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研究文章|开放存取
巴尔巴拉·亨利克斯、奥利维亚·科里亚、伊莱恩·帕蒂西亚·阿泽维多、罗德里戈·帕杜阿、维维安·路易斯·德奥利维拉、蒂亚戈·亨利克·奥利维拉、黛安·博夫、安娜·卡罗莱纳·迪亚斯、丹妮尔·德苏扎、弗拉维奥·阿马拉、毛罗·M·泰泽拉、雷切尔·卡斯蒂略、费恩·布拉加， ＂体外肿瘤坏死因子-巴西植物的抑制活性及丹参的抗炎作用Stryphnodendron Adstringens在急性关节炎模型中",循证补充和替代医学， 卷。2016， 物品ID9872598， 15 页面， 2016． https://doi.org/10.1155/2016/9872598
体外肿瘤坏死因子-巴西植物的抑制活性及丹参的抗炎作用Stryphnodendron Adstringens在急性关节炎模型中
Bárbara O.Henriques，1 奥利维亚科雷亚，1 伊莱恩·帕特里西亚C.阿泽维多，1 罗德里戈·帕杜阿，1 维维安·路易斯·德奥利维拉，2 Thiago Henrique C. Oliveira，2 多斯桑托斯卖座的，2 Ana Carolina F. dia，3. 丹妮尔·g·德索萨
，3.
FlávioA. Anaral.，2
毛罗·m·特谢拉，2
瑞秋·O·卡斯蒂略1et al。
福尔纳·雅尔布拉加1
1巴西密苏里州贝洛奥里藏特大街潘普哈校区联邦米纳斯杰拉斯大学药学系药学科学系，邮编：6627，31.270-901
2生物化学与免疫学系，生物科学研究所，校园Pampulha，AvenidaAntônioCarlos6627，31.270-901 Belo Horizo nte，MG，巴西
3.生物科学研究所微生物学系，校园普莱纳州校园Pampulha，AvenidaAntônioCarlos6627,31270-901 Belo Horizorye，巴西，巴西
摘要
Stryphnodendron.在巴西，通常被称为“barbatimão”的物种传统上被用作抗炎剂。本研究旨在研究barbatimão和其他11种物种对肿瘤坏死因子α（TNF）产生的影响-α)脂多糖（LPS-）刺激THP-1细胞及其抗关节炎活性Stryphnodendron Adstringens，倒卵形石首鱼，Campomanesia Lineatifolia和终端菊属植物促进TNF的浓度依赖性抑制-α.对膝关节注射LPS的小鼠进行治疗每操作系统从所选提取物中提取组分。有机（SAO）组分和水（SAA）组分沙棘促进白细胞迁移和中性粒细胞积聚到关节内的剂量依赖性减少，但没有一种降低关节周围组织中CXCL1的浓度C. Lineatifolia.和光肩星天牛组分不能改善炎症参数。超高效液相色谱（UPLC）结合电喷雾电离质谱（ESI-MS）分析SAO我们的发现在一定程度上证实了没食子酸和11种前啡肽的传统用途，它们是B型单体和二聚体沙棘作为抗炎剂。这种活性可能与白细胞向炎症部位迁移的减少有关。多酚类物质如没食子酸和前飞虱素，在活性部分中被鉴定，可能有助于观察到的活性。
1.介绍
肿瘤坏死因子-α（TNF-α)是一种关键的促炎细胞因子，在炎症刺激后迅速释放。它会引发一些细胞内事件，导致转录核因子κB（NF-κB）的激活-κB)，导致其他促炎细胞因子、趋化因子和蛋白酶的产生[1，2]这种细胞因子的过度产生与不同的炎症性疾病有关，包括类风湿性关节炎[3.]．肿瘤坏死因子-α抑制剂在临床上用于治疗类风湿关节炎;然而，现有的抑制剂是昂贵的生物药物，需要静脉给药，并不是对所有患者都有效[4]．因此，TNF-α被认为是制定新药物以治疗慢性炎症疾病的有效目标，目前需要鉴定可能作为这种细胞因子的拮抗剂通过口服路线的鉴定。
不同化学类别的天然产物的抗炎特性已通过实验证明在体外和体内实验。据报道，类黄酮、萜类、生物碱、大麻素、人参皂苷和植物甾醇等植物成分可以抑制TNF-参与的上游信号分子α表达，如Verma等人所述[5]和伊克巴尔等人[6].此外，一些含有TNF的天然产物-α抑制性也表现出抗氧化应激活性[7]．
巴西植物区系是生物活性分子的巨大来源，我们最近报道了几种药用植物的筛选，以寻找新的TNF-α抑制剂[8，9]．进一步研究一些所选物种导致不同TNF的分离和/或表征α拮抗剂，包括来自多毛曼索亚［10]，以及从中提取的黄酮C-糖苷和乌头酸echinodorus grandiflorus［11]．我们正在寻找新的TNF-α抑制剂，在本研究中，我们报告了由13种巴西药用植物提取物诱导的脂多糖-（LPS-）刺激的THP-1单核细胞对细胞因子释放的抑制作用，以及Stryphnodendron Adstringens关于急性关节炎模型，以及其化学特征。
2.材料和方法
2.1。植物材料和提取物制备
根据其治疗炎症疾病的传统用途，选择了13种植物进行研究．在表中描述了集合和提取数据以及所选植物的民族医药使用的数据1．
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将植物材料在40℃下在通风烘箱中干燥并在刀机中粉末。在室温下在超声浴中用乙醇96°GL萃取粉末状植物材料的部分（5g），在超声浴中（350 毫升，20 在最高温度为50°C的旋转式蒸发器上，在减压下过滤提取物，并通过蒸发去除溶剂，得到表中所示的粗提取物2．
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tnf-的浓度α在对照组（0.1%DMSO）或LPS刺激的细胞中测量。 ND：未确定（细胞活力<90％）。 |
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采用类似的程序制备最具活性的植物(Campomanesia Lineatifolia，Stryphnodendron Adstringens，倒卵形石首鱼和终端菊属植物)相比之下，水提取物是通过输液（叶）或煎煮（树皮）制备的，采用5 将植物药的重量减至50克 mL蒸馏水。通过冷冻干燥过滤并干燥所得提取物。二氯甲烷、乙酸乙酯和水提取物的产率（重量/重量w/w）分别为7.70%、10.04%和25.40%C.线纹叶，分别为6.18%、8.58%和38.00%s . adstringens分别为6.67%、9.54%和35.80%S. Obovatum.分别为11.84%、13.17%和19.56%光肩星天牛。
2.2。肿瘤坏死因子-α抑制试验
抑制tnf-α由提取物引起的释放（表1）1）在LPS刺激的THP-1细胞（ATCC TIB-202）上测定，如前所述[27]．总之，单元格(1.0106细胞/mL）转移至96孔微孔板，密度为100000个细胞/孔，并培养18小时 h、 然后，用提取物和组分对它们进行预处理3小时 加入h和LPS（Sigma-Aldrich，美国）作为炎症刺激物（100 纳克/毫升，20 μl）。在37℃孵育过夜后，将板离心（1800 g、 五, 收集上清液，并检测TNF-α根据制造商的说明（TNF-alpha duo-set，DY210，R&D Systems，USA），通过细胞因子特异性夹心定量酶联免疫吸附试验（ELISA）进行定量。使用细胞颗粒通过3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-2,5-二苯基四唑（MTT）评估细胞活力方法：评估所有受试样品（提取物和组分）的细胞活力，并根据活细胞与总细胞的比率确定，使用未经处理的细胞作为活力参考。细胞活力高于90%的样品被认为对THP-1细胞系无毒。
抑制tnf-α通过TNF-的比值计算lps刺激THP-1细胞的释放量α经LPS刺激的未经处理的细胞所观察到的经处理细胞分泌的量（pg/mL）和该细胞因子的水平（pg/mL）-α抑制以百分比值报告[1−(处理细胞的细胞因子分泌/溶剂对照培养细胞的细胞因子分泌)采用GraphPad Prism软件5.0版（美国GraphPad软件公司）计算差异的统计显著性，使用单因素方差分析，然后进行纽曼-基尔斯后验进行多重比较。当．
在62.5,125和250的浓度下以三份测试样品 μ克/毫升C. Lineatifolia，S.Adstringens，S. Obovatum和光肩星天牛，用二氯甲烷，乙酸乙酯和水制备的提取物也在相同的浓度下进行测试。地塞米松（Sigma-Aldrich，0.1 μM)为阳性对照。
2.3.从粗提取物中制备有机和水性部分
乙醇提取物线纹叶C. lineatifolia和光肩星天牛通过在不混溶溶剂之间的分配进行分馏。每部分(3.0 g)的提取物悬浮在水中(54 mL)，用乙醇/的混合物分割-丙醇/-丁醇（42 : 12 : 6卷/卷/卷，v/v/v；180 mL），机械搅拌30分钟 min.在分离漏斗中分离相，收集水层并用有机混合物萃取两次。在最大温度为50°C的旋转蒸发器中，在减压下将有机相和水相浓缩成残渣，从而得到C. Lineatifolia.(分别为1.50克和1.19克)，沙棘(1.32 g和1.27 g、 以及光肩星天牛(分别为1.74克和0.96克)。
2.4.LPS诱导的急性炎症
2.4.1.动物和实验方案
水的有机和含水部分线纹叶C. lineatifolia和光肩星天牛如Cunha等人所述，它们的抗炎活动进行了测定。［28].雌性瑞士老鼠（6周大），体重在28到32之间 g、 从UFMG药学院动物收容室获得的药物用于实验。所有实验均获得UFMG伦理委员会（CETEA，证书编号83/2015）的事先批准。动物（每组6只）用组分（10、100和1000）治疗 毫克/千克，每操作系统)或阳性对照组（地塞米松，4 mg/kg，皮下）或载体（含0.5%重量/体积的水，w/v，羧甲基纤维素）。治疗90分钟后，通过腹腔注射磷酸盐缓冲盐水（PBS）（1）中氯胺酮和甲苯噻嗪的混合物对其进行麻醉 : 0.5 : 3. v/v/v）和10 μL LPS溶液（10 μg/mL生理盐水)注射至膝关节(100 ng/关节腔)。对照组动物注射10μ12点后的PBS的L h、 暴露关节腔，并用5 μ在PBS中加入3%的牛血清白蛋白(BSA)。关节灌洗液稀释至100μl使用3％BSA并用于总和差异细胞计数。
使用小份（10）进行总细胞计数 μL)用Turk溶液染色的关节灌洗液(10μ五十） ，然后在Neubauer室内计数。对于中性粒细胞计数，通过离心剩余的90个细胞制备载玻片 μ在450度时进行联合灌洗 G在细胞引入（Shandon Cytospin 3，Thermo Scientific，USA）中5分钟。用Panoptic染色染色气体干涂片。除去趋化子组织以测定趋化因子（C-X-C硅酸）配体1（CXCL1）和TNF-α水平，以及髓过氧化物酶（MPO）活性。
2.4.2.CXCL1和TNF的测定-α通过免疫分析和MPO活性测定
称重关节周围组织，并用细胞因子提取液（0.1）提取 甲基苯磺酰氟（PMSF），0.1 纳米氯化苯乙铵，10 mM-乙二胺四乙酸（EDTA），20 KI抑肽酶A和0.05%吐温20在PBS中的比例为1 100毫升溶液 mg组织。材料在10.000℃下均质并离心 g在4°C下放置10分钟。收集上清液和TNF-α根据制造商的说明（CXCL1 duo-set，DY453和TNF-alpha duo-set，DY410，美国研发系统公司），使用ELISA测量CXCL1水平。
如前所述，保留细胞颗粒用于测定髓过氧化物酶活性[29]．它悬浮在缓冲液2中（0.05米拿破仑4和0.5% w/vn- 己二甲基溴化铵，pH5.4）并均化30秒。将样品冷冻并在液氮中引入三次，以10,000离心 g代表15人 在4°C条件下，收集上清液以测定MPO活性 μ五十） 将在缓冲液2中稀释三次的所有样品加入96孔微孔板中。那么，25 μ加入1.6mm 3,3'，5,5'-四甲基苯胺（TMB）溶液，将板在37℃下孵育5分钟。之后，0.002％过氧化氢（100 μL）加入并将板在37℃下孵育另外5分钟。通过加入50次停止反应 μL/1.0 M硫酸溶液。通过测量450℃时的吸光度测定MPO活性 在微孔板读取器（Infinite 200 Pro，瑞士Tecan）中，通过比较样品的光密度（OD）与提交相同程序的小鼠肺中性粒细胞的OD计算MPO活性，结果以MPO相对单位表示/μG
2.4.3。确定TNF-α通过实时聚合酶链反应（RT-PCR）
肿瘤坏死因子的表达-α通过实时PCR确定膜组织中的转录物，如前所述[30]．按照制造商的说明，使用Trizol (Ambion, Life Technologies, USA)从滑膜组织中分离出总RNA。总RNA重悬于二乙基焦碳酸酯处理过的水中，并储存在−70°C。cDNA的制备采用1µg的RNA和SuperScript™III逆转录酶试剂盒(Invitrogen, Life Technologies, USA)，根据制造商的说明。使用Power SYBR Green PCR Master Mix 2x (Applied Biosystems, USA)在7500 Fast Real-time PCR System (Applied Biosystems, USA)上进行实时PCR。通过ΔΔCt方法确定分析基因的相对表达，每个样本的数据归一化为甘油醛3-磷酸脱氢酶(GAPDH)构成基因，并以与对照相比的倍数变化的形式表达[30]使用以下引物对：对于GAPDH，5′-ACG GCC GCA TCT TCT TGT GCA-3′（正向）和5′-CGG CCA AAT CCG TTC ACA CCG A-3′（反向）；对于mTNF-α，5′-ACG GCA TGG ATC TCA AAG AC-3′（正向）和5′-AGA标签CAA ATC GGC TGA CG-3′（反向）。
2.4.4.统计分析
结果以每组6只动物的平均值±SEM表示。使用GraphPad Prism软件5.0版（GraphPad software Inc.，USA）计算差异的统计显著性，使用单因素方差分析，然后进行Newman Keuls后测进行多重比较。当．
2．5．描述的沙棘超高效液相色谱-电喷雾质谱联用法测定化学成分
的有机部分沙棘采用UPLC-ESI-MS对茎皮（SAO）进行分析。该分析在ACQUITY超性能LC系统（美国沃特斯）上进行，该系统与PDA 2996光电二极管阵列检测器（美国沃特斯）和ACQUITY TQ检测器（英国沃特斯MS技术公司）相连，配备Z喷雾电喷雾电离（ESI）源在正负模式下运行。MassLynx软件（版本4.1，Waters，USA）用于控制仪器以及数据采集和处理。
分析在LiChrospher 100 RP-18柱（250 mm）上进行4. 身份证号码是5 μm;水)，以线性梯度洗脱的水(a)和乙腈(B)，均含0.1% v/v甲酸，流速为1 mL/min，如下:5%至40%的B在60分钟，然后5分钟的等温洗脱(40%的B);5分钟后回到初始状态[31]．在运行之间保持5分钟的重新稳定时间。将样品溶液（馏分5mg / ml和1.参考化合物的1mg / ml）溶解在甲醇/水（1：9V / v）中，过滤超过0.45 μM聚四氟乙烯（PTFE）膜，等分试样（8 µ五十） 自动注入系统。色谱图记录在λ210海里。
MS的工作参数如下：在质量范围内的扫描模式负和正m/z100–2000 Da，脱溶温度375℃，脱溶气体流量600 L/h，锥形气体流量为60 mL/min，源温度120℃，锥电压60 五、 毛细管电压为3000 雾化器气体为氮气。
采用BEH RP-18色谱柱(502.1 内径1.7毫米 μM水（A）和乙腈（B）的线性梯度，均含有0.1% 采用v/v甲酸，流速为0.3 mL/min，10%的硼含量为5-95% 最小，然后是1 等度洗脱的最小值，在2小时内返回初始条件 两次跑步之间保持两分钟的再平衡时间。以下MS/MS操作参数用于分析：质量范围内的扫描模式阴性和阳性m/z100–1500，脱溶温度为350℃，脱溶气体流量为550 L/h，锥形气体流量为50 mL/min，源温度120℃，锥电压60 五、 毛细管电压为3500 V.使用氮气和氩气作为雾化器气体。
3.结果和讨论
3.1。抑制TNF-α提取物诱导THP-1细胞释放
通过MTT法评估植物提取物对THP-1细胞的毒性，以确保其抗TNF活性-α活性不是由毒性作用引起的。所有提取物都被认为是非细胞毒性的，但mikania glomerata.（茎）和Cordia guazumaefolia(叶和茎)，在最高测试浓度(250μg/mL）。
非细胞毒性提取物对肿瘤坏死因子的影响-α在三种浓度下测定LPS刺激的THP-1细胞的释放，结果如表所示2．的提取毛毛Licania tomentosa, Paepalanthus bromelioides，黄荆，Bowdichia Vingilioides（叶和茎），以及Campomanesia Lineatifolia(茎)增强TNF-的产生α通过LPS刺激的细胞，表明存在促炎炎症成分。有趣的是，当在非刺激的THP-1细胞中测定时，没有提取物增加TNF-α生产（数据未显示）。这些植物提取物可能与LPS协同作用，增加炎症反应。
种子和吠声拟处女双歧杆菌传统上用于治疗不同的炎症[12]．虽然拟处女双歧杆菌提高四氢呋喃的产量-α在本文报道的筛选中，使用角叉菜胶和乙酸作为炎症刺激物，用该物种的茎皮和叶子制备的提取物的抗炎特性已在动物模型中得到证实[32，33].在同一个方向上，一种从毛白杨被证明具有抗伤害和抗炎特性[34]．
在所检测的19种提取物中C. Lineatifolia.（离开），终端菊属植物（离开），Stryphnodendron Adstringens(树皮),倒卵形石首鱼(树皮),Hymenaea stigonocarpa.和磷斑鸠菊抑制TNF的释放-α以浓度依赖的方式。提取物Hymenaea Courbaril.也能抑制细胞因子的释放，但这种反应不能被描述为浓度依赖，因为在低浓度和高浓度的检测中，其抑制作用没有区别。旨在进一步研究抗肿瘤坏死因子-α由于某些活性物质的影响，极性增加的提取物（二氯甲烷、乙酸乙酯和水）由以下物质制备：C. Lineatifolia.（离开），光肩星天牛（离开），沙棘(树皮)S. Obovatum.（树皮），并在LPS刺激的THP-1细胞上评估其对细胞因子抑制的影响（图1）。
（a）
（b）
（c）
（d）
乙醇和含水提取物沙棘，S. Obovatum.和光肩星天牛抑制肿瘤坏死因子-α在大多数测定浓度下，产量显著增加，而沙棘仅在250岁时活跃 µg/mL。相比之下S. Obovatum.用二氯甲烷和乙酸乙酯制备似乎具有促炎特性，因为TNF显著增加-α因此，只有这些物种的极性提取物对TNF有显著的抑制作用-α由受刺激的细胞产生。
与我们的结果类似，西岛[35]报告了显著的TNF-α大豆高极性提取物的抑制作用黑果鼠李茎皮对LPS刺激的小鼠巨噬细胞的影响。同样，TNF-α巴西植物乙醇提取物抑制活性的研究巴西石竹和Coccoloba cereifera是我们最近描述的[8].另一方面，其他作者报告TNF较高-α与甲醇提取物相比，如用不丹植物中的二氯甲烷和氯仿制备的提取物，对低极性提取物的抑制活性[36]．
这是关于抗肿瘤坏死因子的首次报道-α活动C. Lineatifolia.，虽然Campomanesia已被描述具有抗炎性质，如Campomanesia Velutina其叶乙醇提取物能减轻角叉菜胶引起的小鼠足肿胀[37]在以前的一篇文章中，我们描述了抗肿瘤坏死因子-α活动终端菊属植物在LPS刺激的THP-1细胞[8].此处报告的使用在不同地点收集的植物材料制备的提取物的抑制活性证实了我们之前的发现，并披露了光肩星天牛作为一种有前途的物种体内研究报告见第节3.2．
３.２．对脂多糖诱导的急性关节炎的评价
所公开的LPS刺激的THP-1细胞提取物的初始筛选沙棘，S. Obovatum.，C. Lineatifolia.和光肩星天牛具有显著的肿瘤坏死因子-α抑制活动。含水提取物沙棘和光肩星天牛引发更有效的抗TNF-α对THP-1细胞的作用强于乙醇提取物;但由于水提物具有较高的复杂性和化学表征的困难，未优先进行进一步研究。因此，上述种的乙醇提取物除S. Obovatum.在LPS诱导的急性关节炎模型中，以三种不同剂量（10、100和1000）对所得的有机和水性组分进行评估 mg/kg）。
有机和含水部分C. Lineatifolia.和光肩星天牛没有将细胞迁移降低到关节，以及在膜组织中的化学趋化子因子CxCl1或髓过氧化物酶（MPO）活性的释放，无测定剂量（未显示数据）。由于这些提取物显着抑制TNF-α释放在体外，假设缺少体内活性可能与生物活性化合物的低吸收或代谢相关有关。
有机（SaO）和水性（SAA）部分沙棘在所有测定剂量下，显著减少白细胞向关节的募集（图2（a）)这些组分还以剂量依赖性的方式减少中性粒细胞在关节腔内的积聚（图2（b）).关节周围组织中CXCL1浓度没有降低（图2（c）)，以及TNF-αSAO或SAA治疗后MPO的水平和活性(数据未显示)。
（a）
（b）
（c）
细胞对炎症的反应是由中性粒细胞启动的，中性粒细胞是急性炎症反应中招募的第一批效应细胞。单核细胞是在趋化因子的引导下，在分化为组织巨噬细胞后迁移到损伤部位的下一个细胞[38]因此，能够减少中性粒细胞迁移的化合物可能会减弱炎症过程，因此沙棘部分SAO和SAA是潜在抗炎化合物的来源。
红景天的抗炎活性沙棘先前已经调查过。茎树皮的丙酮馏分减少了在400和800mg / kg的口服给药的大鼠甲啡烷烷和葡聚糖诱导的爪子水肿。在800mg / kg的大鼠中给予大鼠的该级分，降低了通过角叉菜胶诱导的急性胸膜炎的渗出物体积和白细胞迁移，并通过在同一个剂量的情况下通过注射小鼠的腹膜腔内的乙酸而增强的血管渗透性。此外，该级分在大鼠抗原抗原诱导的关节炎中显着降低了爪子水肿，以800mg / kg施用[39]．我们在此报道抗炎作用沙棘在相当低的剂量下，也证明了由高极性成分构成的水性部分的活性。
值得注意的是，通过口服途径以100mg / kg的100mg / kg施用Sao和Saa分别将白细胞迁移减少33±11％和26±9％，如皮下给出的阳性对照塞米松观察到的类似反应（33±6％ 抑制）。这一发现突出了抗炎作用的相关性沙棘这里报道。据我们所知，之前没有关于沙棘脂多糖致小鼠膝关节急性关节炎模型的研究在体外关于TNF的抑制的数据α释放
SAO和SAA治疗可显著减少中性粒细胞向膝关节的迁移，但关节周围组织中CXCL1含量和MPO活性均未显著降低。因此，这些组分诱导的中性粒细胞募集减少可能不是CXCL1抑制的结果，可能是由其他机制引起的。CXC蛋白是CXCL1的一类，是参与炎症组织中性粒细胞募集的主要趋化因子[40]中性粒细胞的募集也受其他趋化因子的抑制或产生/释放以及干扰趋化因子受体和趋化因子与糖胺聚糖之间结合的化合物的影响，从而损害中性粒细胞的滚动。中性粒细胞和内皮细胞中粘附分子的表达减少或阻断s很可能会影响招聘[41- - - - - -44]．
髓过氧化物酶(MPO)是中性粒细胞产生的一种酶，在氧化物种的生成中起主要作用，参与宿主对微生物的保护[45]．尽管在使用SAO和SAA治疗的动物关节中，中性粒细胞计数显著下降，但我们无法检测到MPO活性显著下降(数据未显示)。
沙棘提取物还原TNF-α生产在体外假设这种细胞因子也可能参与SAO和SAA组分的抗炎作用是可行的。然而，TNF-α在使用该组分治疗的动物以及对照组的关节周围组织中，含量既无法量化也无法检测到，12 LPS给药后h。这个时间段是根据我们之前的结果设定的，结果显示白细胞迁移到发炎关节的峰值发生在12 注射LPS后h（未公布数据）。旨在测量肿瘤坏死因子-α生产体内在另一个实验中评估SAO和SAA，并在注射炎性刺激物6小时后收集关节周围组织。同样，在任何实验组中均未检测到细胞因子（数据未显示）。或者，我们尝试测量TNF-α在滑液中，据报道，在注射LPS两小时后，细胞因子在该培养基中达到最大浓度[46]因此，采用实时PCR方法，在注射LPS后1或3小时收集的冲洗滑液样本中测量细胞因子浓度。然而，两组之间没有显著差异（数据未显示）。
量化TNF并不是一项容易的任务-α在患有关节内注射LPS的动物挑战。nakayama等。［47)测量肿瘤坏死因子-αPCR检测滑膜中白细胞介素32α（IL-32）的含量α)关节内注射LPS两周后转基因小鼠。作者报告TNF含量较高-α在转基因小鼠和非转基因小鼠中进行比较TNF-的水平α在刺激后2小时和3小时，通过流式细胞术在关节内注射LPS的大鼠滑液和中性粒细胞中定量[48].滑液量和TNF-α大鼠的含量高于小鼠。这种差异可以解释检测TNF的困难-α在目前的工作中，尽管使用了不同的时隙和分析方法。
了解LPS信号转导对于开发新型抗炎药至关重要。LPS与toll样受体4（TLR4）结合后，形成由二聚TLR4和MD-2组成的受体复合物，并启动一系列细胞内事件，这取决于不同的适配器组。早期和晚期反应均导致核因子-κB（NF-κB）的激活-κB） 并导致细胞因子、趋化因子和其他转录因子的诱导[49]炎症细胞通过增加炎症细胞因子和白细胞募集相关的趋化因子的产生而作出反应。因此，能够抑制这些介质的产生和/或释放的化合物可能会减弱炎症过程，并且已经使用LPS作为炎症介质对几种植物物种进行了评估保守党刺激计划。
3.3。用超高效液相色谱（UPLC）耦合到电喷雾电离质谱（ESI-MS）的植物化学表征
化学成分沙棘通过UPLC-ESI-MS评估有机级分（SAO）。在已建立的条件下，基于其UV光谱数据和ESI-MS上的碎片模式来鉴定12种化合物，并通过与参考化合物进行比较，或者有可用的文献数据沙棘［50- - - - - -52]．物种的化学成分包含黄烷-3-醇低聚物，例如PRODELPINIDINS和PROROBINETINIDIN，以及衍生物。SAO的UPLC-ESI-MS色谱图中发现的主要峰的作用（图3.)如表所示3.．
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（a）
（b）
Gallic acid的存在[1，保留时间（Rt）=5.96 没食子酸(3.，Rt=9.98 表没食子儿茶素(6，rt = 14.88分钟），epigallocatechin 3-O没食子酸盐(10通过与真实样本获得的保留次数和UV光谱数据进行比较，推断出rt = 21.97分钟）推断出（数据未显示）。表中描述的其他化合物3.根据正离子和负离子分析模式获得的ESI碎裂模式进行归因。获得的数据与前啡肽的单体或二聚体相容，无论有无取代基（甲基或没食子酸单元）。
前啡肽是B型缩合单宁，由连续的黄烷-3-醇单元连接而成，通常在“上部”单元的C-4位置和“下部”或“起始”单元的C-6或C-8位置之间[53]．连锁的立体化学可能是α或β因此，原始不同的异构体，因此，仅基于MS数据的明确结构分配是不可行的。
在负离子分析模式（ESI）中-），ProDelphinidins的碎裂特征在于峰值m/z305，归因于没食子儿茶素或表没食子儿茶素单元丢失导致的碎片。类似地，在以下情况下出现峰值：m/z609表示由这些单元中的任何一个组成的二聚体。相比之下，一个片段m/z169表明从化合物中损失了洛洛羊座。在图中描绘了产生上述片段的碎片方案4化合物5和7．
（a）
（b）
前啡肽核的另一个特征碎片是由前啡肽核的逆向Diels-Alder（RDA）裂变演化而来的，C环断裂在m/z137，一种醌甲酰胺[54]（图5）。负父离子扫描m/z应用137，并允许确认其来自化合物的碎片4，7，8，9和10．
先前对丙酮/水（7）衍生的乙酸乙酯馏分的研究 : 3. v/v）提取物沙棘茎皮导致了不同前啡肽的分离[50]在本研究中，我们在SAO的UPLC-ESI-MS色谱图中检测到一些峰，对应于分子量与先前报道的前啡肽或其异构体相容的化合物，包括4′-O-甲基没食子酸(8），由两个单位（EPI）GallocateChin组成的二聚体（2两个二聚体由两个单元(epi)没食子儿茶素3-组成O没食子酸盐(4和9，mw 914g / mol），和由（epi）gallocatechin和（epi）gallocatechin 3-的二聚体组成O没食子酸盐(7，兆瓦762 g/mol）。
梅洛等人[50]描述了Epigallocatechin 3-的分离O-没食子酸-（4β→8） -表没食子儿茶素3-O-没食子酸盐，一种分子量为914的化合物 g/mol。UPLC-ESI-MS对SAO的分析显示，在色谱图中有两个保留时间不同的峰(4，rt = 12.17分钟，9， Rt = 20.57分钟)，但结果相同准-分子离子m/z913[M− H]−这一发现表明该物种中至少存在两种异构体。此外，ESI−-化合物的质谱分析5（RT 12.84） min）在m/z927[M− H]−，其归因于上述异构体之一的甲基化衍生物。建议甲基的位置是（EPI）GallocateChin单元的环B中。这个假设基于碎片模式5，在m/z319、归因于残留物O-甲基-(epi)没食子儿茶素−，以及在m/z169，归属于没食子酸部分[M− H]−.如果没食子酸部分带有甲基，则在m/z183。根据现有数据，提出结构是可行的5作为（epi）gallocatechin 3-的二聚体O没食子酸盐和O-甲基-（表）没食子酸3-O-没食子酸盐（图4（a））。
SAO的UPLC-ESI-MS光谱分析还发现了一种分子量为624的化合物 g/mol(11，Rt=23.25 min）的碎片化模式11，记录在负离子分析模式中，表明它由一个单位的（表）没食子酸组成(m/z305）和4′中的一个-O-甲基-（表）没食子酸(m/z319）。相反，化合物12给了这一点准-分子离子m/z471[M− H]−．该化合物可能是甲基化(epi)没食子儿茶素没食子酸酯，由在m/z169，对应于Galloyl组，以及m/z319，归因于甲基 - （EPI）GallocateChin的单位。
以丙酮/水(7:3 v/v)为溶剂，分离得到原robinetinididin沙棘茎皮[51]然而，在本研究中进行的SAO UPLC-ESI-MS分析中未发现此类多酚。这种缺失可能与制备粗提取物及其衍生部分SAO所采用的不同方法以及研究中使用的植物药物的差异有关。
一些前啡肽具有生物活性，一些前啡肽具有抗炎作用在体外和体内楷模。因此，Epigallocatechin 3-O-没食子酸盐被认为具有抗炎特性，可能影响不同慢性炎症疾病的发病机制。这种化合物是绿茶的主要成分，可能是研究最多的原花青素之一。抑制肿瘤坏死因子-α冈田酸（IC）刺激BALB/3T3细胞释放5026µM） 抑制TNF基因的表达-α［55]表没食子儿茶素3-O-没食子酸盐，在50℃下测定 µg/mL，抑制TNF的释放-α通过LPS刺激的THP-1细胞和抗β2 gpi /β2GPI复合体[56]表没食子儿茶素和表没食子儿茶素没食子酸酯降低白细胞介素1β（IL-1）的产生β）增强了IL-10的生产，但对IL-6或TNF的产生没有影响α，测试时在体外10点和20点 μLPS刺激的人白细胞中的M[57].膳食补充0.1%表没食子儿茶素3-O-gallate降低了代码在GK大鼠中的促炎细胞因子的表达的基因的表达，包括TNF-α和IL-1β［58]．
评估PRESELINIDINS对分化的人软骨细胞产生前列腺素E2（PGE2）的影响在体外以及对环氧合酶同功酶COX-1和COX-2的抑制作用。通过在10和100℃下测定的没食子酸二聚体、没食子酸/表没食子儿茶素以及没食子酸三聚体，PGE2的合成显著减少 μg / L。此外，这些化合物抑制COX-1和COX-2 [59]．
前啡肽的不同二聚体通过UPLC-ESI-MS分析其有机部分进行鉴定沙棘（圣说）;因此，基于先前据报道此类化合物的炎症介质的抑制性，假设产丁胺可能有助于这里描述的SAO的抗炎活性是可行的。
4.结论
总之，在体外在LPS刺激的THP-1细胞上筛选巴西植物可鉴定出四种具有显著抗TNF活性的提取物-α活动从乙醇提取物中提取的水和有机部分沙棘茎皮在LPS诱导的急性关节炎模型上显示出明显的抗炎活性，以剂量依赖性的方式减少细胞向关节周围组织的迁移。UPLC-ESI-MS分析确定，没食子酸和B型前啡肽二聚体可能是导致th的抗炎特性的化合物我们的研究结果在一定程度上有助于证实植物的传统用途沙棘作为抗炎药，并指出该物种作为生物活性化合物来源的潜力。
竞争利益
作者声明他们没有相互竞争的利益。
致谢
巴西的CNPq和巴西的Fapemig，以及研究（Danielle G.de Souza、Fernão C.Braga和Mauro M.Teixeira）和本科生（Olívia Corrêa）研究金的财政支持受到了认可。作者感谢巴西的CAPES获得博士研究金（Bárbara o.Henriques）。这项工作得到了欧洲共同体第七个框架计划[FP7-2007-2013]的资助，资助协议为HEALTH-F4-2011-281608。
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