米糠中水溶性硅酸类矿物的色素沉着作用

摘要

我们的研究重点是确定米糠灰提取物（RBE）中可溶性矿物质（包括原硅酸（OSA））的黑素生成作用黑素细胞在形态学上明显正常。然而，在添加RBE和OSA的培养基中，LDH活性显示黑素细胞受到轻微的应激。RBE处理后，黑素合成和细胞内酪氨酸酶活性增加，与OSA相似。Western blotting结果显示，TRP-1、TRP-1、TRP-1、TRP-1、TRP-1、TRP-1、TRP-1、TRP-1、TRP-1、TRP-1、Tr与通过CREB磷酸化促进黑色素合成的对照组相比，OSA和RBE组的罗西酶和MITF表达水平高2-3倍。此外，组织学和免疫组织化学显示与蛋白质表达的结果相似。因此，组成原硅酸的矿物质具有RBE具有促进黑素生成的潜能，RBE和OSA具有相似的细胞活力、蛋白表达和免疫染色结果，表明RBE包含通过增加MITF和CREB磷酸化促进黑素合成的特定矿物质。因此，RBE可作为一种新的治疗方法来对抗黑素合成通过其可溶性硅和矿物质成分刺激黑素细胞，从而导致与癌症相关的疾病。

1.导言

黑色素缺乏病，如龋牙、白癜风，主要是黑色素细胞功能障碍或细胞衰老所致;因此，研究了许多治疗和/或阻止黑色素缺乏疾病进展的方法。

大量研究表明，各种天然提取物促进黑素细胞活化。Hong等人报道，黑大豆提取物在Melan-a细胞中具有促黑素作用，可分别增加约30%和20%的黑素含量和细胞内酪氨酸酶活性[1.]．同样，An等人研究了黑素生成效应山茱萸在Melan-a细胞中提取。山茱萸提取物处理的细胞黑色素含量增加36.1%，酪氨酸酶、酪氨酸酶相关蛋白1（TRP-1）和2（TRP-2）以及小眼球相关转录因子（MITF）的表达上调[2.]．此外，Park等人还发现干姜Roxb。在B16F10黑色素瘤细胞中有黑色素生成作用。这些成分增强了细胞外信号调节激酶(ERK)激活、酪氨酸酶活性和上游刺激因子-1 (USF1)水平。此外，usf1敲低细胞中的黑色素合成减少[3.]．

与上述研究类似，许多研究人员使用有机材料刺激黑素生成。然而，据我们所知，使用无机矿物成分刺激黑素细胞的研究尚未发表。米糠灰提取物（RBE）已通过焚烧去除其有机化合物，留下有机化合物，如硅、钾、磷和可溶性硅酸。

硅酸以各种形式存在，包括一组与分子式相同的化合物，如二氧化硅(SiO_2.)。这些化合物大多不溶于水，具有细胞毒性体内然而，其中原硅酸（OSA，Si（OH）_4.) (OSA)是水溶性的，与不溶性硅酸相比毒性低[4.,5.]．

许多研究人员已经对OSA在各种细胞类型中的作用进行了研究。Reffitt等人报道OSA促进骨肉瘤细胞系MG-63中胶原1的合成并增加碱性磷酸酶和骨钙素的表达[6.,7.].在一只老年去卵巢大鼠中，补充OSA通过减少钙排泄和减缓骨转换增加股骨和腰椎骨密度[8.]．此外，在一项双盲安慰剂对照临床研究中，与单独使用钙/维生素D3相比，OSA和钙/维生素D3联合使用增加了骨密度[9，表明阻塞性睡眠呼吸暂停有可能成为治疗骨质疏松症等骨相关疾病的新方法。

除了对骨相关疾病有益外，Calomme和Vanden Berghe报告说，摄入OSA可使真皮和软骨中的胶原蛋白浓度增加约10%[10]提示Si可能参与细胞外基质的形成和Ca的代谢。此外，Grotheer等人证明OSA在慢性伤口中具有抗炎特性[11]Barel等人报道，OSA对皮肤、头发和指甲的积极作用随着真皮中羟脯氨酸浓度的增加而增加[12]．

同时使用天然材料促进骨骼、皮肤、软骨修复一直得到广泛的研究和有机化合物和矿物质从RBE用于细胞的激活,我们所知,没有研究已经出版的使用矿物成分刺激黑色素细胞或促进黑素原生成。因此，本研究研究了OSA的促色素作用，以及与含有可溶性硅等矿物质成分的RBE的结合。

2.材料和方法

2．1．材料

RBE是从炭化的米糠糠中提取的。米糠灰（200 g） 已添加到1 L蒸馏水，在400℃搅拌 转速和100°C，持续24小时 H然后，将混合物过滤10分钟 μm滤纸，在25°C, 10000 rpm离心30分钟，去除任何剩余的颗粒物，然后用0.2μm注射器过滤器。OSA来自美国BioSil自然因子公司。

2.2. 细胞培养

QualiCell人黑素细胞(Creative Bioarray，纽约，美国)在254 (M254, Invitrogen, Waltham，美国)培养基中培养，该培养基含有无pma的人黑素细胞生长补充物(HMGS-2, Invitrogen, Waltham，美国)、50单位/mL青霉素和50μg/mL链霉素(HyClone，美国)，在37°C、5% CO的湿化气氛下80 mm培养皿中孵育_2..

2.3.黑色素含量测定

黑色素母细胞在110^4.细胞/孔入6孔板，在含hmgs - 2,10 nM的分化培养基中培养3天α-促黑素细胞激素(α-MSH，Sigma-Aldrich），10 nM 12-O-十四烷基佛波醇-13-乙酸酯（TPA，Sigma-Aldrich）和20 μM forskolin（Sigma-Aldrich）。然后，将培养基更换为含有0.24的M254培养基 μg/mL OSA和30μg/mL RBE与分化的黑素细胞继续培养3 d。

黑色素细胞中的黑色素含量是使用先前公布的方法测定的[13]经过修改。从培养皿中取出培养基后，用10%二甲基亚砜溶液溶解于1 M NaOH，并在80℃下煮沸2小时 H然后，细胞在15000℃下离心 每分钟15转 在405处使用ELISA平板读取器测量上清液中的黑色素含量 nm（光谱分析仪，Victor 1420-050，PerkinElmer生命科学公司，芬兰图尔库）。

２.４.酪氨酸酶活性测定

细胞内酪氨酸酶活性的测定采用前面描述的方法[13]稍加修改。成黑素细胞在1小时内播种10^4.细胞/孔置于6孔板中，在分化培养基中培养3天。然后将培养基换成含0.24的M254μg/mL OSA和30μg/mL RBE和分化的黑素细胞再培养3天。从培养皿中取出培养基后，用PBS清洗细胞，并用10%triton X-100（Sigma-Aldrich）溶解。细胞在15000℃下离心 每分钟15转 min，然后通过双锥虫试验（BCA）（美国赛默飞世尔科学公司）测量上清液的蛋白质含量。将3,4-二羟基苯丙氨酸（L-DOPA）（Sigma-Aldrich）（10%）溶解在磷酸钠缓冲液（10%）中 30分钟后 在37℃下培养至少一分钟，在475℃下测量吸光度 使用ELISA平板阅读器（PerkinElmer生命科学公司）进行nm。

2.5.细胞损伤评估

通过乳酸脱氢酶（LDH）测定评估细胞损伤 μL)将细胞在含有OSA和RBE(上述)的M254中培养3天后获得的培养基置于96孔板，50μ加入LDH-LQ试剂盒溶液(韩国牙山制药公司)的L，然后在25°C孵育30分钟。加50就停止了反应μ然后在490 nm处测定吸光度。

2.6.蛋白质印迹法

人源性黑色素母细胞接种于60毫米的培养皿中()密度为110^5. 取下培养基，用磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤细胞两次，并在含有10%甘油和5%葡萄糖的PBS中溶解  β-巯基乙醇、2%十二烷基硫酸钠（SDS）和0.01%溴酚蓝在62.6%溶液中 mM Tris-HCl缓冲液（pH 6.8）。然后将细胞裂解物在100℃下变性5分钟 通过BCA分析对细胞裂解物的蛋白质含量进行定量，并用10%SDS聚丙烯酰胺分离每个样品的等量蛋白质，并将其电转移到硝化纤维素膜上（马萨诸塞州密理博公司）。在室温下，将膜封闭在5%无脂脱脂乳中，脱脂乳溶解在含有0.1%吐温20（TBS-T缓冲液）的Tris缓冲盐水（TBS）中1小时 H用TBS-T洗涤后，将膜在10%牛血清白蛋白中培养1小时，其中含有一级抗体：抗小鼠β-actin抗体(1:20 00)、抗山羊TRP-1抗体(1:50 00)、抗山羊酪氨酸酶抗体(1:50 00)、抗兔MITF抗体(1:50 00)、抗兔CREB (camp反应元件结合蛋白)抗体(1:10 00)、抗兔P-CREB(磷酸化CREB)抗体(1:10 00)。去除一抗;结合抗体采用辣根过氧化物酶(HRP)结合的抗兔、抗山羊、抗小鼠二抗在室温下2h检测。用TBS-T冲洗膜;使用增强化学发光试剂(Thermo Fisher Scientific, USA)观察印迹，并使用ChemiDoc XRS+凝胶成像系统(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)拍照。使用ImageJ软件对结果进行量化(美国国立卫生研究院，Bethesda, MD)。

2.7.免疫组织化学

在含有OSA和RBE(上述)的M254培养基中培养3 d后进行免疫组化。单层培养的黑素细胞在4%缓冲甲醛溶液中固定，然后与抗黑素瘤单克隆抗体HMB45溶液(1:10 00)孵育。HMB45通过亲和素免疫碱性磷酸酶方法与载体red (vector Laboratories, Burlingame, CA)进行定位，载体red是一种红色显色原产物，对在色素组织中免疫定位的成功至关重要。显微图像是用尼康数码相机和尼康Optiphot-2显微镜拍摄的[14]．

2.8。组织化学的评价

在含有OSA和RBE(上述)的M254培养基中培养3 d后进行组织化学评价。样品在4%多聚甲醛中固定，切片，用Fontana-Masson硝酸银(Kojima Chemical, Kashiwabara, Japan)在56°C下染色1小时，然后用蒸馏水洗涤，在5%硫代硫酸钠溶液(Duksan, Seoul, Korea)中固定5分钟，用蒸馏水洗涤。然后用核坚牢红溶液(Fluka, Buchs, Switzerland)染色5分钟，用蒸馏水洗涤3次。最后，样品用95%乙醇脱水，然后用二甲苯(Duksan)洗涤2次[14]．

3.结果

3.1.细胞损伤的评估

与MSH、OSA和RBE细胞相比，对照组细胞胞浆中液泡数量更多，说明这些细胞衰老的时间更长(图)1（a）此外，MSH、OSA和RBE细胞显示出比对照细胞更多的双极树突状突起，并且没有凋亡或坏死细胞死亡（图1）1.）.然而，OSA和RBE细胞的LDH活性比对照组高10%(图)2.)，表明细胞应激。

3.2.黑色素含量和酪氨酸酶活性

与对照组相比，MSH、OSA和RBE组的黑色素水平高出10%(图)3.)此外，与对照组相比，OSA和MSH组的酪氨酸酶活性约高10%，RBE组高20%（图4.）.

3.3.蛋白质表达水平

黑素生成标记物TRP-1、酪氨酸酶和MITF的蛋白表达通过Western blotting进行评估5.与对照组相比，RBE组TRP-1和MITF增加2.5倍，OSA组增加2倍。与对照组相比，RBE组和OSA组酪氨酸酶分别增加了2倍和1.5倍。这一结果提示，OSA和MSH在刺激黑素生成方面具有相当的效果，而RBE的效果优于MSH。此外，在MSH、OSA和RBE组中，P-CREB水平增加约2倍，提示黑色素的合成是通过CREB磷酸化进行的。

3.4.组织学评估和免疫组织化学

丰塔纳-马森染色被用来确认黑素细胞正在合成黑色素的事实[15]．在本研究中，MSH、OSA和RBE组Fontana-Masson染色阳性，而对照组为阴性(图)6.).同样，MSH、OSA和RBE组HMB45呈阳性，而对照组为阴性（图7.)（表2.).HMB45是针对黑素体的[16]．局部HMB45染色表明活跃的黑素小体形成，因此，黑素细胞分化，提示HMB45是一种黑素细胞激活标志物[14]．

4.讨论

一些研究人员已经使用RBE来激活各种类型的细胞[17–19]Hagl等人发现含有谷维素和生育酚成分的RBE通过增加神经退化小鼠模型中的线粒体呼吸和膜电位来补偿年龄相关的线粒体功能障碍。Choi等人表明γRBE中的-谷维素成分通过诱导毛囊进入生长期(生长活跃期)和增加VEGF、IGF-1和KGF的表达来促进头发生长。Fukumoto等报道RBE具有将间充质干细胞分化成成骨细胞的能力。这些先前的研究[17–19主要研究了米糠提取物中维生素、谷氨酰胺醇、生育酚、生育三烯醇和亚油酸等有机化合物。

然而，除了有机化合物外，米糠还富含硅、钾和镁等矿物质。Liu等人报告说，米糠灰含有多种矿物质成分，Si、C、K_2.啊,曹,Na_2.O,分别_2.O_3.氧化锌,MnO_2.，及_2.O_3.，其中Si占65% 重量百分比[20]．因此，本研究的重点是RBE矿物，特别是硅酸。RBE的组成(表1.)与Liu等人研究的米糠灰相似[20]，建议30 μg/mL的RBE含有5 μg/mL可溶性硅。

硅酸盐通常以SiO 2的形式存在_2.，在人类细胞系(A431和A549)中显示出细胞毒性[4.]．此外，在大鼠肝细胞系中，SiO_2.细胞活力呈剂量依赖性下降[5.]．在本研究中，黑色素细胞未见凋亡或细胞损伤的迹象(图)1.)0时24分 μg/mL OSA和30μ克/毫升RBE。黑素细胞在形态上明显正常。然而，在乳酸脱氢酶活性测试中，它们受到了轻微的压力。

有几项研究调查了OSA的影响，它的细胞毒性小于硅酸盐。例如，Dong等发现OSA显著增加成骨细胞样细胞系MG-63和U2-OS中的1型胶原和骨钙素[7.]类似地，Reffitt等人在成骨样细胞系MG-63和HCCl中显示出1型胶原、碱性磷酸酶和骨钙素合成增加[6.]此外，Grotheer等人还表明，释放OSA的水凝胶通过抑制NF来降低炎症反应并帮助慢性伤口恢复-κB表达或增强IκB, NF -κB-抑制蛋白[11]．

在本研究中，我们研究了OSA和RBE矿物成分对黑素细胞的影响。OSA和RBE提高了酪氨酸酶活性和黑色素含量，两种物质均激活了黑素细胞中的TRP-1、酪氨酸酶、MITF和P-CREB。

与对照组相比，MSH、OSA和RBE组的黑色素合成增加。因此，MSH、OSA和RBE组的黑色素含量升高（图3.)Fontana-Masson染色证实黑色素细胞中存在黑色素（图6.)这些结果表明，OSA和RBE能够刺激黑素细胞合成黑色素。此外，OSA和RBE组的酪氨酸酶活性比对照组高10%和20%。酪氨酸酶通过将酪氨酸氧化为多巴和多巴脱氢为多巴醌来催化黑色素合成[21]在这项研究中，RBE在催化黑色素合成方面比MSH更有效。

Western blotting结果显示，与对照组相比，OSA组和RBE组TRP-1、酪氨酸酶和MITF表达水平较高(图)5.)TRP-1将5,6-二羟基吲哚-2-羧酸（DHICA）氧化为羧基吲哚醌[22]此外，MITF诱导酪氨酸酶基因家族的上调[23]．MITF的增加与HMB45免疫染色结果有关。这是因为PMEL参与黑色素在黑素小体内原纤维上的沉积，HMB45染色定位于黑素小体，PMEL的表达受MITF的转录调控[16]．因此，HMB45可以作为黑素细胞的黑素发生标志物[16]．因此，OSA和RBE组HMB45阳性是由于MITF水平升高所致。此外，MITF表达水平的升高可以通过P-CREB水平的升高来解释。Bu等研究表明，在B16-F10黑色素瘤细胞系中，抑制CREB磷酸化导致MITF表达降低[24]．

5.结论

黑素生成是一个受多种因素调控的复杂机制。其中，TRP-1、酪氨酸酶和MITF被认为是关键的黑素生成因子。在本研究中，我们发现OSA具有促进黑素生成的潜力，RBE和OSA具有相似的细胞活力、蛋白表达和免疫染色结果，提示hat RBE含有通过MITF和CREB磷酸化促进黑色素合成的特定矿物质。因此，RBE可作为一种新型材料，通过其可溶性硅和矿物质成分刺激黑色素细胞，促进黑色素合成。

相互竞争的利益

作者声明，本论文的发表不存在任何利益冲突。

致谢

本研究得到了韩国保健福利部韩国保健技术研发项目(HN14C0086)的资助。

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