文摘

糖尿病是一个全球公共卫生问题。出于这个原因,ethanolic提取的野牡丹sp.从瓦哈卡州,墨西哥,选择寻找一个替代对抗这种疾病。的影响野牡丹sp. PPAR的mRNA的表达γ3 t3-l1细胞株,其影响α淀粉酶和α-葡糖苷酶,脂质积累在脂肪生成,在维洛细胞和细胞生存能力评估。PPAR的mRNA水平γ在增加折叠,脂质积累增加了29.55%野牡丹与罗格列酮sp.提取物和34.57%,α淀粉酶和α糖苷酶抑制IC₅₀值从μ克/毫升,μg / mL,分别;的集成电路₅₀在维洛细胞抗增殖活动μ克/毫升。在的情况下α淀粉酶和α糖苷酶化验,集成电路₅₀抑制浓度(50)是指需要提取大量抑制酶活性的50%。另一方面,抗增殖活动,集成电路₅₀(50)抑制浓度是指必要提取量抑制细胞增殖的50%。这是得出结论,认为当前的化合物野牡丹sp. ethanolic提取增加PPAR的mRNA的表达γ,抑制α淀粉酶和α葡糖苷酶,增加脂质积累。它构成了另一种糖尿病的辅助治疗;因此,我们建议继续确定化合物有前途的体内抗糖尿病的活动负责。

1。介绍

糖尿病是一种慢性代谢性疾病被认为是一个严重的全球公共卫生问题。2010年,大约有2.85亿人患有这种疾病,这个数字预计在未来20年内翻倍(1]。糖尿病2型(DM2)是最常见的糖尿病。它是一个复杂的代谢变化的特点是胰岛素结合阻力(IR、低灵敏度的一个或多个组织对胰岛素)和胰岛素分泌改变2]。

寻找新的药物对抗过氧物酶体proliferator-activated受体(PPARγγ)非常重要,因为这些转录因子表现出多种生物配体反应,如减少IR和避免高水平的血浆葡萄糖。它已经表明,脂肪生成过程是一个复杂的级联的控制下PPAR的转录调节因子γ和其他转录因子C / EBP家庭发挥根本性作用[3,4]。

酶α淀粉酶和α葡糖苷酶存在于唾液和小肠刷状缘,分别作用于水解低聚糖和二糖容易吸收葡萄糖等单糖。对于上述,延缓葡萄糖的吸收通过抑制酶水解碳水化合物,由α淀粉酶和α-葡糖苷酶,可能是另一种形式的打击DM (4]。

全球约80%的人口使用药用植物来治疗各种疾病。这些构成药物的主要来源;全球大约25%的处方药源自植物物种(5]。

一种流派野牡丹在墨西哥传统医学在墨西哥南部作为替代用于糖尿病的治疗。然而,这样的事实尚未被科学证实。野牡丹是一个属的1000种分布于热带美洲和野牡丹科属于家庭,166年约有4300个物种分布属。很少有生物活性的研究一直在进行这种类型,但它已经表明,提取并分离出化合物属的物种野牡丹有抗生素、抗肿瘤、镇痛和抗疟药活动。methanolic提取的植物化学的分析野牡丹cabucu揭示了存在糖基化的类黄酮(槲皮素、杨梅酮和山柰酚苷不同),丹宁酸,罕见的生物类黄酮。的植物化学的研究m . rubiginosa提取识别了几个糖基化的形式,如槲皮素,没食子酸、表儿茶素。同样,槲皮素、杨梅酮和儿茶素衍生品m . stenostachya被发现(6]。

2。材料和方法

2.1。准备的提取

野牡丹在墨西哥瓦哈卡的sp.地上部分收集。植物晒干后置于阴凉处在室温下与乙醇是由索氏提取法(PYREX) 48 h;溶剂被降低的压力下使用一个旋转蒸发器(大和re - 200)。提取收益率确定,然后储存在室温下直到使用。

2.2。细胞培养的准备和脂肪细胞的分化

鼠科动物细胞系3 t3-l1 preadipocytes。与10%胎牛血清的DMEM培养基补充(的边后卫)被用于传播;这是37°C 5%孵化有限公司₂大气,直到达到90%的融合。confluency 100%用于脂肪细胞的分化。可能是DMEM 10%的边后卫,1μM地塞米松、0.5毫米3-isobutyl-1-methylxanthine和10μg / mL胰岛素从圣克鲁斯生物技术(所有品牌)。经过48小时的潜伏期(第二天),分化培养基被移除和替换每48小时,直到成熟脂肪细胞(9 - 11天),与成熟脂肪细胞的媒介(DMEM的边后卫和胰岛素10 10%μg / mL称为毫米)。显微镜观察确认该成熟的脂肪细胞的典型形态(7- - - - - -10]。

2.3。PPAR的表达γ在脂肪细胞

细胞系的研究是进行3 t3-l1分化,上述方法后,使用微型板块6-well文化与100000细胞的培养液/在最后的2毫升与相应的培养基。在第十天,观察脂肪细胞的分化和在中(MM)所取代。添加了以下治疗:组1:DMEM和0.1%乙醇对照组(表达式),组2:与1毫米的补充μ米的罗格列酮(积极的控制)、组3:MM补充野牡丹sp.提取(40μg / mL)和组4:MM只观察媒介的影响。24小时后的治疗应用总RNA的提取的retrotranscription(互补)和PCR进行实时确定影响mRNA表达(8- - - - - -10]。

总RNA分离脂肪细胞进行治疗的总RNA提取工具包SV隔离系统# Z3100 Promega(遵循制造商的指令)和存储在−80°C到使用。总RNA正直、纯洁和量化分析与热科学NanoDrop 8000分光光度计和电泳凝胶(1.5%琼脂糖)。

完成了ImProm-II互补脱氧核糖核酸的合成™反转录系统工具包Promega # A3800 500 ng RNA孤立。互补脱氧核糖核酸是储存在−20°C,直到使用。

分析PPAR mRNA的表达γ是由中存在使用LightCycler 480 II罗氏公司设备,和50 ng cDNA, 0.5μ12.5 M的引物μL Maxima SYBR绿色qPCR大师混合(2 x) # K0251热科学、和nuclease-free适量的水,最后卷25μl . 36 b4 (Thomson)用作参考基因。使用的引物是PPAR的序列γ提出5′-CTGGCCTCCCTGATGAATAAAG-3′,反向5′-AGGCTCCATAAAGTCACCAAAG-3′, 36 b4向前5′-ACTGGTCTAGGACCCGAGAAG-3′,和反向5′-TCAATGGTGCCTCTGGAGATT-3′。相对mRNA表达的基础上计算方法。

2.4。在脂肪细胞脂质积累

脂质积累评价在细胞株3 t3-l1使用油红O,修改其他作者描述的方法。上述方法用于细胞分化。微量细胞培养板被使用在24井每口井的30000个细胞的培养液导致最终成交量为500μL培养基。融合后48 h(0)分化培养基(Dm)是用于刺激脂肪形成,补充物质评估:治疗1 (Dm(控制参考)),治疗2 (Dm配备40μg / mL提取野牡丹sp)和治疗3 (Dm配备1μ罗格列酮(积极控制)]。随后,微型板块培养48 h和成立条件。之后,Dm取代毫米(2天),孵化8 d。培养基被删除了,福尔马林10%用于1 h修复单层细胞。单层细胞后用蒸馏水洗两次,染料油红O在60%异丙醇(0.5%)是在室温下申请了15分钟。这些细胞被洗了三次蒸馏水;细胞内的染料被100%的异丙醇,读光学密度在540纳米9- - - - - -12]。

2.5。抑制活性的α淀粉酶

酶抑制二硝基水杨酸法评价了3,5 - (DNS)做了一些调整。的野牡丹sp.提取应用于不同浓度(25、50、75、100和125μg / mL)作为车辆使用磷酸盐缓冲剂和20毫米6.7毫米钠氯化钠,在pH值6.9。α淀粉酶酶(Sigma-Aldrich # a9857 - 250 - ku)是用于0.5 U /毫升浓度相同的缓冲车辆。淀粉0.5%,磷酸缓冲作为衬底。阿卡波糖在不同浓度(312.5、625、1250、2500和5000μg / mL)被用来作为一个积极的控制。此外,DNS解决方案是使用96毫米。在1.5毫升锥形管,50μL的物质被评估:治疗1:野牡丹sp.提取物、治疗2:磷酸缓冲与2%乙醇(负控制),和治疗3:阿卡波糖(积极的控制)。简单地说,上述治疗50μL的α淀粉酶添加和孵化37°C 10分钟。之后,开始反应,50μL添加底物是立即和孵化37°C,持续15分钟。然后,通过添加50反应停止μL的DNS和在95°C水浴加热5分钟;管是在室温下冷却,光密度测量在540海里。吸光度利率被用来计算每个治疗使用的抑制百分比以下方程: 在这个等式,“Abs待遇”是产品的光吸收的es反应的存在野牡丹sp.或消极的控制。“Abs控制”是es的反应产品的光吸收的磷酸缓冲的治疗。抑制使用百分比统计软件包(SPSS v.20)允许我们计算抑制浓度:50 (IC₅₀)是需要抑制50%的酶(Sigma-Aldrich # A8980-1G) (5,13- - - - - -15]。

2.6。α葡糖苷酶抑制活性

抑制这种酶被pNPG评估方法(对硝基苯-α-D-glucopyranoside)做了一些调整。野牡丹sp.提取物不同浓度(1、2、3、4和5μg / mL)被用作车辆磷酸钠上面提到的缓冲区。阿卡波糖在不同浓度(62.5、125、250、500和1000μg / mL)是积极的控制,使用磷酸缓冲钠作为车辆。α葡糖苷酶酶(Sigma-Aldrich # g5003 - 100联合国)的浓度0.2 U /毫升用磷酸盐缓冲车辆。此外,制备pNPG 2毫米(Sigma-Aldrich # N1377-1G)被用作基质在同一车辆。之后,在96年——微型板块,25岁μL物质的混合酶的测定:治疗1 (野牡丹sp.提取物)治疗2(与1%乙醇磷酸盐缓冲剂(负控制)],和治疗3(阿卡波糖(积极控制)]。除了上述治疗,25岁μL的酶暂停添加和孵化15分钟37°C;后,50μL pNPG添加和孵化为10分钟37°C;然后,通过添加50反应停止μL碳酸钠(0.2米)。

最后,在405纳米测量光密度。吸光度利率被用来计算每个治疗使用的抑制百分比以下方程: 在这个等式,“Abs待遇”是产品的光吸收的es反应的存在野牡丹sp,阿卡波糖或消极的控制。“Abs控制”是产品的光吸收的es反应的磷酸缓冲的治疗。禁忌使用百分比统计软件包(SPSS v.20)被用来确定抑制浓度50 (IC₅₀)治疗必要抑制酶的数量50%4,13- - - - - -15]。

2.7。细胞增殖实验

细胞增殖和MTT比色法(3 - (4 5-dimethylthiazol-2-y1) 2、溴化5-diphenyltetrazolium)评估。维洛细胞(猴肾上皮)行广泛应用于研究评估化学物质和毒素在哺乳动物的影响16]。1×10⁵细胞/被播种在96孔酶标和调整最终成交量为200μL培养基(DMEM补充10%的边后卫)和孵化37°C的氛围中5%的股份有限公司₂。24 h后,直到达到80%的层融合,细胞培养基被除去,用磷酸盐(PBS)洗净,缓冲盐溶液;进一步的物质被添加和评估:治疗1(提取野牡丹sp。(62.5、125、250、500和1000μ2 g / mL)、治疗(与1%乙醇(负控制)DMEM),和治疗3(细胞培养基(参考扩散)]。之后,微型板块是孵化24小时在上述条件。然后,10μL MTT(5毫克/毫升)被添加到每个又孵化4 h;培养基被除去,细胞被洗PBS。200年之后,立即μL二甲亚砜(DMSO)添加;然后在570纳米光密度测定。由以下公式确定细胞增殖的百分比: 在这个等式,“Abs待遇”是细胞治疗产品的光吸收和“Abs控制”是产品的光吸收的细胞作为扩散参考。的集成电路₅₀计算与细胞增殖的百分比和SPSS v的支持。20 [17,18]。

3所示。结果

在这项研究中,不同的ethanolic提取物的生物活性野牡丹sp.评价他们对mRNA PPAR的表达的影响γ、脂质积累在脂肪生成的活动α淀粉酶和α葡糖苷酶,影响维罗细胞系的增殖。

在确定PPAR的mRNA的表达水平γ在成熟的老鼠脂肪细胞,组1作为一个表达式控制、归一化值为1。因此,上面的值1表示一个过度或upregulation。在两组中的值表达水平褶皱变化;与此同时,在3组值最后组4显示的值褶皱变化(图1)。

野牡丹sp。40μg / mL产生upregulation PPAR的mRNA的表达γ的值大于药物罗格列酮,从而增加PPAR的表达γ像预期的那样。成熟与提取介质的使用罗格列酮本身不会增加PPAR的基因的表达水平γ。

在脂质积累测试在脂肪生成不同的治疗方法,组1 (Dm)显示,吸光度的0.137;这个值代表积累的脂质在脂肪生成诱导分化培养基已经建立。与此同时,组2 (Dm +野牡丹sp。40μg / mL)显示,吸光度的0.184;组3 (Dm +罗格列酮1μ米)显示一个吸光度值为0.177。

以吸光度值从第1组为100%,脂质积累,当提取野牡丹sp.添加到分化培养基,脂质积累是组1增加到34.57%。就像野牡丹sp.提取,添加药物罗格列酮分化培养基,它会导致组1相比增长了29.55%。药物的提取和吸光度的增加显著与Dm相比;野牡丹罗格列酮sp.提出了一个非常类似的结果,它们之间的差异不是(图具有重要意义2)。

在α淀粉酶抑制试验,不同治疗方法添加了es的混合反应,获得以下结果:治疗1野牡丹sp.提出集成电路₅₀的μ克/毫升。同时,治疗2、磷酸盐缓冲剂和2%乙醇(负控制)没有显示出抑制由车辆使用;治疗3:阿卡波糖IC₅₀的μ克/毫升(积极的控制)。

结果显示,尽管是一个完整的提取,提取的野牡丹sp.揭示了一个更大的容量比阿卡波糖抑制酶活性的50%;这两者之间的区别治疗显著(表1)。

的抑制试验α葡糖苷酶,以下结果:治疗1野牡丹sp.提取提供集成电路₅₀的μ克/毫升。同时,治疗2、磷酸盐缓冲剂和1%乙醇(负控制)并没有显示任何酶的抑制作用;治疗3、阿卡波糖(积极控制)显示集成电路₅₀的μ克/毫升(表1)。

野牡丹sp.提取也有更大的抑制作用比阿卡波糖和阿卡波糖是作为参考化合物抑制这些酶。治疗是具有统计学意义的差异。

在确定维罗细胞株的增殖,IC₅₀的毫克/毫升认为有毒了野牡丹sp.提取。

4所示。讨论

PPARγ核受体是充当一个转录因子;能提高细胞和胰岛素敏感性的提高葡萄糖利用率(19]。一组不同的天然和合成分子为配体,可以诱导激活,PPAR的表情γ。这些配体包括营养、内源性配体和药物(20.];这些药物之一是thiazolidinediones噻唑烷二酮类),如罗格列酮。野牡丹sp. PPAR的mRNA表达增加γ,甚至比罗格列酮。此外,野牡丹sp.能够增加脂质积累在脂肪生成3 t3细胞株l - 1类似的积极控制罗格列酮。众所周知,PPARγ是主调节器的脂肪细胞的分化,在脂肪生成PPAR吗γ是诱导21]。PPARγ激活脂肪细胞确保适当的平衡和发病的分泌,如瘦素和脂联素;介质在胰岛素作用在外围组织,导致全身胰岛素敏感性(22]。上述产品刺激PPAR的生产γ候选人诱发胰岛素的正常运转和认可,考虑他们作为潜在的抗糖尿病的药物。

结果表明,次生代谢产物的存在可能参与upregulation PPAR的γ将军槲皮素、儿茶素和山柰酚在一些物种已报告野牡丹sp.和PPAR的这些化合物可以作为配体γ(6,21]正如罗格列酮。一些服用tzd罗格列酮显著增加的心血管疾病。由于这个原因,在美国食品及药物管理局限制他们的处方(23]。

避免餐后葡萄糖是重要的增加糖尿病患者的血糖水平低。的抑制作用α淀粉酶和α葡糖苷酶存在于胃肠道可以降低血糖的水平。药物抑制这些酶,如阿卡波糖、miglitol, voglibose, nojirimycin, 1-deoxynojirimycin,允许缓慢吸收的碳水化合物(23]。ethanolic提取的野牡丹sp.抑制α淀粉酶50%浓度低于阿卡波糖药物。此外,α葡糖苷酶抑制了野牡丹sp.在低浓度,低于药物。因此,相信与降糖药效应分子的存在在体外模型中,这些化合物可以替代现有的治疗或辅助,这可能不受欢迎的副作用。

野牡丹sp.显示细胞毒性的浓度超过必要增加PPAR的表达式γ,增加脂质积累,抑制α葡糖苷酶和α淀粉酶。有报道称,属的物种野牡丹,m . stenostachya,m . cabucu,m .白色的,m . rubiginosa缺乏细胞毒性和诱变在低浓度的100μ克/毫升(6]。

5。结论

ethanolic提取的野牡丹sp.显示增加的PPAR的mRNA表达的水平γ在更高层面上比罗格列酮(药物)。同时,野牡丹sp.显示抑制的酶α葡糖苷酶和α淀粉酶与集成电路₅₀低于阿卡波糖(药物),此外在脂肪生成增加脂质积累的能力,类似于药物罗格列酮。与此同时,野牡丹sp.显示细胞毒性在维洛细胞浓度高于生物活性。由于这个原因,这些化合物ethanolic中提取的野牡丹sp.可以替代治疗糖尿病或像一个辅助,继续推荐的体内生物活性化合物的测试和说明。

相互竞争的利益

作者宣称没有利益冲突有关的出版。