文摘

本研究的主要目的是调查从葛根总异黄酮的保护作用(PTIF)在糖尿病大鼠。糖尿病是由高脂饮食诱导和腹腔内注射小剂量链脲霉素(STZ);40毫克/公斤)。在26周开始,PTIF 421毫克/公斤是管理老鼠每天一次连续10周。代谢分析变化分析Ultraperformance液体Chromatography-Quadrupole-Exactive Orbitrap-Mass谱(UPLC-Q-Exactive Orbitrap-MS)。主成分判别分析(PCA-DA)偏最小二乘判别分析(PLS-DA)和正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)是用于多变量分析。此外,血清中游离氨基酸测定高效液相色谱法和荧光检测器(HPLC-FLD)。此外,氧化应激和炎症细胞因子进行评估。十一个潜在代谢物生物标志物,这主要与凝血、脂质代谢、氨基酸代谢、已确定。PCA-DA分数情节表明生化变化在糖尿病大鼠PTIF管理后逐渐恢复正常。 Furthermore, the levels of BCAAs, glutamate, arginine, and tyrosine were significantly increased in diabetic rats. Treatment with PTIF could regulate the disturbed amino acid metabolism. Consequently, PTIF has great therapeutic potential in the treatment of DM by improving metabolism disorders and inhibiting oxidative damage.

1。介绍

糖尿病(DM),一个典型的复杂的代谢性疾病的特点是胰岛素缺乏或胰岛素抵抗,可引起一系列的并发症,如肾病、心血管疾病和糖尿病性视网膜病变。糖尿病被称为“小可”在中医疾病。草药药物发挥特别重要的作用在治疗糖尿病几千年来和他们的治疗机制已逐渐认识到现在1]。例如,isoflavones-containing草药、商用作为膳食补充剂,也对心血管和糖尿病治疗[报道有很多好处2,3]。同时,积累临床证据显示,中医与西医的结合使用可以很大程度上减少糖尿病并发症的发生4]。

Puerariae基数,干的根源葛根(Willd)。Ohwi,也被称为对战和野葛。异黄酮的重要来源,包括葛根素、黄豆苷,精制,大豆苷、染料木素(图1),这被认为是主要的生物活性成分(5]。对战已经广泛应用在传统的中国古典糖尿病治疗处方,如对战Qinlian汤、黄芪Gengen汤,和玉泉湾。新兴的证据也表明,提取Puerariae基数可以提高抗氧化防御系统通过减少辅酶你校的血浆水平和MDA (6]。葛根素在糖尿病治疗方面显示了很大的潜力,不仅保护胰岛细胞氧化应激通过激活抗氧化酶(7),但也大大改善糖尿病小鼠的胰岛素反应时作为辅助用于代谢性疾病(8]。然而,确切的葛根异黄酮提取物对糖尿病的治疗机制尚未解释道。

代谢组学可以提供一个系统的概述在疾病过程和药物干预的影响,这与中医的整体理论[重合9]。最近,代谢组学已经越来越多地应用于诊断和评估糖尿病及其并发症的治疗效果10,11]。例如,12个生物标记被确定使用代谢组学在KKay老鼠,和水溶性提取物用麦冬对糖尿病(潜在的活动12]。代谢组学最近的一项研究表明,20 (S)人参皂苷Rg3,的活性成分人参可能参与调节核酸代谢,能量代谢、肠道菌群代谢在2型糖尿病13]。另一个著名的自然产物,小檗碱,通过表达下调可能发挥关键作用的高游离脂肪酸的代谢组学研究显示2型糖尿病治疗(14]。综上所述,这些研究公布,糖尿病疾病有直接关系,在脂质紊乱,脂肪酸和能量代谢。此外,作为一种代谢物,氨基酸尤其是支链氨基酸(BCAAs)与糖尿病及其并发症密切相关(15),可以预示着糖尿病的发展(16]。

在糖尿病及其并发症的发展,氧化应激或失衡prooxidants和抗氧化剂通常被认为参与(17]。氧化应激反映了不平衡活性氧(ROS)和抗氧化剂,和高水平的这可能会导致严重的细胞功能障碍包括膜脂质过氧化作用,DNA碎片,和蛋白质损伤(18]。氧化损伤机制,许多研究已经确定了过氧化物的生产过剩导致炎性细胞因子基因表达高,如肿瘤坏死因子-(肿瘤坏死因子-)和血管内皮生长因子(VEGF) [19]。此外,炎症可能导致胰腺细胞功能障碍,胰岛素抵抗的形成,等等20.,21]。事实上,一些实验和临床研究强烈建议,基于抗氧化和抗炎治疗在糖尿病及其并发症治疗有效(22,23]。

考虑到DM与代谢紊乱有关,先进的氧化应激,慢性炎症,我们评估Puerariae基数在糖尿病大鼠模型的治疗效果由高脂肪饮食和低剂量链脲霉素和探讨了代谢组学概要文件使用Ultraperformance液体Chromatography-Quadrupole-Exactive Orbitrap-Mass谱和液相色谱荧光检测器。

2。材料和方法

2.1。化学药品和试剂

葛根素的批号110752 - 200912年从NICPBP购买(中国)。黄豆苷(必须- 15031507),大豆苷(必须- 1505 - 1511),精制(必须- 14110908),和染料木黄酮(必须- 15021802)从成都必须购买生物技术有限公司有限公司(中国成都)。STZ的批号SLBB7526V得到从西格玛化工有限公司(圣路易斯,密苏里州,美国)。水用于本研究由ULUP超纯水系统(Ulupure,成都,中国)。甲醇和乙腈与HPLC-grade购自热费希尔科学公司(爱荷华州,美国)。

2.2。动物和实验设计

健康成年男性Sprague-Dawley老鼠重()g购买DaShuo动物繁殖中心的生物技术有限公司有限公司(中国成都)。所有的老鼠都保持在一个交变12 h光/暗周期,在一个温度22 - 25°C,湿度55% - -60%。本研究在中国进行国家中医药管理局,成都中医药大学(中药药理学P3实验室,TCM2032043数量)。实验过程是严格按照指南的护理和使用实验动物。动物协议是动物伦理委员会批准的成都中医药大学。老鼠被分为正常组和高脂饮食组。正常组是用标准的饮食。高脂饮食组和高脂肪饮食喂养6周,然后腹腔内注射单剂量链脲霉素的刚做好的解决方案(40毫克/公斤柠檬柠檬酸acid-sodium缓冲区,pH值4.2)(24,25]。正常老鼠收到柠檬acid-sodium柠檬酸缓冲。注射STZ后,所有老鼠与标准的饮食。动物血糖水平≥16.7更易/ L 72 h后STZ管理被认为是糖尿病的老鼠。糖尿病大鼠随机分为两组:糖尿病组和糖尿病+ PTIF组。在26周开始,PTIF管理来治疗大鼠胃内的强饲法(专营)的剂量421毫克/公斤。正常的老鼠和未经治疗的糖尿病大鼠收到蒸馏水以同样的方式。PTIF治疗进行每天一次连续10周。所有的动物都被允许自由吃喝。在实验结束时,血浆/血清样本的每一个被孤立在3500转离心10分钟在4°C。 The samples were immediately stored at −20°C until the measurement of oxidative stress and inflammatory cytokines and at −80°C until the metabolomics and amino acid analysis were performed.

2.3。制备PTIF

PTIF提供太极集团重庆涪陵制药厂有限公司(中国)。葛根异黄酮提取:国内外葛根粉中提取了10倍或8倍量的60%乙醇1 h,分别。溶剂是减少压力中恢复过来。采用大孔树脂纯化的集中提取的解决方案。葛根异黄酮提取是获得与真空浓缩、减压干燥,最后通过一个100 -孔筛。

2.4。PTIF标准化

高性能液相色谱法建立了识别的主要化合物PTIF(安捷伦1260液相色谱系统,安捷伦、钙、美国)。一个Capcell PAK C-18分析柱(100毫米×2.0毫米,3μm, Shisedo,日本)是用于列温度保持在35°C。甲酸0.1%的水和0.1%的甲酸乙腈被视为移动阶段A和B,分别。流动相梯度洗脱程序如下:90%(0.01−12分钟),90%(12.1−20分钟)−80%,75%和80%−−20.1(30分钟)。流量被设定为0.5毫升/分钟,和进样体积被设定为50μl

2.5。氧化应激和炎症细胞因子的测量

超氧化物歧化酶(SOD₁)和缺氧诱导因子1α(HIF-1水平α)夹心酶免疫分析法测定的方法使用工具从Uscn生命科学公司(武汉,中国)。血浆丙二醛(MDA)是衡量竞争性抑制酶免疫测定技术使用工具从Uscn生命科学公司(武汉,中国)。血清血管内皮生长因子(VEGF)和细胞间粘附分子1 (ICAM-1)是衡量一个夹心酶免疫测定技术从研发系统,使用一个工具有限公司(美国)。血清中一氧化氮(NO)浓度的量化是基于硝酸盐亚硝酸盐,硝酸盐还原酶的酶转换从研发系统,使用Nitrotyrosine-EIA工具有限公司(美国)。所有的数据都是由Varioskan多功能全波长酶标读者(热费希尔科学、美国)根据制造商。

2.6。UPLC-Q-Exactive Orbitrap-MS分析

血浆样品被重组前室温分析。然后,400年μL乙腈是添加到100年μL样本的蛋白质沉淀。混合物是涡3分钟然后在12000转离心10分钟在4°C。最后,上层清液被转移到一个autosampler瓶进行进一步的决心。

所有的LC / MS数据都使用Dionex收购™Chromeleon™6.8和热Xcalibur软件。血浆样品进行C18柱(Acquity UPLC本·C18, 2.1毫米×100毫米,1.7μ米,水域,美国)。甲酸0.1%的水和0.1%的甲酸乙腈被视为移动阶段A和B,分别。0.4毫升/分钟的流量35°C是用于线性梯度如下:95 - 90%(0 - 3分钟),90 - 85%(3 - 6分钟),85 - 60%(6 20分钟),60 - 35%(20 - 25分钟),35 - 5%(25 - 30分钟),5%(30分钟)。标准的正离子模式下选择下列条件:全扫描范围,80年到1200年;扫描分辨率,7000;鞘气体流速,30任意单位;辅助气体流速,10个任意单位;喷涂电压、3.5 KV;毛细管温度、350°C;辅助气体温度、200°C。背景离子445.12503(+)被用来锁质量,确保质量校准精度。样品体积的5μL是用于注射。

2.7。识别潜在的生物标记物

原始数据获得的X女士石中剑我出口到MZ 2.14.2使用热女士文件阅读器程序。我主要MZ参数设置如下:质量检测器是确切的质量在噪声水平强度;分钟时间跨度为0.1分钟公差5.0 ppm;色谱反褶积使用基线截止算法和最小峰高5;同位素峰石斑鱼使用最低代表同位素和设置最大充电1。每个样本数据归一化总面积为女士正确响应转变之前,多变量分析。通过搜索获得的信息的潜在生物标志物KEGG数据库,Lipidmaps, Metlin基于准确的分子量和同位素的形状。

2.8。氨基酸分析

自由氨基酸由HPLC-FLD法测定血清样本使用AccQ·标签precolumn衍生化技术与水域AccQ·标记化学包(美国海域化工有限公司)。70年μL硼酸萃取剂添加到10μL血清,然后20μL AccQ-Flour衍生试剂添加到混合物。孵化后10分钟55°C,上层清液的收集分析。氨基酸的浓度与高效液相色谱法测定使用一种氨基酸分析列(3.9毫米×150毫米,4μ米,水域,美国)和流动相组成的(a)水含有10% AccQ·标签洗脱液包含40%的乙腈和水(B) 1毫升/分钟的流量在37°C的激发波长的发射波长250 nm和395 nm。流动相梯度洗脱程序如下:5 - 98%(0 - 0.5分钟),98 - 93%(-15 - 0.5分钟),93 - 90%(15 - 19分钟),90 - 67%(19-32分钟),67% (32-33 min), 67 - 0%(33-34分钟),0% (34-37 min), 0 - 100%(37-38分钟)和100%(38 - 64分钟)。进样体积被设定为10μl

2.9。数据分析

数据分析使用R版本3.1.2 (R核心团队;2014 R:语言和环境统计计算;R统计计算的基础,维也纳,奥地利;URL:https://www.r-project.org/),PCA-DA, PLS-DA, OPLS-DA包热带化脓性肌炎(代谢组学单变量和多变量分析,版本1.4;Edoardo G,弗朗西斯卡C, Dimitrios年代,西尔维亚M,安德里亚,和Michela G, 2012)。1.4 R包版本。https://cran.r-project.org/web/packages/muma/index.htmlR)是用于多变量分析。所有结果均值±SD。单向方差分析(方差分析)是用于意义分析。的值被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。PTIF标准化

一个典型的高效液相色谱指纹图谱PTIF如图2。五个主要组件是由一个高效液相色谱方法。他们分开,保留时间是5.8,11.7,18.2,23.7,和29.3分钟葛根素,黄豆苷,精制,黄素和染料木黄酮,分别。因此,总isoflavonoids含量为48.00%。为主要成分,葛根素的浓度是19.8%。黄豆苷是下一个最高为2.7%,大豆苷出席和精制,1.53%和0.33%,分别,而染料木黄酮在0.12%的最低水平。

3.2。PTIF对体重和血糖水平的影响

如表所示1与正常组相比,STZ治疗导致体重明显下降在36周的观察。STZ治疗也引起持续高血糖水平如表所示2。,与糖尿病组比较,大鼠糖尿病+ PTIF组显示,体重显著增加周34和36 (),没有明显区别与治疗PTIP血糖。

3.3。PTIF对氧化应激和炎症细胞因子的影响在STZ-Induced糖尿病大鼠

调查PTIF抗氧化和抗炎的作用,我们研究了氧化应激和炎症细胞因子的浓度。如图3与正常组相比,SOD的激活₁在糖尿病大鼠明显下降(),大大增加了PTIF治疗()。低氧诱导因子的浓度α和MDA都显著增加,恢复正常的价值观在PTIF-treated老鼠。在糖尿病大鼠,我们发现增加VEGF水平和ICAM-1 ()(图3)。此外,没有水平没有明显差异的三组()。治疗PTIF对炎性细胞因子没有显著的影响,如VEGF、ICAM-1,没有在这项研究()。

3.4。验证UPLC-Q-Exactive Orbitrap-MS条件

血浆样品分析UPLC-Q-Exactive Orbitrap-MS根据下面的方法。代表UPLC-Exactive + Orbitrap-Mass抽搐色谱三组的血浆样品呈现在图4。精度、样品制备的重复性和系统稳定性试验样品分析之前进行验证。结果表明,该方法可用于随后的血浆样本的代谢组学分析。

3.5。模式识别和识别潜在的生物标记物

主成分判别分析(PCA-DA)偏最小二乘判别分析(PLS-DA)和正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)经常采用多变量分析。潜在生物标志物的发现等离子体增强我们对重要的理解与DM大鼠相关代谢的变化。如图5,PLS-DA分数表明,有一个令人满意的分类之间的正常和糖尿病大鼠,这表明等离子体代谢指纹明显被链脲霉素的治疗。此外,模型大鼠的生化变化PTIF管理后逐渐恢复正常,这意味着PTIF有显著疗效的改善代谢紊乱在STZ-induced糖尿病大鼠。

此外,十一个潜在的代谢生物标记,识别和分析了其功能通路(见表3)。箱线图相同的生物标记大鼠血浆强度如图6。特别是,脂质代谢相关代谢物,包括PC (21:0/0:0) (U), 2-hexylglycerol, 7-keto-n-caprylic酸,7-oxoheptanoic酸,PC(22:0/12:0)和PC(二十4 (5 z, 8 z, 11 z, 14 z) / 18:1 (z) 11日),已确定在糖尿病大鼠,表明糖尿病大鼠的脂质代谢失调。与正常对照组相比,维生素k1水平显著增加糖尿病模型()。此外,代谢组学结果还表明PTIF拥有治疗影响DM部分改善凝血障碍。此外,5′-methylthioadenosine、Lys-Lys-Ser Leu-Ser-Lys-Lys, Gly-His-Arg-Gly被发现在模型大鼠显著增加()。如图6,暗灰色背景的标记代谢物可能与氨基酸代谢有关。治疗PTIF展出一个好处影响调节氨基酸代谢障碍的正常状态。

3.6。氨基酸分析条件

自由氨基酸在血清样本测量HPLC-FLD使用AccQ·标签precolumn衍生化方法。一个典型的高性能liquid-fluorescent检测色谱法的标准氨基酸混合物和提取大鼠血浆是如图7。色谱条件的建立,研究了浓度的校准曲线显示良好的线性范围。在和天变异系数分别低于9.28%和8.72%,分别。飙升的回收率大于75.02%。结果表明,该方法是令人满意的分析氨基酸。

3.7。等离子体氨基酸浓度

天冬氨酸和半胱氨酸没有检测到一些样品,所以天冬氨酸和半胱氨酸的统计分析。如表所示4与正常对照组相比,BCAAs的浓度(缬氨酸,亮氨酸和异亮氨酸)在糖尿病大鼠显著增加()。此外,水平的谷氨酸、精氨酸和酪氨酸在血清也显著增加)。PTIF补充在糖尿病大鼠可以降低谷氨酸和亮氨酸(水平)。

4所示。讨论

众所周知,中医治疗集中在身体的系统功能。因此,有很多优势治疗代谢性疾病,如糖尿病。担忧的降糖效果,大多数糖尿病患者通常选择某些抗糖尿病的药物的联合治疗和佐剂等中药,而不是单独服用抗糖尿病的药物。目前的研究表明,PTIF恢复没有显著影响DM大鼠的血糖紊乱。因此,它表明PTIF可能达到的治疗效果无改善高脂饮食和STZ-induced糖尿病大鼠的高血糖。

研究指出,异常代谢和高血糖诱导的氧化应激导致超氧化物产量大幅增加,可激活蛋白激酶C、多元醇、己醣胺通路,从而增加先进的糖化蛋白的构象终端产品(年龄)和年龄的表达受体(19]。研究表明,氧化应激标记,SOD值和脂质过氧化等产品MDA在糖尿病患者高度相关,可能进一步损害代谢系统(26]。一些先前的研究表明,PTIF的有益作用可能源于其干预过氧化物生产。在我们的研究中,一个明显的降低SOD水平₁和随之而来的MDA和HIF-1的浓度α观察糖尿病大鼠。这是在协议与早些时候报道表明氧化应激是糖尿病的重要事件之一。进一步,PTIF管理后,血浆MDA水平,HIF-1α,草皮₁恢复,表明PTIF在DM的可能的机制可能与抑制慢性氧化损伤。

炎症是一种多组分反应组织压力,伤害,和感染,这被认为是前景的急性和慢性病理条件27]。现在越来越欣赏,糖尿病是一个典型的疾病与慢性炎性改变(28]。它认识到low-term慢性炎症增加胰岛素抵抗导致高血糖症(29日]。各种研究表明,炎性细胞因子的水平,包括ICAM-1, TNF -αil - 6,增加患者和糖尿病大鼠(30.,31日]。在目前的研究中,一个显著增加浓度ICAM-1和VEGF在糖尿病大鼠可能表明,炎症过程可能导致糖尿病的发展。然而,我们并没有看到明显的PTIF对VEGF的影响,ICAM-1,不,这意味着PTIF的抗糖尿病的作用可能与降低炎性细胞因子无关。

在这项研究中,一些脂质代谢相关代谢物,包括PC (21:0/0:0) (U), 2-hexylglycerol, 7-keto-n-caprylic酸,7-oxoheptanoic酸,PC(22:0/12:0)、电脑(二十4 (5 z, 8 z, 11 z, 14 z) / 18:1 (z) 11日),已确定在糖尿病大鼠,这表明在糖尿病大鼠脂质代谢失调。磷脂和脂肪酸的代谢途径与糖尿病有关。磷脂酰胆碱(pc)的重要组成部分是产品或代谢产物脂质双分子层的细胞,以及参与代谢和信号。之前的研究表明,葛根黄酮可以改善脂质代谢在脂肪组织和肝脏切除卵巢的老鼠由于雌激素的影响(32]。类似于之前的研究,这项研究还表明,管理PTIF可能有助于改善糖尿病患者机体的脂质代谢。早期研究表明peroxisome-proliferator激活受体(PPAR),参与脂质稳态和新陈代谢,激活了异黄酮(染料木素和大豆苷)33]。因此,我们可以得出结论,PTIF在脂类代谢的提高可能是由于这些活性成分。

纯化形式的维生素K,叶绿醌发现凝血过程中起着关键作用。它被广泛用于治疗的疾病,其特征是水平的凝血酶原减少。表明,内皮功能障碍,凝结物的活化,和血小板代答有助于糖尿病的hypercoagulable和凝血状态,造成高血糖之间的相互作用,胰岛素抵抗,炎症和氧化应激(34,35]。此外,血粘度高,糖尿病引起的微血管曲折和大型血小板血栓形成的一个重要因素在微血管(36]。与正常对照组相比,糖尿病模型中维生素k1水平显著提高。此外,代谢组学结果还表明PTIF拥有通过部分调节凝血障碍治疗对糖尿病的影响。先前的研究表明,葛根素,对战的主要isoflavonoids化合物之一,可以有效地降低红细胞聚集指数、红细胞聚集,血浆粘度、和血液屈服应力在急性古今模型大鼠(37,38]。

此外,一些潜在的生物标记物与氨基酸代谢有关,包括5′-methylthioadenosine, Lys-Lys-Ser, Leu-Ser-Lys-Lys, Gly-His-Arg-Gly,已确定,这表明氨基酸代谢紊乱的发生糖尿病的老鼠。除了作为一个重要的能量来源,氨基酸(AAs),特别是支链氨基酸,(BCAAs)是重要的细胞内信号分子,调节基因的转录和翻译39]。腺嘌呤和产量5-methylthioribose-1-phosphate两种主要代谢物的5′-methylthioadenosine (MTA)。MTA的新陈代谢起着关键作用的嘌呤打捞和蛋氨酸通路(40]。此外,它还报道,增加人类尿MTA与严重联合免疫缺陷综合症(41]。在我们的研究中,与正常对照组相比,这些生物标记物的浓度显著增加。然而,增加被PTIF显著逆转,这表明PTIF能明显调节氨基酸的代谢DM。

此外,血清中17种游离氨基酸含量测定为了调查PTIF在氨基酸代谢的影响糖尿病大鼠。最近的研究表明,更高层次的支链氨基酸直接导致胰岛素抵抗通过减少活化蛋白激酶的活性,最终导致2型糖尿病(42,43]。然而,另一方面,支链的活动alpha-keto酸脱氢酶复合体(BCKDC)在糖尿病大鼠明显减少44),最后导致分解代谢障碍和越来越等离子BCAAs水平。我们的研究结果表明,浓度BCAAs(缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸)、谷氨酸、精氨酸、酪氨酸和显著增加,与先前的报道一致(45]。的有利影响PTIF改善氨基酸代谢可能解释为其利益影响循环胰岛素浓度和胰岛素反应通过激活的信号通路营地/ PKA-dependent ERK1/2 [46,47]。

谷氨酸是一个中央结在氨基酸合成和降解[48]。研究表明,在胰腺β肽谷氨酸氧化和glutamine-to-glutamate比率是胰岛素抵抗密切相关(49]。此外,谷氨酸水平被发现显著增加肥胖综合征动物(50],它类似于我们的研究的结果。我们的数据也表明,谷氨酸的浓度明显降低PTIF的口服。精氨酸是一氧化氮(NO)的前体和胰岛素能刺激没有(x)合成精氨酸(51]。因此,我们可以得出结论,在这项研究中精氨酸水平的增加可能造成进一步的破坏血管和细胞的功能。

5。结论

总之,基于代谢组学方法UPLC-Q-Exactive Orbitrap-MS已经建立调查metabonomic概要文件的高脂肪饮食和STZ-induced糖尿病鼠。十一个潜在代谢物在等离子体生物标志物识别。PTIF的防护效果可靠地确认了干预脂质代谢,氨基酸代谢、凝血障碍。此外,我们认为氧化应激和炎症反应起着关键的作用在糖尿病大鼠。PTIF潜力巨大的治疗在糖尿病的治疗中,抑制氧化损伤。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

承认

支持的工作是计划中国国家中医药管理局(JDZX2012132)。