功效。我们选择了上述三种植物共有的三种高活性多目标成分芹菜素（MOL009）、山奈酚（MOL023）和熊果酸（MOL047）进行进一步验证。我们使用不同浓度的药物浓度检测芹菜素、山奈酚和熊果酸对H1975和RAW264.7细胞的细胞毒性，并探讨其抑制率。细胞毒性试验的结果（图5(一个)和5 (b)）显示不同浓度的活性成分显着抑制H1975和Raw264.7细胞的生长。这些结果表明，Apigenin，Kaempferol和熊糖酸对癌细胞具有明显的增殖抑制活性。

3.7.2.TNF的表达水平-α和IL-1β

为了进一步证实芹菜素、山奈酚和熊果酸的抗炎活性，我们使用了经LPS处理或不加芹菜素、山奈酚和熊果酸的RAW264.7巨噬细胞。根据之前的毒性结果，我们选择了20毫克的剂量μm进一步测试。因此，我们检查了TNF-α和IL-1β结果表明，芹菜素、山奈酚和熊果酸可下调TNF-水平α．联合用药更有效，特别是在三个共同用药组(图)5 (c)和5 (d)）.值得注意的是IL-1的表达β没有TNF-α，芹菜素组与模型组无明显差异。但与模型组相比，联合组表达水平明显降低。综上所述，两组结果显示，联合用药组优于单药组，三药合用最为明显，差异有统计学意义。

4。讨论

随着发病率和死亡率，肺癌已经成为最常见的癌症和癌症死亡的首要原因[61.］．此外，肺癌的高转移率和不良预后导致抗肺癌药物的研究成为亟待解决的重要问题。

因此，在这项研究中，我们选择了化合物柳师配方，临床使用的中药化合物，作为解释中药治疗的组合效果的实例。为了进一步揭示中药体中活性化合物的潜在作用机制，我们提出了一种系统的药理学方法，以深入了解化合物柳氏配方的协同药理机制。首先，基于评价方法，获得37种活性成分，预测了116个潜在的疾病相关靶标。结果表明，化合物柳师配方具有多组分和多元协同治疗的特征。然后，活性化合物和C-T分析表明，化合物中的几种活性化合物是对NSCLC的治疗必不可少的，包括Apigenin，Kaempferol和熊酸。此外，一些靶标如CDK2，COX2，INOS和VEGF对NSCLC具有抗炎，抗抗扩义和抗溶解作用。此外，途径和过程富集分析的结果，T-P分析和综合的“NSCLC途径”表明，化合物柳州公式主要通过调节细胞过程，炎症反应，迁移和入侵来治疗NSCLC。最后，我们已经表明，Apigenin，Kaempferol，Ursolic酸对肺癌细胞具有明显的抗增殖作用在体外细胞毒性测试结果。此外，我们通过ELISA试剂盒确定了Apigenin，Kaempferolol和Ursolic acid具有显着的抗炎作用，特别是在组合治疗组中，证实了Apigenin，Kaempferol和熊糖酸之间的协同效应。该公式对肿瘤炎性微环境的调节具有促进作用，并且在NSCLC治疗中具有潜在的研究价值。

总之，系统药理学方法揭示了复合柳埠配方的特点，具有多组分中医治疗和多元有效治疗。而且，该策略为新药物的合理发现提供了潜在的方法。

但是，目前系统药理学的方法还处于发展的早期阶段，平台的内容还需要进一步丰富。一些模型，如ADME筛选，需要优化，一些数据库需要扩展和更新。此外，开发新的算法，添加更多类似药物的特性，以及提高筛选准确性，可能会丰富该平台的内容。此外，本研究还考察了复方六聚方对肺癌的抑制作用，进而可以对其他疾病和其他恶性肿瘤进行系统药理学预测，进行深入探索。复方六菊方的综合治疗作用将得到进一步开发，为肿瘤的治疗提供新的策略。

数据可用性

如活性成分ADME参数，疾病相关的目标，和疾病相关的途径来支持这一研究的结果的数据被包括在制品内。如化合物的结构，通路和过程富集分析中，化合物的目标网络，目标 - 通路网络，并用于支持本研究的结果综合NSCLC途径中的数据被包括在附加信息文件内。因为这个结果的数据的一部分包括在导师的基金项目用于支持该研究的结果在细胞水平上影响数据请直接从相应的作者，它暂时不适合披露。

利益冲突

作者声明他们没有利益冲突。

作者的贡献

Y. L.构思和设计了这项研究。X. S.，M.J.和X.T. C.进行了目标预测和分析。Y.P.L.和J.L.Z. Z.进行了网络建设和分析。X. S.和M. J.进行了实验和收购数据。X. S.，C.L.Z.和J.Z.分析和解释了数据。W. X.提供财政支持。Y. L.和Y. W. W.批准了稿件的最终版本。

致谢

国家自然科学基金资助项目(no . U1603285, no . 81803960)。

补充材料

补充图1：图形摘要。表1：有源成分及其相应的ADME参数。（补充材料）

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