超微结构改变与死亡婴儿利什曼原虫Promastigotes引起的Morinda citrifolia林恩。水果(诺妮)果汁治疗

摘要

由于在流行地区出现高频率的耐药、副作用和与艾滋病毒合并感染引起的并发症，对防治利什曼病新疗法的探索有所增加。Morinda citrifolia林恩，俗称诺丽，具有丰富的化学成分，文献中描述了各种治疗效果。研究表明，林恩具有利什曼原虫活性m . citrifolia；然而，它对寄生虫的作用尚未阐明。在这项工作中，我们分析了利什曼菌的活性和超微结构的变化婴儿利什曼原虫前鞭毛体m . citrifolia果汁的治疗。m . citrifolia果实提取物得率为6.31%，高效液相色谱法鉴定出主要成分为酚类和芳香类化合物。集成电路₅₀值是260.5µg/mLµ细胞内无鞭毛细胞g/mLL. Infantum.处理m . citrifolia．用J774进行细胞毒性试验。G8巨噬细胞显示m . citrifolia果汁在2毫克/毫升以下无毒。透射电镜显示胞浆空泡化，脂质包涵，胞吐活性增加，自噬小泡样L. Infantum.promastigotes处理m . citrifolia果汁。m . citrifolia果汁对L. Infantum.在在体外在治疗利什曼病方面有潜在的应用前景。

1.导言

由于巴西幅员辽阔，其领土的许多部分难以进入。因此，公共卫生资源有限，这些偏远地区的居民往往得不到必要的政府卫生福利。这种地理隔离有助于加强当地传统医疗做法和其他自然资源，以治疗疾病，包括利什曼病等寄生虫病[1]．

利什曼病是由原生动物寄生虫通过受感染的雌性沙蝇叮咬传播而引起的Phlebotomus或Lutzomyia）.这种疾病有三种临床形式:内脏形式，也称为黑热病，如果不治疗，通常在2年内致命;皮肤形式，引起皮肤溃疡;粘膜皮肤型，侵入上呼吸道粘膜，破坏鼻、口、喉的软组织，造成严重损伤[2]．这种疾病在五大洲的98个国家和3个地区流行，每年大约有130万新病例，其中30万是内脏病例，100万是皮肤或粘膜皮肤病例。这些数字表明了这种疾病对公共卫生的重要性，包括巴西[3.]．

利什曼病的治疗是由维安娜在1912年首次提出的。锑的有机化合物是治疗该病的首选药物，两性霉素B最近被介绍。这两种治疗方法都有一些副作用，都是高度毒性的，而且成本也很高，这促使人们寻找新的替代方法。寻找一种低毒高效的利什曼杀菌剂是一项挑战，涉及世界各地的几个研究小组[4]．草药疗法作为获得具有治疗作用的新化合物的潜在来源，在这一领域受到了广泛的关注。

Morinda citrifolia林恩是一种原产于东南亚的小植物，俗称诺丽，是这些国家最重要的传统药物来源之一。由于与这种植物相关的各种民族药理学活动，它现在在世界各地种植，包括巴西。研究表明诺丽在治疗中的功效疼痛和炎症反应[5]及抗肿瘤活性[6]．抗细菌活性[7]和真菌[8也被观察到。最近,在体外巴洛酮和巴洛酮的活性m . citrifolia描述了对l .主要．此外，还进行了一项临床研究，以确定外用软膏的疗效m . citrifolia对皮肤利什曼病的茎提取物，50%的患者有很好的反应，在评估的40例患者中有30%有很好的改善[9].因此，为了证明m . citrifolia针对promastigotes利什曼虫并评估这种治疗引起的超微结构改变，本研究评估了前鞭毛的形式婴儿利什曼原虫处理m . citrifolia果汁的电子显微镜。

2.材料和方法

2.1.植物材料

m . citrifolia2011年11月，在海拔24 m的巴西合法亚马逊地区São Luís (S2°31 W44°16)，Maranhão采集了果实。当外果皮呈半透明时采集果实。该植物材料由Ana Maria Maciel Leite鉴定，编号2000346的代用样品保存在Herbário教授Rosa Mochel, Universidade Estadual do Maranhão。在实验室中，用蒸馏水和无菌水清洗水果，在25°C下干燥，放在无菌玻璃瓶中3天，沥干释放的提取物。该液体以4000转/分离心两次，离心15分钟;上清冻干保存于−20℃[8]．的冻干m . citrifolia将果汁溶于DMSO中，并在培养基中按不同浓度稀释后立即使用。培养基中DMSO浓度不超过1%。

２.２.高效液相色谱-二极管阵列和蒸发光散射检测器(HPLC-DAD-ELSD)

HPLC色谱分析m . citrifolia果汁是在岛津LC-10Avp上进行的，岛津LC-10Avp配有两个LC-8Avp泵，由CBM-10A接口模块、带两个检测器的自动注射器、二极管阵列检测器SPD-M10A（DAD）和蒸发光散射检测器（ELSD）控制漂移管温度设置为40°C，使用氮气作为雾化器气体，增益为4.0。使用HPLC级溶剂和Milli-Q水，并在反相LiChrospher C18柱（4.6）上进行分析 毫米×250 嗯,五 μm，waters）。流动相是水（a）和甲醇（b），具有以下梯度组成：（0-20分钟）5-20％（b），（20-30分钟）20％-35％（b），和（30-35分钟）35％（b）。紫外线图在365nm处获得。样品注射体积为10 µL.在分析过程中使用1 mL/min的恒定流量。分析前，将提取物5.0 mg溶于1.0 mL milliq水中，离心。

２.３.寄生虫

前鞭毛体L. Infantum.(MCAN/BR/2008/1112)在26°C条件下，在施耐德昆虫培养基(Sigma-USA)中添加10%胎牛血清(Gibco-USA)、100 U/mL青霉素(Gibco-USA)和100µ链霉素的g / mL。所使用的培养物最多有10个在体外段落。

２.４.动物

雌性4-6岁BALB/c小鼠购自Centro de Criação de Animais de Laboratório do Instituto Oswaldo Cruz，里约热内卢de Janeiro，并保持在无病原体条件下。这些动物是按照Colégio Brasileiro de Experimentação Animal动物实验指南处理的。当地动物护理和利用伦理委员会批准了所有涉及动物的程序(CEUA FIOCRUZ-LW72/12)。

2．5．细胞培养

巨噬细胞J774。G8细胞株在添加10%胎牛血清的RPMI 1640培养基(Sigma，美国)中培养，青霉素(100 U/mL)和(100µg/mL)链霉素，在37°C和5% CO下₂．雌性BALB/c小鼠接种3 mL 3%硫代乙醇酸钠，72小时后用PBS溶液捕获腹腔巨噬细胞。收获的细胞以4000 rpm离心，细胞悬浮在RPMI培养基中，并在37°C和5% CO下培养₂．

2.6。活动对原鞭毛状体

前鞭毛体L. Infantum.（10⁶将2 - 4日龄的疟原虫/mL)置于96孔板中，不同浓度的m . citrifolia果汁(960 - 30µg/mL)，最终体积为200µL /井，72小时。无寄生虫井作为空白井，只有寄生虫井作为对照。处理后，采用改良的四唑染料(MTT)比色法评价寄生虫的生存能力[10]．每孔加入体积为10%的MTT (5mg /mL)。2小时后，4000rpm离心;然后从每孔和100孔中取上清液µ加入L的DMSO溶解甲醛。在540 nm波长处用分光光度计分析吸光度。数据按公式归一化

计算结果用于IC计算₅₀（50％抑制寄生虫生长）。两性霉素B用作参考药物。

2.7.抗细胞内无鞭毛体的活性

腹膜巨噬细胞在24孔板中培养（10⁵细胞/孔)，有盖，在37°C和5% CO₂．细胞被原鞭毛原虫感染L. Infantum.使用10：1寄生虫/细胞的比例，2小时后，用PBS洗涤细胞三次，以除去自由寄生虫。用不同浓度处理感染的细胞m . citrifolia果汁(480 - 30μg/mL)，保存24小时。感染细胞和处理细胞的盖玻片用Bouin固定，Giemsa染色，光镜观察。计算抑菌率和抑菌浓度₅₀用GraphPad Prism软件计算。以两性霉素为参比药物。

2.8.细胞毒性试验

J774.G8macrophages were cultured in 96-well plates (5 × 10⁵ 不同浓度的m . citrifolia果汁(2000 - 1.8µg/mL)至最终体积200µ在37°C和5%CO条件下，每口井L₂．没有细胞的孔作为空白，只有细胞的孔作为对照。24小时后，细胞在4℃下用10%三氯乙酸固定1小时，用0.4% Sulforhodamine B (Sigma, USA)溶液在1%乙酸中染色30分钟，然后用1%乙酸溶液洗涤。硫代霍达明B溶于200µ在540 nm波长下用分光光度计读取平板[11]．数据按照前面描述的公式归一化。结果用于计算50%的细胞细胞毒性(CC₅₀)与GraphPad Prism。

2.9。透射电子显微镜法

前鞭毛体L. Infantum.被处理m . citrifolia果汁浓度分别为480、240、120、60和30µg/mL, 24小时。用2.5%戊二醛(Sigma，美国)将寄生虫固定在0.1 M钠-卡可迪酸缓冲液中，pH 7.2过夜。用0.1 M卡可迪酸钠缓冲液洗涤3次，后固定在含有1%四氧化锇、0.8%亚铁氰化物和5mm氯化钙的溶液中，0.1 M卡可迪酸钠缓冲液洗涤，分级丙酮脱水，嵌入环氧树脂中。超薄切片用醋酸铀酰和柠檬酸铅染色，透射电子显微镜JEM-1011(日本JEOL)观察。

2.10。统计分析

数值用均数±标准差表示。采用方差分析(ANOVA)对结果进行统计分析，然后采用Tukey检验。采用GraphPad Prism 5.0.4软件进行分析。当．

3.结果与讨论

的m . citrifolia果汁是棕色，半透明和中等粘度，其特征气味和pH 3.94。冻干后，果汁产生6.31％的高吸湿粉末。组成部分m . citrifolia用HPLC-DAD-ELSD对果汁进行分析，两种检测器的色谱图分析均显示出与化合物相关的峰，紫外区敏感性高。LC-DAD和LC-ELSD色谱图如图所示1．紫外-365 nm色谱的主峰与黄酮(峰8)和蒽醌(峰11)的特征紫外光谱有关。ELSD指纹图谱在3.2 min出现一个较强的峰，在DAD色谱中未见此峰。这个信号可能与之前报道的多糖有关m . citrifolia具有显著的抗肿瘤活性[12]．多糖的紫锥菊紫竹显示活动对利什曼虫enriettii［13]这些物质在植物化学指纹图中的存在表明了水果提取物对原生动物的潜在化学作用利什曼虫属。这种潜力通过在体外利什摩尼教活动m . citrifolia果汁对L. Infantum.．

的影响m . citrifolia果汁的前鞭毛形式L. Infantum.监测了72小时m . citrifolia果汁对疟原虫的增殖有剂量依赖性的抑制作用(图)2(一个))，当浓度为260.5时，原鞭毛体的生长抑制率为50%µ克/毫升(表1）.与其他水果提取物相比，其价值被认为是有前途的。水果的粗提取物苦瓜显示一个集成电路₅₀600岁以下µ克/毫升多诺瓦尼promastigotes [14]．

有关的数据很少在体外leishmanicidal活动m . citrifolia文献中的成分m . citrifolia结果表明，从茎提取物中分离得到的两种蒽醌类化合物，morindicone和morinthone [9].蒽醌类化合物也从中分离出来m .最亮的星，一种与之性别相同的植物m . citrifolia并表现出对生长不利的活动恶性疟原虫和promastigotesL. major体外培养［15]．

试图找到导致在体外leishmanicidal活动,m . citrifolia果汁被提交到一个列分区，有趣的是，分区显示为IC₅₀值高于为完整果汁获得的值(未显示数据)。这一结果表明，不同的物质存在于m . citrifolia果汁有助于利什曼的活性，可能是协同的，证实了以前的研究，其中超过一个分子表现出生物活性[16，17]．

虽然利什摩尼教活动在体外对原鞭毛虫的治疗被许多研究人员用作寻找治疗利什曼病新药的筛选试验，单凭该试验的阳性结果不能被认为是潜在药物作用的指标。对细胞内无鞭毛体的活动是必要的，也许是最有效的联系在体外物质的活性及其可能的有效性在活的有机体内．因此我们也评估了m . citrifolia活性对抗细胞内无鞭毛体(图2 (b)）.

如表所示1的活动增加m . citrifolia果汁对胞内无鞭毛体的抑制活性与对原鞭毛体的抑制活性比较。的集成电路₅₀细胞内无鞭毛体的值降低，为201.3µ克/毫升。光镜下，巨噬细胞显示空泡，细胞内无鞭毛体可能残留(图)3.）.这个结果表明可能的行动m . citrifolia果汁对巨噬细胞的激活和调节作用，如在之前的工作中已经显示的，如IL-4的产生减少，TNF-的产生增加α, il - 1β［12),正无穷,γ，和NO [18]．

确保m . citrifolia果汁仅作用于细胞内无鞭毛体，对寄主细胞不造成损害，细胞毒性在J774。采用硫代霍丹明B法检测G8系巨噬细胞(图)2(一个)）.这种比色法是基于总蛋白的定量，通过结合阴离子磺胺B静电晶体与细胞蛋白。在分析的浓度和选择性指标中未观察到细胞毒性m . citrifolia果汁比两性霉素B至少高3.3倍（表1）1）.

巨噬细胞评估毒性在体外作为感染的目标细胞利什曼虫．巨噬细胞J774的细胞毒性分析。G8表现为低细胞毒性m . citrifolia果汁。当与IC一起分析时，这些数据变得更加相关₅₀至细胞内无鞭毛体形态，产生SI高于9.9，符合日本全球健康创新技术(japan Global Health Innovative Technology)的传染性疾病新化合物SI的通用命中选择标准[19]。事实上，由于通用hit标准必须应用于植物治疗，但有一定保留，因此选择指数是评估提取物、精油或其他天然产品安全性的最可靠标准。此外m . citrifolia在后路研究中，除了免疫调节作用和毒性外，还必须进行分析。

透射电镜分析L. Infantum.原鞭毛被处理m . citrifolia果汁被用来测定超微结构的变化。前鞭毛体的显微照片（图4，5，6,7)显示24小时后的损伤程度。未经处理的寄生虫形态正常(图)4(一)）.

的观察L. Infantum.Promastigotes用30分治疗 µg/mL的果汁显示细胞质空泡化，一些细胞质内有电子密集区，这在较高浓度下变得更明显（图1）4 (b)和4 (c)）.类似的结构变化也在l . amazonensis用精油处理[20.]。在这些情况下，由于精油中的化合物增加了膜的渗透性，液泡通过简单的扩散与物质的进入有关。

用30和60处理后，鞭毛囊内有小泡µ克/毫升m . citrifolia果汁（数字4 (d)，5 (b),5 (c))鞭毛囊泡的存在表明鞭毛囊区有强烈的外显细胞活动。这些变化也在前鞭毛体中报道过l . amazonensis用麦角甾醇合成抑制剂处理，如22,26-氮杂甾醇[21]．胞外鞭毛囊区域的活动增加可能是脂质分泌异常的结果，脂质分泌是药物作用的结果，或表明细胞为了生存而加剧了蛋白质的产生[22]．

在30、60、120和240处理下观察到细胞质的膜结构µ克/毫升m . citrifolia果汁（数字4 (b)- - - - - -4 (d)，5(一个)，6(一)和6 (b)）.这些结构是分散在细胞质中的内质网膜，可能参与了异常细胞器的循环。自噬小体样囊泡物质在240µ克/毫升m . citrifolia果汁显示自噬过程(图6 (c)和6 (d))，表明在治疗过程中细胞器发生了不可逆转的损伤。自噬可以作为一种保护机制，通过循环利用大分子和移除受损的细胞器，但过度自噬会导致细胞死亡[23]．试图在由m . citrifolia果汁处理后，寄生虫可能会发生反应，触发自噬事件，而这种加剧的自噬反应可能导致死亡，正如480处理后的寄生虫所观察到的那样µg/mL果汁。

480的处理µ克/毫升m . citrifolia饮用果汁24小时可导致严重的细胞损伤(图)7(一)和7 (b))随着细胞质内容物外渗和细胞完整性丧失。超微结构变化的进展与药物浓度的增加有关，在药物浓度较高时，随着寄生虫的破坏达到顶点，并显示出m . citrifolia果汁对寄生虫的作用及其剂量依赖性作用。细胞核、线粒体、鞭毛、动质和膜下微管未见明显变化。

4.结论

m . citrifolia果汁显示利什曼原虫活性L. Infantum.原鞭毛体，引起超微结构变化，如细胞质空泡化、脂质包涵、胞吐活性增加、自噬小体样囊泡、细胞完整性丧失和寄生虫死亡。考虑到对原鞭毛形态的活动和观察到的改变L. Infantum.，必须进行进一步的研究，以评估m . citrifolia果汁治疗利什曼病。

披露

Ana Lúcia Abreu Silva（CNPq编号306218/2010-0）是高级研究员。

利益争夺

作者称没有利益冲突。

作者的贡献

Kátia da Silva Calabrese和Ana Lúcia abru -Silva对这项工作做出了同样的贡献。

致谢

本文得到了FAPEMA (APP-00844/09)、CNPq(407831/2012.6)和IOC的支持。

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