大黄泽泻汤通过调节肠道微生物介导的toll样受体4信号激活和肠道屏障的丧失来保护高脂饮食诱导的NAFLD

摘要

越来越多的证据表明，肠道生态失调、肠道屏障功能障碍和激活的toll样受体4 (TLR4)信号在NAFLD发病中起关键作用。大黄泽泻汤治疗NAFLD已被证实有效，但其作用机制尚不清楚。在本研究中，我们研究了DZD对NAFLD大鼠的影响，并确定这种影响是否与肠道菌群的改变、TLR4信号通路活性的下调以及肠道紧密连接(tight junction, TJ)蛋白表达的增加有关。雄性sd大鼠饲喂高脂饲料16周诱导NAFLD，然后给予DZD干预4周。我们发现，DZD降低了NAFLD大鼠的体、肝重量，改善了血脂水平和肝功能指标，缓解了NAFLD。我们进一步发现DZD改变了肠道细菌群落，抑制了肠道TLR4信号通路，恢复了肠道TJ蛋白的表达。同时鉴定了DZD的10个潜在组分。这些发现表明，DZD可能通过调节肠道微生物介导的TLR4信号激活和肠道屏障的丧失来预防NAFLD。但DZD治疗NAFLD的机制尚需进一步研究。

1.介绍

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)，作为代谢综合征的肝脏表现[1]，表现为肝脏脂肪堆积，没有大量饮酒[2]最近，NAFLD已成为全世界慢性肝病最常见的病因[3.- - - - - -5]．全球NAFLD患病率为25.24%，中东和南美洲最高，非洲最低。NAFLD与肥胖、2型糖尿病、高脂血症、高血压、纤维化和肝细胞癌相关[6]然而，NAFLD的发病机制尚未完全阐明。众所周知，肠道微生物群在NAFLD的发病机制中起着重要作用[7，8]．肠道是对外开放的，肠道菌群是寄生在肠道内的复杂微生物群落，包括100万亿个细菌，超过1000种。它含有数倍于人类基因组的遗传物质，并产生相当多的代谢物和多肽。越来越多的证据证明，NAFLD在肠道失调或细菌过度生长时增加能量收集[9，10]NAFLD患者类杆菌和瘤胃球菌科的百分比低于正常受试者[11，12]．此外，肠道屏障的破坏也显著促进了NAFLD的发生。肠黏膜机械屏障是肠屏障的第一道防线，由肠上皮细胞(intestinal epithelial cells, iec)、紧密连接(tight junction, TJ)和覆盖在iec表面的粘膜层组成。TJ在维持肠道屏障的完整性方面发挥着至关重要的作用，促进营养和水的运输，并保护肠道来源的病原体[13]．在NAFLD的情况下，肠道细菌过度生长产生肠源性病原体，如内毒素或脂多糖(LPS)，这是革兰氏阴性菌细胞壁的主要成分。同时可以激活toll样受体4 (TLR4)信号通路。在细胞膜上结合TLR4后，通过下调TJ蛋白增加肠道通透性。我们都知道，肝脏位于肠道附近，通过门静脉接受75%的血液供应。门静脉流动不仅携带营养物质，还转运微生物产物和细菌。由于肠道通透性(漏肠)增加，肠道源性病原体可穿透肠道屏障进入门静脉，诱导肝脏炎症和脂肪沉积，从而导致NAFLD。

在西方国家，迄今仍没有经证实的治疗NAFLD的药物。中药对NAFLD的治疗效果显著。大黄泽泻汤(DZD)是一种中药配方，由泽泻三味药组成(东方泽泻)，白竹(白术macrocephala)和大黄（大黄）．它是在中国汉代(公元前206年-公元220年)《金匮略》中记载的经典方剂泽泻汤的基础上发展而来的。泽泻汤中只有两种中药，泽泻(东方)和Baizhu(答:macrocephala)．能明显减轻NAFLD，降低血脂水平[14]．基于此，我们建立了高脂饮食- (HFD-)诱导的NAFLD大鼠模型，评估了DZD对大鼠肝功能、肠道菌群、肠道TJ蛋白及TL4信号通路成员表达的影响。

2.材料和方法

2．1.制备DZD

我们用以下三种干药草的混合物配制DZD:泽泻胶， 30克)，白竹(白术macrocephala， 12 g)、大黄(掌叶大黄15克)。药草用水提取，浓缩至1 g粗药草/ml，置于−20℃保存，待进一步使用。中药成分均购自南京中医药大学百草堂门诊。药材按照《中国药典》(2010年版)规定的标准从合格供应商处获得。

２.２.动物

动物研究方案由南京中医药大学动物研究伦理委员会审核批准。八周龄雄性SD大鼠( )被安置在受控环境中（12 h–12 在南京中医药大学动物中心，在正常饮食后一周，将大鼠随机分为三组，分别饲喂正常饮食或HFD，正常饮食（脂肪贡献10%卡路里）和HFD（脂肪贡献45%卡路里）。从江苏医药生物制药有限公司（中国扬州）购买。对照组以正常饮食喂养16周( )，其余16只大鼠连续喂食HFD 16周。16周高脂饲料喂养后，将16只大鼠分为NAFLD组和DZD组( ）.The DZD group received daily gavage of 5.13 g/kg DZD (density: 1 g crude herb/ml) in addition to HFD for four weeks, while the NAFLD group was gavaged with the same volume of saline for four weeks. The control group was fed normal diet and saline for four weeks. Body weight gain was assessed once a week. After 4 weeks of gavage, the animals were anesthetized with 4% chloral hydrate and then sacrificed. Blood was drawn and collected into tubes. Liver tissue was weighed and collected. Intestine and feces samples were also collected.

2.3。试剂

TLR4抗体购自Abnova (TW, China)。抗髓样分化因子88 (MyD88)抗体，p物、物p-ERK, ERK购自Cell Signaling Technology (MA, USA)。抗occludin抗体和山羊抗小鼠二抗购自Abcam (MA, USA)。抗封闭带-1抗体(ZO-1)购自美国赛默飞世尔公司。抗体β-肌动蛋白和山羊抗兔二级抗体购自美国加州圣克鲁斯生物技术公司。

２.４.生化检测

在血清甘油三酯（TG），总胆固醇（TC），低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C），高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C），谷丙转氨酶（ALT）和天冬氨酸转氨酶（AST），通过测量commercial kits (Nanjing Jiancheng Institute of Biotechnology, Nanjing, China) according to the manufacturer’s instructions.

2．5．组织病理学检查

取大鼠肝脏各尺寸约5mm, 4%甲醛固定15分钟。随后，标本依次在30%蔗糖、15%蔗糖/50%最佳切割温度培养基(OCT, Sakura Finetek, Torrance, CA, USA)中平衡，100% OCT中冷冻m厚切片用低温恒温器切开。切片用苏木精/伊红(HE)染色，光镜观察。

2.6.免疫组化分析

取回肠和结肠组织检测ZO-1和闭塞素。上述切片用于免疫组织化学，并在免疫染色前复水。阻断后，切片与兔抗鼠ZO-1和闭塞素抗体（美国Invitrogen）孵育.免疫染色结果由两位病理学家独立审查和评分。

2.7。西方墨点法

ZO-1、闭塞素、TLR4、MyD88、，p物、物p-ERK和肠ERK的检测采用Western blotting。简而言之，从回肠远端和结肠组织中提取总蛋白，并使用BCA蛋白测定法(Thermo Fisher)测定上清液浓度。上清液等量含30μG蛋白在10% (w/v)十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶上电泳，并转移到聚偏二氟乙烯膜上。用5% (w/v)脱脂牛奶封闭1小时后，用一抗在4°C孵育过夜，然后用三缓冲盐水洗涤，再用二抗孵育1小时。用图像分析软件Quantity one分析蛋白条带。结果用相对于的比率表示β-作为内部控制。

2.8。粪便样本DNA提取、16S核糖体RNA (rRNA)基因测序及微生物分析

收集粪便样本，并在室温下冷冻−温度在3摄氏度以内为80摄氏度 采样后h。使用QIAamp Fast DNA粪便迷你试剂盒（美国加利福尼亚州Qiagen）进行DNA提取。测定纯度并计算浓度。通过PCR扩增细菌16S rRNA基因的V3区域。使用正向引物通过PCR扩增细菌基因组DNA（5′-TCGTCGGCAGCGGTCAGAGTGTATAGAGAGAGACGCCCTACGGNGGCWGCAG）和V3高变区的反向引物（5′-GTCTCGTGGGCTCGGAGTATAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGCCCCTACGGGGNGGCWGCAG）。将纯化的扩增子汇集到等摩尔浓度，并使用Illumina MiSeq仪器（美国加利福尼亚州圣地亚哥Illumina）进行配对末端测序.使用OTU的代表性序列进行分析α-多样性指数(Chao指数和Shannon多样性指数)，以相对丰度为基础。利用R软件根据otu的相对丰度生成热图(https://www.R-project.org）.系统发育β-多样性测量，如未加权UniFrac显著性检验、主坐标分析和非计量多维标度，由Mothur程序使用每个样本的OTU代表序列进行，以分析群落和系统发育。使用核糖体数据库项目分类器，具有60%的引导分数。

2.9。高效液相色谱法与质谱联用（HPLC-MS）

采用Accucore C色谱柱(182.1 mm × 150 mm, 0.26)，采用高效液相色谱-混合线性离子阱Orbitrap质谱(HPLC-LTQ/Orbitrap) (Thermo Fisher Scientific, USA)对DZD水提取物进行分析μm，赛默飞世尔科学公司，美国)和一个5厘米的Lot 13375防护柱(赛默飞世尔科学公司，美国)。流动相为(A) 100%乙腈和(B) 100%水和0.1%甲酸。梯度洗脱分别为5%-12% (0-30 min)、40% (35 min)、40% (52 min)、70% (63 min)、85% (67 min)和85%乙腈(70 min)。流速为1 mL/min，检测范围为全波长。质谱(MS)方法由正离子和负离子检测模型组成。ESI源参数设置为离子喷雾电压2.4 kV，毛细管温度300℃，源加热器温度110℃，鞘气(N2) 40个任意单元，辅助气(N2) 10个任意单元，扫气(N2) 0个任意单元。轨道rap分析仪扫描质量的范围是 120 - 900。

2.10。统计分析

采用SPSS 18.0和GraphPad Prism 5进行统计分析。数据以均数±均数标准误差(SEM)表示。两组间差异采用单因素方差分析，并进行Tukey校正 被认为具有统计学意义。

3.结果

(1) DZD对hfd诱导的NAFLD大鼠模型的治疗作用．为了评价DZD对NAFLD在HFD喂养大鼠模型中的治疗效果，我们检测到的体重，肝重，血清脂质水平，肝功能参数，以及三组的病理变化。相比于对照组，HFD组有较高的体重，肝脏重量和血清ALT，AST，TG，TC，HDL-C和LDL-C水平（图1(一)- - - - - -1（h））.与HFD组相比，DZD治疗4周显著降低体、肝重量，恢复血脂水平和肝功能参数(图)1(一)- - - - - -1（h））.同时，DZD组体重、肝重、血脂、肝功能指标与对照组相似。三组的血糖水平也相似(图)1（i））.一致地，HFD组的肝脏切片显示广泛大泡并且在那些DZD处理的大鼠的减轻肝细胞气球（图1 (j)）.综上所述，DZD对NAFLD大鼠模型均有有益作用。

(2) DZD治疗对NAFLD大鼠肠道菌群组成的影响．NAFLD与肠道菌群失调有关，因此我们分析了HDF和DZD对肠道菌群组成的影响。治疗4周后，我们使用MiSeq技术进行细菌16S rRNA测序。测序的质量包括微生物的丰富度和生物多样性，满足后续分析的要求。与对照组相比，HFD和DZD均降低了Shannon指数(图)2(一个))，因此它们显著减少了肠道菌群的多样性。同时，Chao指数表明，3个组的丰富度相似(图2)2 (b)）.三个组的样本在排序图中形成了不同的簇，表明HFD和DZD引起了肠道菌群的主要变化(图)2（c））.HFD组的厚壁菌门相对丰度高于对照组，拟杆菌门相对丰度低于对照组，而DZD在门水平上降低了厚壁菌门的比例，提高了拟杆菌门的比例(图)2（d）和2（e）)此外，还进行了主成分分析（PCoA），以比较不同群体在OTU水平上的细菌群落差异（图2（f））.此外，关于家庭水平肠道菌群的变化表明，Ruminococcaceae显著降低，Desulfovibrionaceae相比对照组中（图中的HFD组显著增加3（a）和3（b））.相反，DZD管理恢复了这些比例(图)3（a）和3（b））.在属水平，相对丰度脱磷孤菌属和大肠杆菌、志贺氏杆菌NAFLD组显著升高，而DZD干预可逆转这一趋势(图3（c）和3 (d)）.同时，相对丰度拟杆菌，Oscillibacter， 和Butyricicoccus通过DZD干预恢复的NAFLD组患者的死亡率显著降低（图3 (e)- - - - - -3（g））.总之，DZD改变了NAFLD大鼠的肠道菌群组成。

（3） DZD干预激活回肠中的TLR4信号通路．肠道屏障的损伤可能会引起肠道内毒素血症和随后肝脏中TLR4的激活，这与NAFLD的发病机制有关[15，16]Kim等人报道HFD通过激活TLR4信号通路诱导肠道炎症反应[17]．为了进一步研究DZD是否通过该途径调控肠道炎症，我们通过Western blot检测回肠TLR4和丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)成员的表达。HFD组回肠中TLR4和MyD88蛋白表达水平上调(图)4(一)- - - - - -4 (c)）.DZD治疗后，该水平恢复正常(图)4(一)- - - - - -4 (c)）.HFD组ERK和JNK的磷酸化水平高于对照组(图)4（d），4（e）， 和4 (g)）.然而，三组的ERK和JNK水平相似(图)4（d），4 (f)， 和4 (h)）.类似地，DZD下调了这些蛋白的磷酸化水平(图)4（d），4（e）， 和4 (g))因此，HFD可增强回肠中TLR4信号通路的激活，而DZD可使该通路的活性降至正常水平。

(4) DZD干预激活结肠TLR4信号通路．我们还检测了不同组结肠中TLR4信号通路成员的蛋白表达水平。HFD上调结肠中TLR4和MyD88的表达水平(图)5（a）- - - - - -5 (c))与HFD组相比，DZD干预降低了它们的蛋白质表达（图5（a）- - - - - -5 (c)）.然而，有控制和DZD组间无显著差异。等同于回肠结果，ERK和JNK的HFD组中的磷酸化水平较对照组，这是由DZD下调在更高（图5 (d)，5 (e)， 和5 (g)）.同样，结肠中ERK和JNK的总蛋白表达水平在三组间无显著差异(图)5 (d)，5 (f)， 和5 (h)）.两者合计，HDF引起TLR4信号在结肠途径，其通过DZD减毒的活化。

（5） DZD干预减轻NAFLD模型肠屏障完整性的丧失．肠黏膜的TJ蛋白，如ZO-1和occludin，对维持肠屏障至关重要[18]ZO-1和occludin表达的降低可增加肠道通透性，在NAFLD的病理生理学中起重要作用[19]．为了评估HFD和DZD对肠道屏障功能的影响，我们采用免疫组化方法检测肠道中ZO-1和occludin的蛋白表达水平。根据既往研究，对照组回肠和结肠中ZO-1和occludin均高表达，经HFD干预后表达降低(图)6(一)- - - - - -6 (f))与HFD组相比，经DZD治疗后，肠道中ZO-1和闭塞素的蛋白表达恢复（图6(一)- - - - - -6 (f))因此，在NAFLD模型中，通过HDF降低的ZO-1和occludin在肠道中的表达通过DZD得以恢复，从而减轻了肠道屏障完整性的丧失。

(6) DZD成分鉴定．采用HPLC-MS对DZD水提物进行了成分鉴定。鉴定出10种可能的化合物，分别是没食子酸、大黄酚、大黄酸、大黄素、泽泻醇C单乙酸酯、泽泻醇B、苍术内酯I、苍术内酯II和苍术内酯III(图)7、表1）.这些化合物的特征和来源列于表中1．

4.讨论

NAFLD是代谢综合征的肝脏表现，在世界范围内发病率较高[20.，21]．目前NAFLD已成为美国肝细胞癌的主要病因[22，23]．西方国家对NAFLD患者仍没有有效的治疗方法[24]．而中药方剂对NAFLD的疗效则是有据可查的。我们的研究首次证实了DZD可缓解hfd诱导的NAFLD。高脂饲料喂养16周后，小鼠体重增加，肝功能参数和血脂水平也受到影响(图)1(一)- - - - - -1（h））.肝脏组织学检查显示广泛的大脂肪变性和肝细胞膨胀(图1 (j))，与之前的研究一致。我们还发现，DZD给药4周后，NAFLD大鼠体重和血脂水平降低，肝功能指标改善，肝脏病理改变减轻(图)1(一)- - - - - -1（h）和1 (j)）.因此，DZD确实缓解了hfd诱导的NAFLD。

在测序研究中，NAFLD患者在HFD喂养后肠道菌群组成明显改变，因此DZD可能通过改变口服给药后的肠道菌群来缓解NAFLD。首先，我们通过多因素分析评估了DZD对肠道菌群的影响。Shannon指数和Chao指数分别代表各样品肠道菌群的多样性和丰富度。与对照组相比，HFD和DZD均显著降低了肠道菌群多样性(图2)2(一个)）.然而，三个组的丰富度相似(图2 (b)）.随后，我们在门水平上检测了不同组的肠道微生物群。NAFLD组拟杆菌门的百分比较低，而厚壁菌门的百分比较高(图)2（c）- - - - - -2（e）)，类似以往的研究[25- - - - - -27]．尽管如此，经DZD治疗后恢复了结果(图)2（c）- - - - - -2（e））.

NAFLD患者血清LPS（一种肠道细菌衍生产品）水平升高。LPS是革兰氏阴性菌外膜的重要组成部分，其中类杆菌是主要类型。在我们的研究中，NAFLD组的类杆菌减少，但肠道屏障的破坏和肠道通透性的增加导致更多的肠源性细菌LPS通过肝门系统进入血液[28]．肠道屏障的完整性与肠道细菌衍生产物密切相关，LPS可通过诱导肠道炎症反应增加肠道通透性。因此，我们进一步在科、属水平上检测革兰氏阴性菌的相对丰度。拟杆菌拟杆菌门(Bacteroidetes)属的变化趋势相同。有趣的是，NAFLD组的粪便微生物组增加了Desulfovibrionaceae，脱磷孤菌属属,大肠杆菌、志贺氏杆菌属（图）3（b）- - - - - -3 (d)).硫酸盐还原菌（SRB）家族脱硫弧菌科的相对丰度，以及脱磷孤菌属，SRB的一个属，在NAFLD组增加，DZD逆转了这一现象（图3（b）和3（c））.先前的一项研究表明，饮食增加了SRB体外［29]这些肠道细菌可以释放硫化氢，硫化氢是一种基因毒性气体，影响上皮肠细胞的完整性并导致屏障功能障碍[30.]．同时，Lodowska等人验证了LPS的高生物活性脱磷孤菌属［31]．虽然这些细菌含量较低，但其中的LPS可明显诱发炎症。在此,大肠杆菌、志贺氏杆菌NAFLD组与对照组相比显著富集，而对照组在DZD处理后降至正常水平(图)3 (d)).增加大肠杆菌、志贺氏杆菌可诱发肠道炎症，引起肠道屏障功能障碍[32，33]．因此，即使是少量的革兰氏阴性菌也可以通过强烈的促炎作用破坏肠道屏障。

在我们的研究中，NAFLD组的粪便微生物群减少了瘤胃球菌科，Oscillibacter属,Butyricicoccus属（图）3（a），3（f）， 和3（g）)，经DZD治疗后恢复正常。Jiang等人证明了瘤胃球菌科和瘤胃球菌科Oscillibacter与NAFLD组相比，健康组的属显著增加[34].瘤胃球菌科，Oscillibacter， 和Butyricicoccus是产生短链脂肪酸(SCFA-)的细菌，通过加强肠道屏障防止代谢内毒素血症[35- - - - - -37]．短链脂肪酸可预防肠道炎症，降低肠道通透性[38，39]．这些肠道细菌的改变会导致SCFAs的减少，增加肠道的通透性。然而，我们在此证明了DZD的发明恢复了HFD引起的这些肠道细菌的变化。

在本研究中，我们关注肠道微生物介导的炎症激活对肠道屏障的影响，因此我们检测了肠道炎症信号通路的变化。LPS是一种特殊的病原体相关分子模式和微生物产物之一，能够通过结合TLR4激活炎症通路。因此，肠道炎症反应就会发生[40]．有研究表明，肠道TLR4介导的信号有效地推动NAFLD [进展41，42]作为LPS的受体，TLR4在肝细胞、内皮细胞、免疫细胞等细胞膜上表达。MyD88是除TLR3之外的所有TLR的下游衔接蛋白[43]．TLR4-MyD88-MAPKs信号级联对炎症反应和NAFLD进展至关重要。MAPK信号通路参与多种生理和病理过程，如细胞生长、炎症、凋亡和增殖[44- - - - - -46]．ERK MAPK和JNK MAPK是MAPK通路的两个主要组成部分。在肠道中激活TLR4通过介导ERK和JNK的磷酸化诱导肠黏膜炎症。为了进一步研究DZD是否通过TLR4信号通路调节肠道炎症，我们采用Western blotting检测回肠和结肠TLR4信号通路成员的表达情况。HFD组回肠中TLR4和MyD88蛋白表达水平上调(图)4(一)- - - - - -4 (c)）.DZD治疗后，该水平恢复正常(图)4(一)- - - - - -4 (c))三组之间ERK和JNK的总蛋白水平相似（图4（d），4 (f)， 和4 (h)）.然而，这两种蛋白质的HFD组中的磷酸化水平超过对照组的（图4（d），4（e）， 和4 (g)）.DZD下调NAFLD大鼠ERK和JNK的磷酸化水平(图)4（d），4（e）， 和4 (g)）.这些结果证实了HFD上调了回肠TLR4信号通路的激活。同时，DZD使TLR4信号通路活性恢复正常。在结肠中也观察到类似的结果(图)5（a）- - - - - -5 (h)）.总之，在回肠和结肠两者TLR4信号传导，这是诱导HDF，活化通过DZD下调。

微生物群主要通过肠道细菌与肠道屏障相互作用引发的炎症途径参与肝脏疾病。NAFLD患者肠道通透性的增加被认为与肠道菌群有关[47]．此外，肠道微生物群影响肠道屏障功能，而该屏障功能障碍与LPS在人和动物模型中密切相关[48，49]．此前有研究报道，LPS显著诱导Caco2单层中TJ蛋白的下调和再分配，并促进肠上皮通透性的增加[50]．肠道屏障的破坏可能导致肠道细菌易位，进而肠道源性病原体通过高通透性的肠道屏障进入门脉循环，最终引发NAFLD [51- - - - - -53]．TJ蛋白抑制旁渗透性和因此基本上有助于肠屏障，作为防御线，从而阻碍的肠病原体的入口进入肝脏。肠通透性由TJ蛋白，其中跨膜蛋白ZO-1和闭合蛋白已经引起了广泛关注调节。鉴于ZO-1和occludin的是要紧密连接的完整性具有重要意义，其下调是负责TJ结构的破坏，并在旁通透性的增加[54，55]．在本研究中，免疫组化显示HFD降低了回肠和结肠中ZO-1和occludin的表达(图)6(一)- - - - - -6 (f)）.因此，DZD上调了这些表达(图)6(一)- - - - - -6 (f))，进而增强肠屏障功能。

此外,我们分析的主要组件DZD用高性能液相色谱法结合质谱和成功地确定了十DZD潜在的组成部分,也就是说,没食子酸,chrysophanol,大黄酸,大黄素,physcion, alisol C一乙酸酯,alisol B, atractylenolide我atractylenolide二世,和苍术烯内酯III(图7、表1）.Huang等人证实没食子酸可以改善高脂饮食(HFD)引起的血脂异常和肝骨增生症[56]．孟等人报道，alisol B通过激活farnesoid X受体对小鼠非酒精性脂肪性肝炎具有保护作用[57]．大黄酸和大黄素也可改善HFD诱导的NAFLD [58，59]，而大黄素可通过抑制炎症反应，恢复肠道通透性[60]同时，以前的一项研究表明，泽泻醇C单醋酸盐和泽泻醇B可以抑制LPS诱导的炎症反应[61]．苍术内酯是否能改善NAFLD尚不清楚，但其具有一定的抗炎、抗凋亡作用[62，63]．由于中草药成分复杂，我们只鉴定出了十种主要成分。尚需进一步研究明确DZD的主要成分及其对NAFLD的治疗作用机制。

总之，肠道菌群失调、肠道TLR4信号通路激活和肠道屏障功能障碍在NAFLD中起着重要作用。此外，DZD改变了肠道细菌群落，抑制了肠道TLR4信号通路，恢复了肠道TJ蛋白的表达，最终缓解了HFD没食子酸、大黄酚、大黄酸、大黄素、大黄素、大黄素、大黄素、泽泻酮、泽泻醇C单醋酸盐、泽泻醇B、阿特拉辛内酯I、阿特拉辛内酯II和阿特拉辛内酯III是DZD的十种主要成分。然而，还需要进一步的研究来阐明DZD治疗NAFLD的机制。

的利益冲突

作者声明本文的发表不存在利益冲突。

致谢

(1)国家自然科学基金资助项目(no. 20141201);81403376)。(2)作者感谢尚文兵博士和他的实验室成员在准备这项研究方面的宝贵合作。

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