ECAM 以证据为基础的补充和替代医学 1741 - 4288 1741 - 427 x Hindawi出版公司 10.1155 / 2016/9872598 9872598 研究文章 在体外肿瘤坏死因子-<我nline-formula> α 抑制活性的巴西植物和抗炎的效果<我talic> Stryphnodendron adstringens在急性关节炎模型 戴安娜 芭芭拉阿。 1 科雷亚 奥利维亚 1 代理 伊莱恩·帕特里夏·C。 1 帕多瓦 罗德里戈·M。 1 奥利维拉 维维安路易丝美国德 2 奥利维拉 蒂亚戈恩里克C。 2 卖座的 多斯桑托斯 2 迪亚斯 安娜卡F。 3 http://orcid.org/0000 - 0002 - 7478 - 5934 Souza 丹尼尔·g·德 3 阿马拉尔 弗拉维奥。 2 http://orcid.org/0000 - 0002 - 6944 - 3008 特谢拉 毛罗·M。 2 Castilho 瑞秋O。 1 http://orcid.org/0000 - 0001 - 9468 - 376 x 布拉加 Fernao C。 1 高 Jian-Li 1 制药科学系的 教师的药店 联邦德·米纳斯吉拉斯大学 校园Pampulha 加拉卡斯安东尼奥卡洛斯6627 31.270 -901年贝洛奥里藏特 毫克 巴西 ufmg.br 2 生物化学和免疫学 生物科学学院 联邦德·米纳斯吉拉斯大学 校园Pampulha 加拉卡斯安东尼奥卡洛斯6627 31.270 -901年贝洛奥里藏特 毫克 巴西 ufmg.br 3 微生物学系 生物科学学院 联邦德·米纳斯吉拉斯大学 校园Pampulha 加拉卡斯安东尼奥卡洛斯6627 31.270 -901年贝洛奥里藏特 毫克 巴西 ufmg.br 2016年 27 10 2016年 2016年 12 05年 2016年 29日 09年 2016年 2016年 版权©2016芭芭拉·o·戴安娜et al。 这是一个开放的文章在知识共享归属许可下发布的,它允许无限制的使用,分布和繁殖在任何媒介,提供最初的工作是正确的引用。

Stryphnodendron物种,被命名为“barbatimao”,通常用于巴西消炎药。本研究旨在探讨barbatimao和11个其他物种的影响在肿瘤坏死因子-α(TNF -的生产<我talic> α)在脂多糖(LPS)刺激THP-1细胞,以及他们anti-arthritis活动。的提取<我talic> Stryphnodendron adstringens,<我talic> Stryphnodendron obovatum,<我talic> Campomanesia lineatifolia,<我talic> 榄仁树属glabrescens促进了浓度抑制TNF -<我talic> α。小鼠注射LPS在膝关节治疗<我talic> 每个操作系统分数与所选的提取。有机(SAO)和水(SAA)的分数<我talic> 美国adstringens提倡减少白细胞游走存在剂量依赖的相关性和中性粒细胞聚集到关节,但是没有一个处于浓度降低periarticular组织。相比之下,治疗<我talic> c . lineatifolia和<我talic> t . glabrescens分数没有改善炎症参数。超圣的液相色谱分析(UPLC)耦合的电喷雾电离质谱(质)识别了没食子酸以及11 prodelphinidins单体和二聚体的b型特点。我们的发现在某种程度上有助于确凿的传统使用<我talic> 美国adstringens作为一种抗炎剂。这个活动可能是减少白细胞游走到炎症相关的网站。多酚没食子酸和prodelphinidins等活动中确定分数,可能导致观察到的活动。

 慰问Nacional de Desenvolvimento Cientifico e学府 Fapemig Coordenacao de Aperfeicoamento de Pessoal de含量优越 第七框架计划 健康- f4 - 2011 - 281608 1。介绍

肿瘤坏死因子-α(TNF -<我talic> α)是一种重要的促炎细胞因子后迅速释放炎症刺激。它提示几个细胞内事件,导致核转录因子的激活(NF -κB<我talic> κB),导致生产其他促炎细胞因子、趋化因子、蛋白酶( 1, 2]。细胞因子的生产过剩与不同的炎性疾病有关,包括类风湿性关节炎( 3]。肿瘤坏死因子-<我talic> α抑制剂在临床上用于治疗类风湿性关节炎;然而,可用的抑制剂是昂贵的生物药物,注射用和不有效的需求所有患者( 4]。因此,肿瘤坏死因子-<我talic> α被认为是一个有效的目标,开发新的药物来治疗慢性炎性疾病和鉴定的化合物可以作为拮抗剂的细胞因子通过口服途径是目前要求。

天然产物的抗炎特性不同的化学类已经被证明了<我talic> 在体外和<我talic> 在活的有机体内实验。植物成分黄酮类、萜类、生物碱、大麻类、皂苷含量,已报告植物甾醇抑制的上游信号分子参与TNF -<我talic> α了的表情,Verma et al。 5)和伊克巴尔et al。 6]。此外,一些天然产物与TNF -<我talic> α抑制房地产也表现出抗氧化应激活动( 7]。

巴西植物的一个巨大来源生物活性分子和我们最近报道了几种药用植物的筛选寻找新的肿瘤坏死因子-<我talic> α抑制剂( 8, 9]。进一步调查的一些物种选择导致了隔离和/或特征不同的肿瘤坏死因子-<我talic> α对手,包括两个新的glucosylated heterotrimeric类黄酮<我talic> Mansoa物种( 10),随着黄酮C-glycosides与乌头酸<我talic> Echinodorus grandiflorus( 11]。在我们持续寻找新的肿瘤坏死因子-<我talic> α抑制剂,在目前的研究中我们报告抑制细胞因子释放由脂多糖(LPS)刺激THP-1单核细胞的细胞引起巴西13个药用植物提取物的,还有的活动<我talic> Stryphnodendron adstringens急性关节炎模型,以及其化学特性。

 2。材料和方法 2.1。植物材料和提取制备

十三个植物物种被选为研究基于传统使用治疗炎性疾病<我talic> 。收集和提取数据连同ethnopharmacological使用所选的植物中描述表 1。

巴西植物为研究植物和受欢迎的名字,选择的数据收集、凭证号码和ethnopharmacological用途。

植物的名字 家庭 位置 凭证数量 Ethnopharmacological使用 引用
Bowdichia virgilioidesH.B.K. 蝶形花科 贝洛奥里藏特、镁 BHCB 166999 腹泻、痛风、糖尿病、支气管炎、高热、子宫的炎症和风湿病 ( 12, 13]
Campomanesia lineatifolia鲁伊兹和奶油水果蛋白饼。 桃金娘科 校园UFMG BHCB 150.606 痢疾,胃和肝脏问题,腹泻,尿路的问题,白带 ( 14, 15]
科迪亚guazumaefolia(Desv)。Roem。& S。 紫草科 校园UFMG BHCB 166998 治疗风湿病的和抗炎剂 ( 16]
Hymenaea苛巴里尔木l 蝶形花科 MHJB UFMG BHCB 161553 主音,镇痛,抗菌,抗炎、解热、化痰的,治疗风湿病的泻药 ( 17]
Hymenaea stigonocarpa集市。前海。 蝶形花科 校园UFMG BHCB 47.468
Licania tomentosaBenth。 可可李科 校园UFMG BHCB 152221 糖尿病 ( 18]
Mikania glomerataSprengel 菊科 校园UFMG BHCB 167001 哮喘、支气管炎 ( 19]
Paepalanthus bromelioides对峙 谷精草科 塞拉做Cipo BHCB 24241 细胞毒性和抗诱变剂的 ( 20., 21]
Stryphnodendron adstringens(集市)。阿尔蒙 蝶形花科 Ritapolis、镁 BHCB 111231 伤口愈合和治疗炎症、腹泻,白带 ( 22]
Stryphnodendron obovatumBenth。 蝶形花科 校园UCDB,女士 cgm 329997
榄仁树属glabrescens集市。 使君子科 校园UFMG BHCB 167015 抗疟、抗癌、抗炎和腹泻的治疗,溃疡和糖尿病 ( 23]
Vernonia phosphorea(好。)蒙泰罗 Vernoniaceae 校园UCDB,女士 cgm 11970 哮喘、痔疮、糖尿病、风湿和利尿、祛痰剂和伤口的愈合 ( 24]
牡荆polygama可汗。 马鞭草科 校园UFMG BHCB 166996 通经剂、利尿剂和治疗肾脏疾病 ( 25, 26]

植物材料干40°C通风烤箱和一把刀磨粉。部分(5克)的植物材料粉提取乙醇96°GL在室温条件下,超声波浴(3<我nline-formula> × 50毫升,20分钟)。提取过滤,减压下的溶剂被蒸发在旋转蒸发器,在最大温度50°C,导致原油提取中描述表 2。

抑制肿瘤坏死因子-<我talic> α释放LPS-stimulated THP-1 ethanolic细胞诱导的植物提取物的巴西。

植物物种 工厂的部分 萃取率(%) 浓度(<我talic> µg / mL) 抑制肿瘤坏死因子-<我talic> α (%±SD)
控制 ∗ DMSO (0.1% v / v) ∗ 11.72到42.06 pg / mL
∗ 有限合伙人(100 ng / mL) ∗ 1523.96到3694.08 pg / mL
地塞米松(0.1<我talic> µ米) 86.7±1.1
Bowdichia virgilioides 叶子 39.7 250年 −6.9±4.7
125年 −21.9±13.6
62.5 −46.0±9.4
阀杆 34.2 250年 −21.1±6.4
125年 −118.2±2.4
62.5 −83.8±9.7
Campomanesia lineatifolia 叶子 37.8 250年 41.1±3.1
125年 4.9±0.3
62.5 −15.6±0.6
阀杆 32.7 250年 −78.2±5.1
125年 −49.6±8.8
62.5 −37.2±7.1
科迪亚guazumaefolia 叶子 22.1 250年 ND
125年 ND
62.5 ND
阀杆 18.8 250年 ND
125年 ND
62.5 ND
Hymenaea苛巴里尔木 叶子 13.8 250年 98.6±1.5
125年 28.6±9.7
62.5 98.6±23.7
Hymenaea stigonocarpa 叶子 8.8 250年 98.5±0.6
125年 35.5±6.0
62.5 −11.9±0.9
Licania tomentosa 叶子 29.4 250年 −21.9±4.6
125年 −60.8±10.1
62.5 −70.2±7.1
Mikania glomerata 叶子 16.0 250年 12.3±12.3
125年 −17.8±2.7
62.5 −20.4±2.3
阀杆 18.7 250年 ND
125年 ND
62.5 ND
Paepalanthus bromelioides 叶子 7.7 250年 −36.4±15.9
125年 −18.5±53.2
62.5 −25.6±24.7
Stryphnodendron adstringens 树皮 44.8 250年 42.1±3.1
125年 19.3±0.5
62.5 −9.4±0.8
Stryphnodendron obovatum 树皮 33.1 250年 54.2±3.0
125年 31.6±1.8
62.5 4.4±0.1
榄仁树属glabrescens 叶子 26.3 250年 42.2±5.3
125年 26.5±3.0
62.5 −0.9±0.1
阀杆 29.1 250年 −5.3±11.3
125年 −8.31±41.5
62.5 −16.8±28.2
Vernonia phosphorea 叶子 31.2 250年 96.2±1.1
125年 13.8±0.7
62.5 −23.6±0.4
牡荆polygama 叶子 36.4 250年 −35.3±6.3
125年 −93.2±3.1
62.5 −66.7±9.0
阀杆 32.1 250年 −56.7±6.6
125年 −48.2±6.9
62.5 −36.4±2.3

∗ 肿瘤坏死因子的浓度,<我talic> α在控制测量(0.1% DMSO)或LPS-stimulated细胞。

ND:不确定(细胞生存能力< 90%)。

一个类似的过程准备采用二氯甲烷和乙酸乙酯提取物最活跃的植物(<我talic> Campomanesia lineatifolia,<我talic> Stryphnodendron adstringens,<我talic> Stryphnodendron obovatum,<我talic> 榄仁树属glabrescens)。相比之下,水提取物是由注入(叶子)或煎煮(树皮),采用5 g的植物药物50毫升蒸馏水。获得的提取物被冻干过滤和干燥。收益率(重量/体重w / w)的二氯甲烷,乙酸乙酯,和水提取,分别为7.70%,10.04%,25.40%<我talic> c . lineatifolia6.18%、8.58%和38.00%<我talic> s . adstringens6.67%、9.54%和35.80%<我talic> 美国obovatum11.84%,13.17%,19.56%<我talic> t . glabrescens。

 2.2。肿瘤坏死因子-α<斜体> < /斜体>抑制试验

的抑制TNF -<我talic> α释放引起的提取(表 1写明ATCC tib)是化验LPS-stimulated THP-1细胞(- 202),如前所述[ 27]。总之,细胞(1.0<我nline-formula> × 106细胞/毫升)被转移到96孔酶标在每口井的100000个细胞的密度和孵化18 h。然后,他们使用的提取和分数3 h和有限合伙人(美国Sigma-Aldrich)增加了炎症刺激(100 ng / mL, 20<我talic> μL)。在一夜之间37°C,孵化后板是离心机(1800<我nline-formula> × g, 5分钟,16°C),上层的收集,TNF -<我talic> α量化了cytokine-specific三明治定量酶联immune-sorbent试验(ELISA),根据制造商的说明(tnf两集,DY210,研发系统,美国)。细胞颗粒被用来评估细胞生存能力的3 - (4 5-dimethylthiazol-2-yl) 2, 5-diphenyltetrazole (MTT)方法。细胞生存能力评估所有测试样品(提取和分数)和确定可行的细胞和总细胞之间的比例,使用未经处理的细胞生存能力提供了参考依据。样品给细胞生存能力90%以上被认为是无毒THP-1细胞系。

的抑制TNF -<我talic> α释放LPS-stimulated THP-1细胞被TNF -之间的比例计算<我talic> α细胞分泌总量(pg / mL)和细胞因子的水平(pg / mL)观察与有限合伙人参与细胞的刺激。四氢呋喃-<我talic> α抑制被报道为百分比值[1−(细胞因子的分泌细胞/细胞因子的分泌细胞培养使用溶剂控制)<我nline-formula> × 100]。统计学意义的差异计算采用GraphPad棱镜软件,版本5.0 (GraphPad软件有限公司、美国),使用单向方差分析后跟Newman-Keuls测验后的多重比较。结果被认为是显著不同<我nline-formula> p < 0.05 。

测试样本一式三份的浓度62.5,125年和250年<我talic> μ克/毫升。为<我talic> c . lineatifolia s adstringens obovatum,<我talic> t . glabrescens用二氯甲烷提取,乙酸乙酯和水也在同一浓度测试。地塞米松(Sigma-Aldrich 0.1<我talic> μM)是采用积极的控制。

 2.3。制备有机和水分数从原油中提取

ethanolic提取的<我talic> c . lineatifolia adstringens,<我talic> t . glabrescens被分区分级之间的非混相溶剂。(3.0克)的提取部分悬浮在水中(54毫升)和乙醇的混合/分区<我nline-formula> 我 丙醇/<我nline-formula> n 丁醇(42:12:6体积/体积/体积,v / v / v;180毫升),在机械搅拌30分钟。漏斗分离阶段分离,收集和水层和被萃取有机混合物的两倍。有机和水阶段集中在减压渣在最大旋转蒸发器温度50°C,在有机和水的分数<我talic> c . lineatifolia(1.50 g和1.19 g、职责),<我talic> 美国adstringens(1.32 g和1.27 g、职责),和<我talic> t . glabrescens(1.74 g和0.96 g、职责)。

 2.4。LPS-Induced急性炎症 2.4.1。动物和实验协议

有机食品和水的分数<我talic> c . lineatifolia adstringens,<我talic> t . glabrescens抗炎活性检测,如达等。所述 28]。女性瑞士老鼠(6周),体重28到32 g,从动物获得教师的住房单元制药、UFMG,用于实验。所有实验之前收到UFMG伦理委员会的批准(CETEA、证书编号83/2015)。动物每组(6)治疗与分数(10、100和1000毫克/公斤,<我talic> 每个操作系统)或积极的控制(地塞米松4毫克/公斤,皮下)或车辆(水含0.5%重量/体积,w / v,羧甲基纤维素)。九十分钟治疗后,他们的腹腔内注射麻醉的混合氯胺酮和甲苯噻嗪磷酸盐(PBS) (1: 0.5: 3 v / v / v)和10<我talic> μ(10 L有限合伙人的解决方案<我talic> μ在盐水g / mL)是注入膝关节(100 ng /关节腔)。控制动物注射10<我talic> μPBS的L。12小时后,关节腔被曝光和洗两次5<我talic> μL 3%的牛血清白蛋白(BSA)在PBS。联合灌洗是稀释至100年<我talic> μL使用3% BSA和雇佣和微分细胞计数。

总细胞数进行了使用一个整除(10<我talic> μL)的联合灌洗沾机器人解决方案(10<我talic> μL),其次是计算在一个纽鲍尔室。嗜中性粒细胞计数,幻灯片由离心法剩下的90人<我talic> μL 450年联合灌洗的<我nline-formula> × cytocentrifuge g为5分钟(Shandon Cytospin 3,热科学、美国)。风干涂片是沾展示全景的污渍。periarticular组织被测定的趋化因子(C-X-C主题)配体1(处于)和肿瘤坏死因子-<我talic> α水平,随着髓过氧化酶(MPO)活动。

 2.4.2。决心处于受控和TNF -α<斜体> < /斜体>免疫测定和MPO活性

periarticular组织与细胞因子提取称重和提取解决方案(0.1毫米phenylmethylsulfonyl氟化物(PMSF)、0.1 nM苄索氯铵,10毫米乙二胺四乙酸(EDTA), 20 KI抑肽酶,和0.05%渐变20在PBS)的比率1毫升的解决方案100毫克的组织。10.000材料均质和离心机<我nline-formula> × g 10分钟,在4°C。上层清液的收集和TNF -<我talic> α和处于水平测量使用ELISA根据制造商的指示(处于二人组,DY453和tnf两集,DY410,研发系统,美国)。

细胞颗粒是留给髓过氧物酶活动如前所述的决心 29日]。它是悬浮在缓冲2(0.05米短茸毛4和0.5% w / v<我talic> n-hexyltrimethylammonium溴化,pH值5.4)和均质30年代。样品在液氮冷冻和解冻三次,离心机,享年10000岁<我nline-formula> × g为15分钟,在4°C,上层清液收集MPO活性的测定。一个整除(25<我talic> μL)的样本,三次稀释缓冲2,添加到96孔酶标。然后,25<我talic> μL(1.6毫米3,3′,5、5′-tetramethylbenzidine(三甲)解决方案增加了板是在37°C孵化5分钟。在那之后,0.002%过氧化氢(100<我talic> μL)添加和板是孵化37°C的额外5分钟。通过添加50反应停止<我talic> μL 1.0硫酸溶液。MPO活性决定通过测量吸光度在450 nm标(无限200 Pro, Tecan,瑞士)。MPO活性比较计算的光密度(OD)从小鼠肺中性粒细胞的OD获得的样本提交相同的过程和结果表示为MPO相对单位/<我talic> μg。

 2.4.3。测定肿瘤坏死因子-α<斜体> < /斜体>通过实时聚合酶链反应(rt - pcr)

肿瘤坏死因子的表达,<我talic> α成绩单在periarticular组织也是由实时PCR,如前所述[ 30.]。总RNA分离滑膜组织使用试剂盒(Ambion,生活技术,美国制造商的指示。总RNA resuspended diethylpyrocarbonate-treated水和储备−70°C。制备cDNA使用1执行<我talic> µ克RNA和上标™III逆转录酶工具包(表达载体,生活技术,美国),根据制造商的指示。实时PCR进行使用电力SYBR绿色PCR大师混合2 x(美国应用生物系统公司)在7500年快速实时PCR系统(美国应用生物系统公司)。分析基因的相对表达由ΔΔCt决定方法,即数据为每个样本被归一化3 -磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)组成型基因和表达为一个褶皱变化与控制( 30.]。以下引物配对使用:GAPDH、5′- ACG GCC GCA TCT TCT TGT GCA 3′(向前)和5′- CGG CCA AAT 20 TTC ACA 20 3′(反向);mTNF -<我talic> α甘氨胆酸、5′- ACG TGG ATC柠檬酸亚美大陆煤层气有限公司交流3′(向前)和5′- AGA标签CAA ATC GGC TGA CG 3′(反向)。

 2.4.4。统计分析

结果表示为均值±SEM的六个动物为每个组。统计学意义的差异计算采用软件GraphPad棱镜,版本5.0 (GraphPad软件有限公司、美国),使用单向方差分析后跟Newman-Keuls测验后的多重比较。结果被认为是显著不同<我nline-formula> p < 0.05 。

 2.5。表征<斜体> s adstringens < /斜体>超化学成分的液相色谱(UPLC)耦合的电喷雾电离质谱(质)

的有机分数<我talic> 美国adstringens茎皮UPLC-ESI-MS (SAO)进行了分析。ACQUITY超性能的分析进行了LC系统(水域,美国)与PDA 2996光敏二极管阵列检测器(水域,美国)和一个ACQUITY TQ检测器(英国水域MS技术),配有Z-spray电喷雾电离(ESI)源在正面和负面的运营模式。MassLynx软件(版本4.1,水域,美国)是用来控制仪器,以及数据采集和处理。

分析进行LiChrospher 100 RP-18列(250<我nline-formula> × 4毫米的身份证。,5<我talic> μm;水域)在40°C,与线性梯度淋洗水的(a)和乙腈(B),均包含0.1% v / v甲酸,1毫升/分钟的流量,如下:5%到40%的B在60分钟,其次是5分钟的权力平等主义的洗脱(B)的40%;并返回到初始条件在5分钟 31日]。reequilibration时间5分钟之间保持运行。示例解决方案(5毫克/毫升的分数参考化合物和1毫克/毫升)溶解在甲醇/水(1:9 v / v),过滤超过0.45<我talic> μ聚四氟乙烯(PTFE)膜和整除(8<我talic> µL)自动注入系统。色谱在注册<我talic> λ210海里。

操作参数如下女士:扫描模式质量范围内的正面和负面的<我talic> m / z100 - 2000 Da,反溶剂温度达到375°C,反溶剂气体流量为600 L / h,锥气流60毫升/分钟,源温度达到120°C,锥电压60 V,毛细管3000 V的电压。喷雾器的气体是氮气。

串联质谱(UPLC-ESI-MS / MS)分析进行了本·RP-18列(50<我nline-formula> × 2.1毫米身份证。,1.7<我talic> μm;水域)在40°C。水的一个线性梯度(A)和乙腈(B),均包含0.1% v / v甲酸,雇佣,在0.3毫升/分钟的流量,5到10分钟B的95%,紧随其后的是1分钟的权力平等主义的洗脱,回到2分钟的初始条件。两分钟reequilibration一直运行之间的时间。以下MS / MS操作参数是用于分析:扫描模式质量范围内的正面和负面的<我talic> m / z100 - 1500,反溶剂温度达到350°C,反溶剂气体流量为550 L / h,锥50毫升/分钟的气流,源温度达到120°C,锥电压60 V,毛细管3500 V的电压。氮和氩使用喷雾器气体。

 3所示。结果与讨论 3.1。抑制肿瘤坏死因子-α<斜体> < /斜体>释放THP-1细胞提取物引起的

其毒性的植物提取物进行评估THP-1 MTT法细胞以确保anti-TNF -<我talic> α活动不产生毒性作用。所有提取被认为noncytotoxic,除了<我talic> Mikania glomerata(茎)和<我talic> 科迪亚guazumaefolia(叶子和茎),产生细胞生存能力低于90%最高测试浓度(250<我talic> μg / mL)。

肿瘤坏死因子- noncytotoxic提取的影响<我talic> α释放LPS-stimulated THP-1细胞在三个浓度化验,结果中描述表 2。的提取<我talic> Licania tomentosa, Paepalanthus bromelioides,<我talic> 牡荆polygama,<我talic> Bowdichia virgilioides(叶子和茎),<我talic> Campomanesia lineatifolia(茎)增强TNF -的生产<我talic> α由LPS-stimulated细胞,这表明促炎成分的存在。有趣的是,当化验nonstimulated THP-1细胞,没有提取增加TNF -<我talic> α生产(数据未显示)。这些植物提取物与有限合伙人可能协同作用,增加炎症反应。

的种子和吠叫<我talic> b . virgilioides传统上用于治疗不同的炎症条件( 12]。虽然<我talic> b . virgilioides增强生产四氢呋喃-<我talic> α在筛选报告,与茎提取物的抗炎特性准备叫和树叶的物种之前在动物模型中进行验证,使用卡拉胶和乙酸作为炎性刺激( 32, 33]。在同一个方向,煎煮的叶子<我talic> l . tomentosa被证明有antinociceptive和消炎作用 34]。

在19日提取化验,这些的<我talic> c . lineatifolia(树叶),<我talic> 榄仁树属glabrescens(树叶),<我talic> Stryphnodendron adstringens(树皮),<我talic> Stryphnodendron obovatum(树皮),<我talic> Hymenaea stigonocarpa,<我talic> Vernonia phosphorea抑制肿瘤坏死因子的释放<我talic> α浓度的方式。的提取<我talic> Hymenaea苛巴里尔木也抑制了细胞因子释放,但浓度响应特征不可能,因为没有差别的低,浓度越高抑制引起的化验。旨在进一步调查anti-TNF -<我talic> α效应的活性物种,增加极性的提取物(二氯甲烷、乙酸乙酯和水)准备<我talic> c . lineatifolia(树叶),<我talic> t . glabrescens(树叶),<我talic> 美国adstringens(树皮)<我talic> 美国obovatum(树皮)和它们对细胞因子抑制的影响评估在LPS-stimulated THP-1细胞(图 1)。

抑制肿瘤坏死因子-<我talic> α释放LPS-stimulated THP-1细胞引起的植物提取物、化验为62.5,125年和250年<我talic> µg / mL:(一)<我talic> Campomanesia lineatifolia(树叶),(b)<我talic> Stryphnodendron adstringens,(c)<我talic> Stryphnodendron obovatum,和(d)<我talic> 榄仁树属glabrescens(树叶)。数据表示的意思是抑制(%)±标准差(SD)从三个独立的实验。意味着分析单向方差分析、多重比较后由Newman-Keuls测试(<我nline-formula> p < 0.05 ),而控制(细胞+ LPS)。<我nline-formula> ∗ 表明显著抑制肿瘤坏死因子-<我talic> α释放LPS-stimulated相比细胞;<我nline-formula> p < 0.05 。

ethanolic和水提取的<我talic> 美国adstringens,<我talic> 美国obovatum,<我talic> t . glabrescens抑制肿瘤坏死因子-<我talic> α生产明显在大多数的化验浓度,而乙酸乙酯提取的<我talic> 美国adstringens仅仅是活跃的250<我talic> µ克/毫升。相比之下,提取的<我talic> 美国obovatum用二氯甲烷和乙酸乙酯似乎存在促炎属性,因为在TNF -显著增加<我talic> α浓度在治疗后观察。因此,只有这些物种的极性提取物引起显著抑制肿瘤坏死因子-<我talic> α通过刺激细胞生产。

与我们的研究结果相似,缝合( 35]报道重大TNF -<我talic> α抑制由高极性提取物<我talic> Rhamnidium elaeocarpum茎皮对小鼠巨噬细胞刺激有限合伙人。同样,TNF -<我talic> α抑制活性ethanolic从巴西植物提取出来的<我talic> Caryocar brasiliense, Casearia抗旱性,<我talic> Coccoloba cereifera最近被美国( 8]。另一方面,其他作者报道高TNF -<我talic> α抑制活性低极性提取相比,甲醇提取物,像那些从不丹植物用二氯甲烷和氯仿 36]。

这是第一个报告anti-TNF -<我talic> α的活动<我talic> c . lineatifolia,尽管其他物种<我talic> Campomanesia描述了消炎,像什么<我talic> Campomanesia velutinaethanolic从树叶中提取的减少小鼠角叉菜胶诱导的爪子水肿( 37]。在以前的出版物中,我们描述了anti-TNF -<我talic> α的活动<我talic> 榄仁树属glabrescens在LPS-stimulated THP-1细胞( 8]。提取准备的抑制活动报道的植物材料收集在一个不同的站点确认我们之前发现和披露<我talic> t . glabrescens作为一个有前途的物种<我talic> 在活的有机体内研究报告部分 3.2。

 3.2。评估选择分数LPS-Induced急性关节炎

最初的筛选提取的LPS-stimulated THP-1细胞披露<我talic> 美国adstringens,<我talic> 美国obovatum,<我talic> c . lineatifolia,<我talic> t . glabrescens显著的肿瘤坏死因子-<我talic> α抑制活动。的水提取物<我talic> 美国adstringens和<我talic> t . glabrescens引起anti-TNF——更有效<我talic> α比他们的ethanolic THP-1细胞提取物的反应;然而,针对更高的水提取物的复杂性和困难的化学特性,他们不是优先进行进一步的研究。因此,上述的ethanolic提取物种,除了<我talic> 美国obovatum,被分级分区之间的非混相溶剂和由此产生的有机和水分数在LPS-induced评估急性关节炎模型,在三种不同剂量(100和1000毫克/公斤)。

有机的水分数<我talic> c . lineatifolia和<我talic> t . glabrescens不会降低细胞迁移到关节,以及化学引诱物的释放趋化因子处于受控或髓过氧化酶(MPO) periarticular组织的活动,在所有的化验剂量(数据未显示)。因为这些提取物显著抑制肿瘤坏死因子-<我talic> α释放<我talic> 在体外,它是可行的假设的情况下<我talic> 在活的有机体内活动可能与低吸收或代谢的生物活性化合物。

有机(SAO)和水(SAA)的分数<我talic> 美国adstringens显著降低白细胞招聘联合,化验剂量(图 2(一个))。这些分数也减少中性粒细胞聚集到关节腔在剂量依赖性的方式(图 2 (b))。没有减少处于浓度periarticular组织(图 2 (c)),以及在TNF -<我talic> α水平和MPO活性治疗后与圣或SAA(数据未显示)。

治疗与水(SAA)和有机(SAO)分数<我talic> Stryphnodendron adstringens减少总细胞和嗜中性粒细胞招募到膝关节LPS-induced关节炎。细胞的总数(a)和中性粒细胞的数量在滑膜腔(b)评估12 h与LPS诱导炎症后(车辆、V, SAA, SAO-treated小鼠组)或PBS(控制:C)膝关节的老鼠。处于受控的浓度(c)是评估ELISA 12 h后炎症诱导和表达为pg / 100毫克的组织。地塞米松(用4毫克/公斤)被用来控制。所有结果都表示为均值的平均值±标准误差(SEM)和至少两个实验的代表。<我nline-formula> p ∗ < 0.05 相比vehicle-treated老鼠(<我nline-formula> n = 6 )(方差分析,Student-Newman-Keuls期末测验)。

炎症的细胞反应是由中性粒细胞,第一效应器招募的急性炎症反应。单核细胞是下一个受伤的细胞迁移到现场指导下趋化因子,分化后到组织中巨噬细胞( 38]。因此,化合物能够减少中性粒细胞迁移可能减弱炎症过程,由于这个原因,<我talic> 美国adstringens分数巴西和南非航空公司是一个潜在的抗炎化合物的来源。

抗炎活性<我talic> 美国adstringens先前已经调查过。茎皮的丙酮分数降低了爪角叉菜胶引起的水肿和右旋糖酐老鼠,口服400和800毫克/公斤。这个分数,让老鼠服用800毫克/公斤,减少渗出物体积和角叉菜胶引起的白细胞游走在急性胸膜炎和减少血管通透性增强腹腔注射醋酸的老鼠,在同一剂量。此外,分数显著降低的爪子水肿subplantar antigen-induced关节炎大鼠,在800毫克/公斤 39]。我们在此报告的抗炎效果<我talic> 美国adstringens在大幅降低剂量,也证明水的活动的一部分,由高度极性成分。

值得注意的是,巴西和南非航空公司在100毫克/公斤通过口服途径减少白细胞游走33±11%,26±9%,分别作为阳性对照观察与地塞米松相似的响应给予皮下注射抑制(33±6%)。这一发现突出的抗炎效果的相关性<我talic> 美国adstringens这里报道。据我们所知,没有以前的报告的影响<我talic> 美国adstringens在膝盖LPS诱导的小鼠急性关节炎模型,以及<我talic> 在体外抑制肿瘤坏死因子-数据<我talic> α释放。

治疗圣和SAA明显减少了中性粒细胞迁移到膝关节,但无论是处于受控的内容还是periarticular组织MPO活性显著降低。因此,这些分数可能引起的中性粒细胞减少的招聘不由于处于抑制,可能经历了由其他机制。科学家蛋白质、类处于受控,是主要从事嗜中性粒细胞趋化因子招聘发炎组织( 40]。中性粒细胞招募也受到抑制或生产/释放由化合物干扰其它趋化因子和趋化因子受体和趋化因子之间的绑定和粘多糖,从而削弱中性白细胞滚动。粘附分子的表达下降或封锁在中性粒细胞和内皮细胞可能影响招聘( 41- - - - - - 44]。

髓过氧化酶(MPO)是一种中性粒细胞产生的酶,这过程中起着重要作用生成氧化物种,参与宿主抵御微生物( 45]。尽管在中性粒细胞计数明显降低动物接受巴西和南非航空公司的联合,我们不能检测MPO活性显著降低(数据没有显示)。

美国adstringens提取降低TNF -<我talic> α生产<我talic> 在体外假设这是可行的细胞因子也可能参与圣的抗炎效果和SAA分数。然而,肿瘤坏死因子-<我talic> α内容可以量化和periarticular组织中发现的动物对待分数,以及对照组12 h后有限合伙人管理。这个时间段是基于我们之前的结果,显示白细胞游走到关节发炎的峰值发生12 h有限合伙人注射后(未发表的数据)。针对测量TNF -<我talic> α生产<我talic> 在活的有机体内、巴西和南非航空公司评估在另一个实验中,periarticular组织收集六小时后注射炎症刺激。再一次,不能检测到细胞因子的实验小组(数据没有显示)。另外,我们试图衡量TNF -<我talic> α滑液中细胞因子以来报道在这个媒介达到最大浓度两个小时后注射LPS [ 46]。因此,细胞因子浓度测定在褪色的滑液样本收集一个或三个小时有限合伙人注射后,使用一个实时PCR方法。然而,两组之间没有显著差异(数据没有显示)。

这不是一项容易的任务量化TNF -<我talic> α在动物的关节内注射LPS的挑战。Nakayama et al。 47)测量肿瘤坏死因子-<我talic> α滑液的内容通过PCR白介素32-alpha (IL-32<我talic> α)转基因小鼠,两周后关节内注射LPS。作者报道大量的TNF -<我talic> α在转基因小鼠相比nontransgenic动物。肿瘤坏死因子的水平<我talic> α量化的滑液和中性粒细胞的老鼠注射LPS关节内的,2和3小时后刺激,通过流式细胞仪( 48]。滑液和TNF -的数量<我talic> α内容更高的老鼠比老鼠。这种差异可以解释的困难在检测TNF -<我talic> α在目前的工作,尽管使用不同的时段和分析方法。

LPS信号转导的理解对开发新的抗炎剂是至关重要的。有限合伙人绑定后toll样受体4 (TLR4)受体组成的复杂的化学TLR4和MD-2形成和启动一系列细胞内事件,这取决于不同的适配器。的早期和晚期反应导致核转录因子的激活(NF -κB<我talic> κB)和诱导了细胞因子,趋化因子,及其他转录因子( 49]。炎症细胞响应通过增加生产的炎性细胞因子和趋化因子参与白细胞招聘。因此,化合物能够抑制生产和/或释放这些介质可能减弱炎症过程和一些植物物种与这个目的,评估使用有限合伙人作为炎症刺激。

 3.3。植物化学的描述超圣的液相色谱(UPLC)耦合的电喷雾电离质谱(质)

的化学成分<我talic> 美国adstringens有机分数(SAO)被UPLC-ESI-MS评估。在既定的条件下,12个化合物被确定基于紫外光谱数据和电喷雾质谱碎片图案与参考化合物相比,当可用,或与文献数据报告<我talic> 美国adstringens( 50- - - - - - 52]。物种的化学成分包括flavan-3-ol寡聚物如prodelphinidins prorobinetinidins,随着衍生品。作业的主要山峰圣UPLC-ESI-MS色谱图(图中找到 3表中所示 3。

作业和峰值UPLC-ESI-MS碎片数据成分的有机部分<我talic> Stryphnodendron adstringens(巴西)。

数量 假定的化合物 Rt(分钟) λ马克斯(nm) 应急服务国际公司−离子(<我nline-formula> 米 / z ) 应急服务国际公司+离子(<我nline-formula> 米 / z ) 兆瓦(克/摩尔) 分子式
1 没食子酸 5.96 212.3;269.3 169.4 [M−H]−,125.1 - - - - - - 170年 C7H6O5
2 二聚体:两个单位(epi)儿茶素 8.70 271.0 609.5 [M−H]−,137.2,209.1,305.3,423.3,441.6 611.7 [M + H]+,142.1,155.2,187.2 610年 C30.H26O14
3 儿茶素 9.98 271.0 305.4 [M−H]−,137.0,165.2 307.5 [M + H]+,142.1,164.2,187.2 306年 C15H14O7
4 二聚体:两个单位(epi)儿茶素3 -<我talic> O没食子酸盐 12.17 271.0 913.6 [M−H]−,137.1,169.2,259.2,382.1,445.3,761.5 915.6 [M + H]+,164.2 914年 C44H34O22
5 二聚体:4′-<我talic> O儿茶素3 -甲基- (epi)<我talic> O没食子酸盐和儿茶素3 - (epi)<我talic> O没食子酸盐 12.84 271.0 927.5 [M−H]−,137.2,169.3,305.1,319.5,609.2,762.5 164.2,930.4 928年 C45H38O22
6 儿茶素 14.88 271.0 305.4 [M−H]−,137.2,167.1,179.2 307.6 [M + H]+,139.2,164.4 306年 C15H14O7
7 二聚体:(epi)儿茶素和儿茶素3 - (epi)<我talic> O没食子酸盐 15.54 271.0 761.5 [M−H]−,137.3,169.0,305.1,591.4,609.9 763.5 [M + H]+,164.1,208.4 762年 C37H30.O18
8 4′-<我talic> O-Methyl-gallocatechin 16.50 271.0 319.3 [M−H]−,137.0,181.2,220.2,261.2,305.3 321.3 [M + H]+,164.4 320年 C16H16O7
9 二聚体:两个单位(epi)儿茶素3 -<我talic> O没食子酸盐 20.57 271.0 913.4 [M−H]−,137.0,169.2,319.6,458.2,608.7,775.5 915.8 [M + H]+,164.3,187.3,317.1 914年 C44H34O22
10 表3 -<我talic> O没食子酸盐 21.97 271.0 457.3 [M−H]−,137.2,169.3,305.3,319.1,331.4 459.5 [M + H]+,164.4,289.4 458年 C22H18O11
11 二聚体:4′-<我talic> O甲基- (epi)儿茶素和(epi)儿茶素 23.25 271.0 623.3 [M−H]−,137.0,305.2,319.6,440.8 624.6 [M + H]+,164.4 624年 C31日H30.O14
12 4′-<我talic> O儿茶素3 -甲基- (epi)<我talic> O没食子酸盐 28.20 271.0 471.7 [M−H]−,137.1,169.1,319.3 473.4 [M + H]+,164.3,187.3,208.5 472年 C23H20.O11

色谱获得有机分数(SAO)<我talic> Stryphnodendron adstringens注册,光电二极管阵列检测器(PDA)在220海里(a)和电喷雾电离质谱(质)的负离子模式分析(b)。确定了峰: 1没食子酸, 2,二聚体(两个单位(epi)儿茶素), 3儿茶素, 4,二聚体两个单位(epi)儿茶素没食子酸盐), 5,二聚体(甲基- (epi)儿茶素没食子酸盐和(epi)儿茶素没食子酸盐), 6儿茶素, 7,二聚体(epi)儿茶素和(epi)儿茶素没食子酸盐), 84′-<我talic> O-methyl-gallocatechin, 9,二聚体两个单位(epi)儿茶素没食子酸盐), 10、表3 -<我talic> O没食子酸盐, 11二聚体[甲基- (epi)儿茶素和(epi)儿茶素),和 12甲基- (epi)儿茶素没食子酸盐。

没食子酸的存在( 1保留时间(Rt) = 5.96分钟),儿茶素( 3,Rt = 9.98分钟)、儿茶素( 6、Rt = 14.88分钟)和儿茶素3 -<我talic> O没食子酸盐( 10相比,Rt = 21.97分钟)推断的保留时间和紫外光谱数据获取真实的样本(数据未显示)。表中描述的其他化合物 3认为基于他们的ESI分裂模式,获得的积极的和消极的离子分析模式。获得的数据兼容单体或prodelphinidins的调光器,有或没有取代基(甲基或galloyl单位)。

Prodelphinidins浓缩单宁的b型,由连续flavan-3-ol单位之间的联系,通常c - 4位置之间的“上层”单位和其他或8“低”或“启动”位置单元( 53]。可能的立体化学的联系<我talic> α或<我talic> β来自不同的异构体,出于这个原因,明确结构分配完全基于MS数据是不可行的。

在负离子模式下的分析(ESI- - - - - -),prodelphinidins的分散的特征是一个高峰<我talic> m / z305年,归因于一个片段的儿茶素或儿茶素单位的损失。同样,峰的存在<我talic> m / z609表示这些单位组成的二聚体。相比之下,一个片断<我talic> m / z169表示galloyl单元的化合物的损失。的分裂方案生成上述片段描绘在图 4对化合物 5和 7。

建议分裂的化合物 5(一)(二聚体甲基- (epi)儿茶素没食子酸盐和(epi)儿茶素没食子酸盐) 7(b)(二聚体(epi)儿茶素酸酯和甲基- (epi)儿茶素没食子酸盐)。

prodelphinidins发展的另一个特征碎片从Retro-Diels-Alder (RDA) prodelphinidin原子核的裂变,打破的环C买得起的片段<我talic> m / z137年,醌甲基化物( 54)(图 5)。消极的母离子扫描<我talic> m / z137年应用,允许确认结果分裂的化合物 4, 7, 8, 9, 10。

特征碎片从Retro-Diels-Alder prodelphinidin (RDA)裂变。

先前的调查的乙酸乙酯部分源自于丙酮/水(7:3 v / v)提取的<我talic> 美国adstringens茎皮导致不同prodelphinidins[的隔离 50]。在目前的研究中,我们发现一些山峰UPLC-ESI-MS圣相应化合物的色谱与分子量兼容prodelphinidins之前报道或其同分异构体,其中包括4′-<我talic> O-methyl-gallocatechin ( 8),由两个单元组成的二聚体(epi)儿茶素( 2分子量(MW, 610克/摩尔),两个二聚体由两个单位(epi)儿茶素3 -<我talic> O没食子酸盐( 4和 9MW, 914克/摩尔),和一个二聚体组成的(epi)儿茶素和儿茶素3 - (epi)<我talic> O没食子酸盐( 7MW, 762克/摩尔)。

梅洛et al。 50描述了儿茶素的分离3 -<我talic> O没食子酸盐- (4<我talic> β→儿茶素3 - 8)<我talic> O没食子酸盐,一种化合物分子量为914克/摩尔。圣的分析UPLC-ESI-MS披露与不同的色谱保留时间(两座山峰 4、Rt = 12.17分钟 9Rt = 20.57分钟),但是这给了相同的<我talic> 准分子离子在<我talic> m / z913年[M−H]−。这一发现表明,发生至少两个同分异构体的物种。此外,应急服务国际公司−- ms分析化合物 5(RT 12.84分钟)做了一个高峰<我talic> m / z927年[M−H]−,这是归因于上述异构体之一的甲基化衍生物。甲基的位置建议的B环(epi)儿茶素单元。这种假设是基于碎片的模式 5产生一个峰值<我talic> m / z319年,归因于的残渣<我talic> O甲基- (epi)儿茶素(M−H)−以及峰值<我talic> m / z169年,归因于galloyl一部分[M−H]−。以防galloyl一部分熊甲基、一个片段<我talic> m / z183应该发现。基于可用的数据,提出的结构是可行的 5的二聚体(epi)儿茶素3 -<我talic> O没食子酸盐和<我talic> O儿茶素3 -甲基- (epi)<我talic> O没食子酸盐(图 4(一))。

UPLC-ESI-MS频谱的分析圣还透露兆瓦的化合物624克/摩尔( 11Rt = 23.25分钟)。的分裂模式 11在负离子模式下记录的分析,表明它是由一个单位的(epi)儿茶素(<我talic> m / z305)和4′-之一<我talic> O甲基- (epi)儿茶素(<我talic> m / z319)。相比之下,复合 12给了<我talic> 准分子离子在<我talic> m / z471年[M−H]−。这种化合物可能是一个甲基化(epi)儿茶素没食子酸盐,由碎片的存在<我talic> m / z169年,对应galloyl组,<我talic> m / z319年,归结为一个单位的甲基- (epi)儿茶素。

Prorobinetinidins孤立于丙酮/水(7:3 v / v)提取的<我talic> 美国adstringens茎皮( 51]。然而,这类不确定的多酚UPLC-ESI-MS圣在目前进行的分析工作。这种缺失可能与不同的方法用于准备粗提物及其派生部分圣,以及不同的植物药物用于研究。

有几个prodelphinidins生物活性和一些抗炎性质证明了<我talic> 在体外和<我talic> 在活的有机体内模型。因此,儿茶素3 -<我talic> O没食子酸盐被认为具有抗炎作用,可能会影响不同的慢性炎症性疾病的发病机制。这种化合物的主要成分是绿茶,可能是研究最多的一个原花青素。抑制肿瘤坏死因子-<我talic> α释放BALB / 3 t3细胞刺激与冈田酸(IC5026<我talic> µ米)和抑制TNF的表达的基因<我talic> α( 55]。表3 -<我talic> O没食子酸盐,化验50<我talic> µg / mL,抑制肿瘤坏死因子的释放<我talic> α由LPS-stimulated THP-1细胞和反<我talic> β2 gpi /<我talic> β2 gpi复杂[ 56]。儿茶素没食子酸和儿茶素酯减少β白介素1 (il - 1的生产<我talic> β)和增强il - 10的生产,但没有影响il - 6和TNF -的生产<我talic> α,当测试<我talic> 在体外在10到20<我talic> μ由有限合伙人(M在人类白细胞刺激 57]。膳食补充剂与儿茶素的3 - 0.1%<我talic> O没食子酸盐基因的表达减少代码在GK大鼠的促炎细胞因子的表达,包括TNF -<我talic> α和il - 1<我talic> β( 58]。

prodelphinidins的影响在生产前列腺素E2 (PGE2)的人类软骨细胞分化是评估<我talic> 在体外,以及环氧合酶同功酶的抑制COX-1和cox - 2。PGE2的合成是显著降低由儿茶素二聚体和儿茶素/儿茶素,以及儿茶素三聚物,化验10和100年<我talic> μg / L。此外,这些化合物抑制COX-1和cox - 2 ( 59]。

不同的二聚体prodelphinidins被确定UPLC-ESI-MS分析有机的一部分<我talic> 美国adstringens(巴西);因此,基于抑制炎症介质之前报道的这类的化合物,它是可行的假设prodelphinidins可能导致圣在这里描述的抗炎活性。

 4所示。结论

总之,<我talic> 在体外筛选的巴西工厂THP-1细胞刺激有限合伙人允许识别四个提取重要anti-TNF -<我talic> α活动。水和有机分数来自ethanolic提取的<我talic> 美国adstringens茎皮显示显著的抗炎活性LPS所致急性关节炎模型,减少细胞迁移到periarticular组织方式存在剂量依赖的相关性。没食子酸和二聚的prodelphinidins b型,由UPLC-ESI-MS分析,确定化合物可能负责的抗炎特性的物种。我们的发现在某种程度上有助于确凿的传统使用<我talic> 美国adstringens抗炎和指出物种的潜在的生物活性化合物。

 相互竞争的利益

作者宣称没有利益冲突。

 确认

CNPq、巴西和Fapemig、巴西、承认金融支持与研究(丹尼尔·g . de Souza Fernao c·布拉加和毛罗·m·特谢拉)和本科(奥利维亚科雷亚)奖学金。作者承认斗篷,巴西为博士奖学金(芭芭拉·o·亨利克)。这项工作获得金融支持欧盟第七框架计划(fp7 - 2007 - 2013之下)赠款协议下健康- f4 - 2011 - 281608。

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