银陈灵桂炙肝汤通过调节Nrf2/ARE信号通路改善大鼠非酒精性脂肪肝

摘要

银辰灵桂缀肝汤是由灵桂缀肝汤和银辰好汤两大著名中药方剂结合而成。在前期研究中，我们发现银陈灵桂诸肝汤(YCLGZGD)在非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)的病理过程中具有调节脂质代谢紊乱、减轻炎症反应的作用。然而，确切的潜在机制仍不清楚。本研究旨在探讨银陈灵桂炙肝汤对高脂饮食(HFD)建立大鼠实验性NAFLD的影响及其机制。每日给予YCLGZGD、LGZGD、YCHD，连续4周，处死大鼠。测定血脂、肝酶、H&E和Oil Red O染色评价NAFLD的严重程度。Western blotting和实时聚合酶链反应分别检测Keap1、Nrf2、NQO1、HO-1肝脏蛋白和基因表达。口服YCLGZGD可改善hfd诱导的NAFLD。YCLGZGD增加了Nrf2、NQO1和HO-1的蛋白和基因表达，而不改变Keap1。综上所述，YCLGZGD可通过上调Nrf2/ARE信号通路改善hfd诱导的大鼠NAFLD。

1.介绍

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是一种肝病，包括单纯性肝脂肪变性、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)和不可逆肝硬化[1］．NAFLD的患病率迅速增加，与此同时肥胖症、糖尿病发病率也急剧上升[2，3.)、高血压(4，5，血脂异常[6］．目前，NAFLD被认为是代谢综合征的肝脏表现。NAFLD的发病机制目前尚不完全清楚，报道的治疗试验仍在研究中[7，8］．一些研究人员同意NAFLD发病机制的“2-hit”假说。简单地说，“第一个打击”涉及肝甘油三酯积聚或脂肪变性。“二次打击”代表了炎症细胞因子和氧化应激之间的关系。Nrf2/抗氧化反应元件(ARE)信号通路在氧化应激中发挥重要作用，可诱导抗氧化基因的表达，保护肝细胞免于凋亡。

NAFLD管理策略通常包括生活方式的改变和药物干预[9- - - - - -12］．然而，长期生活方式改变的依从性较差，而且大多数药物都有副作用，限制了它们的使用[13］．因此，有必要开发副作用少、治疗效率高的新策略。

中草药(CHM)已经在中国和其他亚洲国家传统上使用了数千年，现在它的使用正在世界范围内传播。CHM的一个独特和基本特征是使用一个含有多种草药的配方(混合成鸡尾酒)来改善与某种疾病有关的各种异常。草药提取物含有多种天然化合物，可针对疾病的各种病理途径，通过一系列机制提供治疗效果。灵桂缀肝、银辰好汤是《伤寒论》中的两种著名中药，由茯苓汤组成(茯苓), Guizhi(桂枝), Baizhu(白术macrocephalaKoidz）, Gancao(甘草), Yinchen(茵陈scopariae), Zhizi(栀子花)、大黄(大黄)．它们被广泛用于治疗肥胖和糖尿病。在化学成分方面，前人通过HPLC指纹图谱对两方的部分有效成分进行了探讨。儿茶素、蒽醌类、环烯醚萜类、西红花素、绿原酸等主要对慢性心绞痛的疗效起作用[14]， LGZGD有治疗作用是因为其含有肉桂酸、甘草酸、脱氢tumulo酸等近20种化合物[15］．

由于两者的协同作用，也被用于临床治疗NASH。在前期研究中，我们发现银辰灵桂逐肝汤具有抗炎作用[16，17]，可调节NAFLD病理过程中的脂质代谢紊乱，减轻炎症反应。因此，有必要探讨复方与单用的疗效差异及其可能的作用机制。

2.材料和方法

2．1．LGZGD、YCHD、YCLGZGD和萝卜硫素(SFN)的制备

LGZGD、YCHD、YCLGZGD颗粒由北京中医药大学东方医院药剂科提供。所有颗粒均含有LGZGD汤剂(茯苓12g、桂枝9g、白竹6g、甘草6g)和YCHD汤剂(Yinchen 18g、枳子9g、大黄6g)等量的成分。银陈灵桂珠肝汤是由这两种汤所组成。SFN是从LKT实验室(St. Paul, Minnesota, USA)购买的。

2．2.动物和治疗

雄性SD大鼠(7周龄)由SPF生物技术有限公司(中国北京)提供。所有实验程序均经北京中医药大学动物伦理委员会批准(编号2015BZHYLL0201)，并遵守《实验动物管理规定》。SD大鼠维持12 h的光/暗周期 °C，可自由食用标准的鼠粮( )或高脂肪饮食(高脂肪饮食，34%脂肪，19%蛋白质，47%碳水化合物的能量组成)( ) 8周诱导NAFLD。将颗粒和SFN溶于100ml蒸馏水中，2-8℃保存至使用。大鼠分别给予LGZGD、YCHD、YCLGZGD (3.465 g/kg/day、3.465 g/kg/day、6.93 g/kg/day, p.o 和SFN (0.5 mg/kg/天，p.o )。对照组大鼠(喂食饲料; )注射生理盐水(10 mL/kg/d, p.o )．所有组均给予药物或生理盐水治疗4周。

2．3.大鼠代谢参数的测定:肝酶和血脂水平

治疗结束时，动物在禁食12小时后用4%水合氯醛麻醉，并从腹主动脉采集血样。采用酶联免疫吸附法(ELISA)分析空腹血清甘油三酯(TGs)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)和低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C) (Bio Sino，北京，中国)。如前所述，采用ELISA法测定空腹血清丙氨酸转氨酶(ALT)和天冬氨酸转氨酶(AST) [18］．

2．4．组织学分析

新鲜肝组织标本用10%甲醛溶液固定。石蜡包埋切片进行苏木精和伊红(H&E)染色(泽平，北京，中国)。冷冻切片用油红O (ORO;Sigma Aldrich, St. Louis, Missouri, USA)。两种染色方法都用于研究肝脏和肝脂滴的结构。H&E和oro染色玻片在显微镜下(BX40, Olympus，北京，中国)观察，用附带的数码相机使用NIS Element SF 4.00.06软件(北京，中国)拍摄图像。每组取3 ~ 5只大鼠肝脏标本进行染色。

2．5．西方墨点法

采用冰冻组织裂解缓冲液提取肝组织匀浆，检测Keap1、Nrf2、NADPH醌氧化还原酶-1 (NQO1)和血红素加氧酶(HO-1)蛋白。用BCA蛋白检测试剂盒测定蛋白浓度。样品用10% SDS-PAGE分离，转移到聚偏二氟乙烯膜上。用一抗对细胞膜进行免疫印迹Keap1(1: 1000), Nrf2(1: 1000), NQO1(1: 1000), HO-1(1: 1000) (Abcam，美国)和β肌动蛋白(ZSGB-BIO,北京)。过氧化物酶偶联二抗和ECL检测系统根据常规方法如前所述[19］．采用Gel-Pro 3.2软件分析蛋白谱带强度。β-Actin蛋白作为内对照，使蛋白负荷标准化。

2．6．Keap1, Nrf2, NQO1和HO-1 mRNA表达的实时聚合酶链反应

如前所述[20.]，用1μg总RNA / 12μl反应使用标准cDNA合成试剂盒(Takara，日本)。目的基因的real-time PCR引物序列为Keap1、正向5 ' - taaccggcttaactcggcag3 '和反向5 ' -GGAGGCTACGAAAGTCCAGG-3 ';Nrf2正向5 ' -AGCAGGCTGAGACTACCACT-3 '反向5 ' -TCCAGTGAGGGGATCGATGA-3 ';NQO1，正向5 ' -GATTGTATTGGCCCACGCAG-3 '和反向5 ' -GATTCGACCACCTCCCATCC-3 ';HO，正向5 ' -GGGTCCTCACACTCAGTTTC-3 '，反向5 ' -CCAGGCATCTCCTTCCATTC-3 ';β-actin，正向5 ' -CCCATCTATGAGGGTTACG-3 '，反向5 ' -TTTAATGTCACGCACGATTTC-3 ' (CW-bio，北京，中国)。PCR条件为:初始激活步骤为95℃5 min，扩增45个循环，最终熔化曲线(55-95℃)。为了比较，将cDNA浓度归一化为β肌动蛋白聚合酶链反应的产品。数据分析采用方法。

2.7。数据分析

除另有说明外，所有数据均以平均值±SD表示。使用SPSS v20.0 (IBM公司，Armonk, NY, USA)进行统计分析。数据采用单因素方差分析，其次是学生数据测试。差异被认为是有统计学意义的 ．

3.结果

3．1.LGZGD、YCHD和YCLGZGD对高脂喂养大鼠脂质代谢和肝酶的影响

所有动物对实验过程的耐受性都很好，在研究过程中没有死亡发生。血清ALT ( U/L)及AST ( 高脂喂养大鼠血清中谷丙转氨酶(ALT) (U/L)的含量显著高于周粮喂养大鼠[ U/L)及AST ( U / L); ］．LGZGD [ALT ( U / L)、AST ( n . (pl .) (n .) U / L)、AST ( [/ l] / / U / L)、AST ( [u / l] [/ l] U/L)和AST ( .36 U/L)]显著降低ALT和AST水平( ， ,图1)．

YCHD患者TG水平下降[ mmol/L]和YCLGZGD [ mmol/L]组与HFD模型组比较[ 更易与L, ］．LGZGD也降低了TG浓度，但差异无统计学意义( )．此外,LGZGD [ 更易与L], YCLGZGD [ mmol/L]和SFN [ 更易与L, ]较HFD模型组TC浓度降低[ 更易与L, ］．然而，YCHD并没有显著降低TC ( )．LGZGD [ 更易与L], YCHD [ 更易与L], YCLGZGD [ mmol/L]和SFN [ mmol/L处理显著降低LDL水平[ 在HFD更易/ L, ， ］．YCHD患者HDL-C水平升高[ 更易与L], YCLGZGD [ mmol/L]和SFN [ mmol/L]组与HFD模型组比较[ 更易与L, )(图2)．LGZGD与HFD组比较，差异无统计学意义( ,图2)．

３．２．LGZGD、YCHD和YCLGZGD治疗减轻肝脏形态学改变

h & e染色组织切片的显微照片显示，与对照组相比，高脂喂养大鼠的大多数肝细胞由于脂肪的存在而膨胀(图)3(一个)和3 (b))，提示高脂饮食增加肝脏脂肪沉积。h&e染色切片还显示脂肪变性、球囊变性和细胞间质中炎性细胞浸润，这可能导致细胞明显肿胀和细胞质空泡化(图)3 (b))．用LGZGD、YCHD、YCLGZGD和SFN治疗高脂喂养的大鼠，可以减少肝脏中的脂肪沉积(图)3 (c)，3 (d)，3 (e),3 (f))．LGZGD、YCHD和YCLGZGD组的脂肪沉积比HFD组低，如图所示3 (c)，3 (d),3 (e)．

在对照组经oro染色的冷冻肝脏切片中仅检测到少量脂滴(图)4(一))．与高脂喂养的模型大鼠相比(图4 (b))， LGZGD、YCHD、YCLGZGD和SFN治疗显著减少肝细胞内脂滴沉积(图)4 (c)，4 (d)，4 (e),4 (f))．

3．3．LGZGD、YCHD和YCLGZGD调节高脂喂养大鼠肝脏Keap1蛋白和Keap1 mRNA的表达

HFD组的Keap1表达低于对照组( )．同样，LGZGD、YCHD、YCLGZGD和SFN处理组的Keap1表达低于对照组( )．而Keap1在其他各组与HFD组之间表达差异无统计学意义( ,图5)．Keap1基因在6组间表达相似。

3．4．LGZGD、YCHD和YCLGZGD提高高脂喂养大鼠肝脏Nrf2蛋白和Nrf2 mRNA的表达

我们研究LGZGD、YCHD和YCLGZGD是否对肝脏Nrf2表达有调节作用。HFD组肝脏Nrf2水平显著升高( )与对照组相比。LGZGD、YCLGZGD和SFN处理后Nrf2表达显著增加( )，与高脂饮食组相比。

然后，检测Nrf2基因表达，验证YCLGZGD对肝脏的影响。如图所示6， HFD组肝脏Nrf2基因表达明显高于对照组( )．与HFD组相比，LGZGD、YCLGZGD和SFN组Nrf2基因表达增加( 和 ,图6)．

3．5.LGZGD、YCHD和YCLGZGD调节高脂喂养大鼠肝脏NQO1蛋白和NQO1 mRNA的表达

HFD组NQO1表达高于对照组( )．同样，LGZGD、YCLGZGD和SFN组的NQO1表达高于HFD组( ,图7)．NQO1基因在4个试验组中的表达趋势与蛋白表达趋势相似。

3.6。LGZGD、YCHD和YCLGZGD处理可增加高脂喂养大鼠肝脏HO-1蛋白和HO-1 mRNA的表达

我们研究了YCLGZGD是否对肝脏HO-1的表达有调节作用。HFD组肝脏HO-1水平显著升高( )与对照组相比。LGZGD、YCLGZGD和SFN处理导致HO-1表达急剧增加( 和 与HFD组相比)。

进一步检测HO-1基因表达，证实YCLGZGD对肝脏的影响。如图所示8， HFD组肝脏Nrf2基因表达明显高于对照组( )．LGZGD、YCLGZGD和SFN处理组与HFD组相比Nrf2基因表达增加( ,图8)．

4.讨论

NAFLD是一种由多种遗传和环境因素引起的多因素疾病，被认为与肝脏代谢紊乱密切相关，导致脂肪酸/TGs和胆固醇的过度积累。脂肪变性与慢性肝脏炎症密切相关[21，这主要是由于氧化应激和脂质过氧化(LPO)在第二次打击。游离脂肪酸氧化导致大量活性氧的产生，通过多种以线粒体为中心的途径促进氧化应激。Nrf2/ARE信号通路参与了这一过程。

Nrf2是一种对抗细胞氧化应激的关键转录因子。然而，Nrf2是否在肝脏脂肪毒性中发挥作用尚不明确。此外，调控nrf2介导的脂质积累的分子机制仍不清楚。nrf2缺失的小鼠在喂食HFD后表现出更高的脂质积聚、肝脏脂肪酸水平升高和氧化应激[22］．此外，喂食蛋氨酸和胆碱缺乏饲料的Nrf2敲除小鼠的肝脏表现出相对较高的氧化应激和炎症反应，表明Nrf2活性受损可能是NAFLD的一个危险因素[23- - - - - -25］．

ARE是存在于抗氧化应激基因5 ' -上游启动子区域的一个核苷酸基序序列。人们普遍认为Nrf2负责are依赖的基因激活，它可以上调II期解毒和抗氧化酶，如HO-1、NQO1和超氧化物歧化酶(SOD)。

Keap1已被证明与Nrf2的Neh2 (Nrf2- ech同源结构域2)退化结构域相互作用[26］．它是基于cullin-3- (CUL3-)的泛素E3连接酶的一个接合亚基[27］．在非胁迫条件下，Keap1与细胞质中的Nrf2结合，促进Nrf2的泛素化和蛋白酶体降解。当暴露于化学物质(通常是亲电试剂)或活性氧时，Keap1-CUL3复合物的泛素E3连接酶活性降低，Nrf2稳定。稳定的Nrf2在细胞核中积累并激活其靶基因。

hfd诱导的NAFLD动物模型已被广泛应用于确定发病机制和评估新的治疗方法[28，29］．本研究结果表明，高脂饲料喂养8周可诱发SD大鼠脂肪肝。大鼠表现出NAFLD的关键生化特征，包括肝酶水平升高，高脂血症伴肝脏TG积累增加，组织学改变，如脂肪变性、小叶和门脉炎症，肝细胞损伤，如球囊化;所有这些都是代谢综合征的特征[30.］．此外，在高脂喂养的大鼠的H&E和oro染色肝脏标本中观察到的组织学异常与之前的报道一致[31］．

萝卜硫素是一种异硫氰酸酯化合物，最常从十字花科蔬菜中获得[32］．它是植物对捕食的一种外生反应，通过从受损细胞中释放水解酶芥子苷酶的囊泡释放，将硫代葡萄糖苷转化为异硫氰酸酯[33］．在过去的20年里，SFN因其抗癌、抗氧化和抗菌特性而被广泛描述[34］．这些活性主要归因于SFN调节Keap1-Nrf2-ARE信号通路的能力。

在以前的研究中，一些研究表明，中草药中含有几种化学物质，如田七［35］, salviae miltiorrhizae［36，37]，当归wallichii［38),而连翘悬念［39，40并具有Nrf2激活活性。YCHD和LGZGD中很少有成分参与这一过程甘草［41］．然而，配方中某一种化合物的效果并不等于它本身。方剂在改善肝酶、血脂、患者症状等不同方面具有整体调节的优势[42］．

在本研究中，我们在NASH大鼠模型中评估了不同治疗方法的疗效。虽然三种中药治疗对高脂饮食大鼠NASH均有治疗作用，但与其他两组大鼠相比，中药组治疗效果更明显，尤其是TG和HDL水平，说明LGZGD联合中药组具有协同作用。我们还测量了参与Nrf2/ARE信号通路的蛋白和基因的表达。LGZGD和YCLGZGD处理组Nrf2、NQO1、HO-1蛋白及基因表达与SFN处理组相似，Keap1表达与HFD处理组相似。这说明LGZGD和YCLGZGD调控Nrf2/ARE信号通路而不降低Keap1的表达。然而，我们没有观察到YCHD对Nrf2/ARE信号通路的蛋白和基因的明显影响。YCHD可能利用其他机制治疗NASH，但仍需进一步探索。

综上所述，本研究结果表明，YCLGZGD通过减轻氧化应激和改善脂质调节来缓解NAFLD，为其临床应用提供了数据支持。因为YCLGZGD中的草药已经在中医中使用了数千年，所以YCLGZGD被认为是安全的和可耐受的。综上所述，YCLGZGD可通过Nrf2/ARE信号通路调节氧化应激、脂质代谢、炎症反应和组织学异常，是治疗NAFLD的最佳途径。

的利益冲突

作者声明本文的发表不存在利益冲突。

作者的贡献

郭毅、李俊祥对这项工作做出了同样的贡献。

致谢

本研究由国家自然科学基金项目(批准号:20071010901)资助。高等学校博士学科点专项科研基金资助项目(批准号:81503549);北京中医药大学自主选题(批准号:20130013110007);2015 - jyb地产- 110)。

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38. “川芎的主要挥发性成分z -川芎内酯经鼻前处理可通过Nrf2和HSP70信号通路预防脑缺血”，农业与食品化学杂志，第65卷，第5期8, pp. 1533-1542, 2017。视图:出版商的网站|谷歌学者
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40. Bao J.， R. DIng, L. Zou等，“连翘子抑制B16黑素瘤生长涉及MAPKs/Nrf2/HO-1介导的抗氧化和抗炎症”，美国中医杂志，第44卷，第5期。5, pp. 1043-1061, 2016。视图:出版商的网站|谷歌学者
41. 季胜，李志，宋伟等，“甘草的生物活性成分:一种传统中草药有效成分的发现”，天然产物杂志，第79卷，第5期。2, pp. 281-292, 2016。视图:出版商的网站|谷歌学者
42. 陈志军，马学军，“饮陈浩汤治疗胆汁淤积症的临床研究”，《中国临床医学杂志》，民族药物学杂志，第168卷，第208-216页，2015。视图:出版商的网站|谷歌学者

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