ECAM 以证据为基础的补充和替代医学 1741 - 4288 1741 - 427 x Hindawi出版公司 10.1155 / 2016/3137486 3137486 研究文章 色素的影响米糠中提取矿物质组成可溶性硅的酸 张成泽 Hyun-Jun 1 http://orcid.org/0000 - 0001 - 7533 - 9605 搜索引擎优化 Young-Kwon 1 Calapai Gioacchino 医学生物技术(BK21 +团队) 东国大学 首尔 韩国 dongguk.edu 2016年 1 11 2016年 2016年 28 07年 2016年 27 09年 2016年 11 10 2016年 2016年 版权©2016 Hyun-Jun张成泽和Young-Kwon Seo。 这是一个开放的文章在知识共享归属许可下发布的,它允许无限制的使用,分布和繁殖在任何媒介,提供最初的工作是正确的引用。

我们的调查集中在识别杀菌作用的影响在米糠可溶性矿物质火山灰提取(RBE)包括原硅酸(阻塞性睡眠呼吸暂停综合症)。黑色素细胞显然是正常的形态。然而,表明他们强调一点LDH的RBE和阻塞性睡眠呼吸暂停综合症添加媒体方面的活动。黑色素合成和细胞内酪氨酸酶活性增加了治疗的RBE类似于阻塞性睡眠呼吸暂停综合症。免疫印迹结果显示TRP-1,酪氨酸酶,MITF表达水平高出2 - 3倍的阻塞性睡眠呼吸暂停综合症和RBE组与对照组相比,促进黑色素合成通过磷酸化分子。此外,组织学和免疫组织化学显示蛋白质的表达也有类似的结果。因此,矿物质组成原硅酸有可能促进黑素原生成RBE和阻塞性睡眠呼吸暂停综合症也有类似的细胞生存能力,蛋白质表达和免疫染色结果,表明RBE由特定的矿物质促进黑色素合成通过增加MITF和磷酸化分子。因此,RBE可以作为一种新型治疗方法对抗黑色素缺乏相关疾病通过刺激黑色素细胞通过其可溶性Si和矿物成分。

 韩国卫生技术研发项目,卫生和福利部,韩国 HN14C0086 1。介绍

黑色素缺乏疾病,灰发、白癜风等,主要是由于黑色素细胞或细胞衰老的功能障碍;因此许多疗法治疗和/或阻止黑色素缺乏疾病的发展进行了研究。

大量研究表明,各种天然提取物促进黑素细胞活化。香港等人报道,黑大豆提取物在Melan-a melanogenic效应细胞,这些都会增加黑色素含量和细胞内酪氨酸酶活性约30 - 20%,分别为( 1]。同样,一个等人调查了杀菌作用的影响<我talic> 山茱萸officinalis提取Melan-a细胞。<我talic> 山茱萸officinalisextract-treated细胞黑色素含量多出36.1%,调节酪氨酸酶的表达,tyrosinase-related蛋白1 (TRP-1)和2 (TRP-2)和microphthalmia-associated转录因子(MITF) [ 2]。此外,公园等人表明,提取的<我talic> 姜cassumunarRoxb。在B16F10黑素瘤细胞有杀菌作用的影响。组件增强细胞外signal-regulated激酶(ERK)激活酪氨酸酶活性,上游刺激因子- 1 (USF1)水平。此外,黑色素合成减少在USF1-knockdown细胞( 3]。

类似于这些上述研究,许多研究人员已经使用有机材料来刺激杀菌作用。然而,我们所知,使用无机矿物成分刺激黑色素细胞尚未发表。米糠灰提取(RBE)有机化合物被焚烧,留下的有机化合物,如硅、K, P,可溶性硅的酸。

硅酸中存在多种形式,包括一个家庭的化合物与公式<我nline-formula> 年代 我 O x O H 4 - - - - - - 2 x n ,如二氧化硅(SiO2)。这些化合物是不溶于水的,引起细胞毒性<我talic> 在活的有机体内。原硅酸(阻塞性睡眠呼吸暂停综合症,其中,然而,Si(哦)4)(OSA)水溶性和低毒性与不溶性含硅的酸( 4, 5]。

阻塞性睡眠呼吸暂停综合症的影响已被众多的研究人员调查了在不同细胞类型。1 Reffitt等人报道阻塞性睡眠呼吸暂停综合症促进胶原蛋白合成,增加碱性磷酸酶和骨钙素的表达在骨肉瘤细胞系mg - 63 ( 6, 7]。岁,切除卵巢的老鼠,阻塞性睡眠呼吸暂停综合症补充增加股骨和腰椎骨密度减少钙排泄和减缓骨的代谢 8]。同时,阻塞性睡眠呼吸暂停综合症和Ca /维生素D3增加骨密度与Ca /维生素D3独自在一个双盲安慰剂对照临床研究 9),这表明阻塞性睡眠呼吸暂停综合症显示了潜在的治疗骨疾病的新方法,如骨质疏松症。

除了它的好处在骨疾病,Calomme和Vanden Berghe报道,阻塞性睡眠呼吸暂停综合症的摄入增加约10%的胶原蛋白浓度在皮肤和软骨 10),这表明如果可能参与细胞外基质的形成和新陈代谢。同时,Grotheer等人表明,阻塞性睡眠呼吸暂停综合症在慢性伤口消炎( 11)和Barel等人报道,阻塞性睡眠呼吸暂停综合症的积极作用,对皮肤,头发,指甲,增加皮肤中羟脯氨酸浓度的增加( 12]。

同时使用天然材料促进骨骼、皮肤、软骨修复一直得到广泛的研究和有机化合物和矿物质从RBE用于细胞的激活,我们所知,没有研究已经出版的使用矿物成分刺激黑色素细胞或促进黑素原生成。因此,本研究调查了pigmentation-promoting阻塞性睡眠呼吸暂停综合症的影响并与RBE阻塞性睡眠呼吸暂停综合症的组合,其中包含矿物成分,如可溶性硅。

 2。材料和方法 2.1。材料

碳化谷壳的RBE得到米糠。米糠灰(200克)添加到1 L 400 rpm的蒸馏水,搅拌和24小时100°C。在那之后,混合物过滤10<我talic> μm滤纸,离心机在10000 rpm 25°C 30分钟删除任何剩余的颗粒物,然后消毒使用0.2<我talic> μm注射器过滤器。美国BioSil阻塞性睡眠呼吸暂停综合症是来自自然的因素。

 2.2。细胞培养

QualiCell人类成黑素细胞(美国纽约创意Bioarray) 254年培养基培养(美国沃尔瑟姆M254,英杰公司)包含PMA-free人体黑素细胞增长补充(美国沃尔瑟姆HMGS-2,表达载体),50单位/毫升青霉素,50<我talic> μg / mL链霉素(美国HyClone)通过孵化一个80毫米盘在37°C在湿润的气氛中有5%的公司2。

 2.3。黑色素含量测定

成黑素细胞被播种在1<我nline-formula> × 104细胞/到6-well盘子和包含HMGS-2在媒体分化培养3天,10纳米<我talic> α促黑激素(<我talic> α-MSH Sigma-Aldrich) 10 nM 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate (TPA, Sigma-Aldrich)和20<我talic> μM forskolin (Sigma-Aldrich)。然后,媒体是用来交换M254媒体包含0.24<我talic> μ克/毫升阻塞性睡眠呼吸暂停综合症和30<我talic> μg / mL RBE和差异化的黑色素细胞培养3天。

黑色素细胞的黑色素含量测定用先前发表的方法( 13与修改)。把培养基从盘子后,细胞细胞溶解10% DMSO溶液中,溶解在1 M氢氧化钠,煮2 h的80°C。然后,细胞被离心机在15000 rpm,持续15分钟。上层清液的黑色素含量测定用ELISA板读者在405 nm(频谱分析仪,维克多1420 - 050,PerkinElmer生命科学、图尔库,芬兰)。

 2.4。酪氨酸酶活性测定

细胞内酪氨酸酶活性测定使用先前描述的方法( 13用细微的修改。成黑素细胞被播种在1<我nline-formula> × 104细胞/在6-well盘子和在媒体分化培养3天。然后,媒介是兑换M254包含0.24<我talic> μ克/毫升阻塞性睡眠呼吸暂停综合症和30<我talic> μg / mL RBE和差异化的黑色素细胞培养3天。把培养基从盘子后,细胞被洗PBS和细胞溶解triton x - 100 (Sigma-Aldrich)为10%。细胞在15000转离心了15分钟,然后上层清液的蛋白质含量测定的bicinchoninic化验(BCA)(美国热费希尔科学)。3、4、左旋多巴(左旋多巴)(Sigma-Aldrich)(10%)溶解在钠磷酸盐缓冲剂(10毫米)。30分钟后孵化在37°C,吸光度测量在475 nm使用ELISA板读者(PerkinElmer生命科学)。

 2.5。细胞损伤评估

细胞损伤评估的乳酸脱氢酶(LDH)测定。整除(100<我talic> μL)的媒体获得细胞培养3天后M254包含阻塞性睡眠呼吸暂停综合症和RBE(上述)被放置在一个96孔板,50<我talic> μL LDH-LQ工具包的解决方案(峨山制药有限公司、韩国)补充道,然后板块孵化为30分钟25°C。通过添加50反应停止<我talic> μL 1 n HCl然后吸光度测量在490海里。

 2.6。西方墨点法

人为成黑素细胞被播种在60毫米菜(<我nline-formula> N = 3 )的密度1<我nline-formula> × 105细胞和培养3天。中移除,这些细胞被洗两次磷酸盐(PBS)和细胞溶解在PBS包含10%甘油、5%<我talic> β巯基乙醇,2%十二烷基硫酸钠(SDS)和0.01%溴酚蓝在62.6毫米Tris-HCl缓冲区(pH值6.8)。在100°C细胞溶解产物被变性5分钟。细胞溶解产物的蛋白质含量由BCA量化分析,每个样品分离和等量的蛋白质10% SDS-polyacrylamide和electrotransferred到硝化纤维素膜(马萨诸塞州密理博有限公司)。细胞膜被封锁在5%脱脂脱脂牛奶溶解在Tris-buffered盐水(TBS)含0.1%渐变20 (TBS-T缓冲区)在室温下1 h。与TBS-T洗涤后,细胞膜是孵化1小时在10%牛血清白蛋白,包含主要抗体:anti-mouse<我talic> β肌动蛋白抗体(1:2000),抗体TRP-1抗体(1:500),抗体酪氨酸酶抗体(1:500),anti-rabbit MITF抗体(1:500),anti-rabbit (cAMP-responsive元素结合蛋白)抗体分子(1:1000),和anti-rabbit P-CREB (phosphorylated-CREB)抗体(1:1000)。主要的抗体被移除;绑定主要抗体检测通过应用辣根过氧化物酶,(合)共轭anti-rabbit抗体,anti-mouse二级抗体在室温下2 h。膜在TBS-T洗;污点是可视化增强化学发光试剂(美国热费希尔科学)和使用凝胶成像系统拍摄,ChemiDoc XRS + (Bio-Rad、大力神、钙、美国)。结果量化使用ImageJ软件(美国国家卫生研究院,马里兰州贝塞斯达)。

 2.7。免疫组织化学

免疫组织化学进行细胞培养3天后M254媒体包含阻塞性睡眠呼吸暂停综合症和RBE(上述)。单层培养的黑色素细胞固定在4%缓冲甲醛溶液,然后用anti-melanoma孵化单克隆抗体HMB45解决方案(1:1000)。HMB45定位进行通过avidin-immunoalkaline磷酸酶与向量方法红色(向量实验室,伯林盖姆,CA),这是一个红发色体产品immunolocalization在色素组织的成功的关键。显微图像捕获附带尼康数码相机尼康Optiphot-2显微镜( 14]。

 2.8。组织化学的评价

组织化学的评价进行细胞培养3天后M254媒体包含阻塞性睡眠呼吸暂停综合症和RBE(上述)。样品在4%多聚甲醛固定,切片,沾Fontana-Masson硝酸银(小岛化工、Kashiwabara、日本)1 h在56°C,然后用蒸馏水洗净和固定在5%硫代硫酸钠溶液(Duksan,首尔,韩国)5分钟,用蒸馏水洗净。之后,样本沾染着核快红的解决方案(丙烯酰胺、书、瑞士)5分钟,用蒸馏水洗净3次。最后,样本与95%和100%乙醇脱水,然后用二甲苯(Duksan) 2 * 14]。

 3所示。结果 3.1。评价细胞损伤

要看更多有关憩苑的细胞相比,阻塞性睡眠呼吸暂停综合症,RBE,对照组显示更多的细胞质液泡,表明这些细胞多岁(图 1(一)点圆圈)。此外,要看更多有关憩苑的阻塞性睡眠呼吸暂停综合症,RBE细胞显示比控制细胞和双极树突过程没有凋亡或坏死细胞死亡(图 1)。然而,阻塞性睡眠呼吸暂停综合症和RBE细胞LDH活性高10%,而对照组(图 2),表明细胞压力。

代表图像的黑色素细胞在分化3天培养后的媒体。(一)控制,(b) 10 nMSH, 2.4 (c)<我talic> μg / mL阻塞性睡眠呼吸暂停综合症,30 (d)<我talic> μ克/毫升RBE。原始放大:(一)——(d)×100;酒吧规模:100<我talic> μm。

代表图的黑色素细胞LDH测定3天培养后分化媒体和要看更多有关憩苑3天培养后,阻塞性睡眠呼吸暂停综合症,RBE丰富媒体。显著差异是由学生的决定<我talic> t以及;<我nline-formula> P ∗ < 0.05 。

 3.2。黑色素含量和酪氨酸酶的活动

要看更多有关憩苑黑色素含量高10%,阻塞性睡眠呼吸暂停综合症,RBE组与对照组相比(图 3)。此外,酪氨酸酶活动高出大约10%要看更多有关憩苑的阻塞性睡眠呼吸暂停综合症和组和高20%的RBE组相对于对照组(图 4)。

代表图黑色素细胞中黑色素含量的3天培养后分化媒体和要看更多有关憩苑3天培养后,阻塞性睡眠呼吸暂停综合症,RBE丰富媒体。显著差异是由学生的决定<我talic> t以及;<我nline-formula> P ∗ < 0.05 。

代表图酪氨酸酶活动的黑色素细胞在分化3天培养后媒体和要看更多有关憩苑3天培养后,阻塞性睡眠呼吸暂停综合症,RBE丰富媒体。显著差异是由学生的决定<我talic> t以及;<我nline-formula> P ∗ ∗ < 0.01 ;<我nline-formula> P ∗ ∗ ∗ < 0.005 。

 3.3。蛋白表达水平

蛋白表达的黑素原生成标记TRP-1酪氨酸酶,MITF被西方墨点法评估。如图 5,TRP-1 MITF增加RBE组的2.5倍和2倍阻塞性睡眠呼吸暂停综合症组相比,控制。酪氨酸酶在RBE增加2倍和1.5倍,阻塞性睡眠呼吸暂停综合症组,分别与控制。要看更多有关憩苑这个结果表明,阻塞性睡眠呼吸暂停综合症,有类似的功效,刺激杀菌作用,同时RBE要看更多有关憩苑的疗效比。此外,要看更多有关憩苑P-CREB水平增加了近2倍,阻塞性睡眠呼吸暂停综合症,和RBE组,表明通过磷酸化分子发生黑色素合成。

在黑色素细胞黑素原生成效果在阻塞性睡眠呼吸暂停综合症和RBE添加和细胞培养3天。TRP-1,酪氨酸酶、MITF P-CREB比对照组明显增加。显著差异是由学生的决定<我talic> t以及;<我nline-formula> P ∗ ∗ ∗ < 0.005 。

 3.4。组织学评价和免疫组织化学

Fontana-Masson染色是用来证实,黑色素细胞合成黑色素( 15]。要看更多有关憩苑在这项研究中,阻塞性睡眠呼吸暂停综合症,RBE组Fontana-Masson染色阳性,而对照组是负数(图 6)。要看更多有关憩苑同样,、阻塞性睡眠呼吸暂停综合症和HMB45 RBE组阳性,对照组是负数(图 7)(表 2)。HMB45是针对黑素体[ 16]。黑素体的形成和局部HMB45染色显示活跃,因此,黑素细胞分化,表明HMB45 melanocytic激活标记( 14]。

代表图像Fontana-Masson彩色黑色素细胞在分化3天培养后媒体(深色指示分泌黑色素)。(一)控制,(b) 10 nMSH, 2.4 (c)<我talic> μg / mL阻塞性睡眠呼吸暂停综合症,30 (d)<我talic> μ克/毫升RBE。原始放大:(一)——(d)×400;酒吧规模:50<我talic> μm。

代表图像HMB-45应用黑色素细胞在分化3天培养后媒体(棕色表明黑素体)。(一)控制,(b) 10 nMSH, 2.4 (c)<我talic> μg / mL阻塞性睡眠呼吸暂停综合症,30 (d)<我talic> μ克/毫升RBE。原始放大:(一)——(d)×400;酒吧规模:50<我talic> μm。

 4所示。讨论

一些研究人员已经使用RBE激活各种类型的细胞( 17- - - - - - 19]。Hagl等人发现RBE,其中包含谷维素和维生素e组件,补偿与年龄相关的线粒体功能障碍通过增加线粒体呼吸和膜电位的神经退行性小鼠模型。蔡等人表明,亚油酸和<我talic> γ谷维素组件RBE促进头发生长的诱导毛囊毛发生长初期阶段(活跃的增长阶段)和增加VEGF, igf - 1, KGF表达。同时,Fukumoto等人报道,RBE的间充质干细胞分化为成骨细胞的能力。这些以前的研究 17- - - - - - 19)主要是集中在米糠中提取的有机化合物,如维生素、谷维素、维生素e tocotrienols和亚油酸。

然而,除了它的有机化合物,米糠富含矿物质,如硅、K,毫克。刘等人报道,米糠火山灰含有各种矿物质组件,Si C K2啊,曹,Na2O,分别2O3氧化锌,MnO2,菲2O3,如果占65 wt % 20.]。因此,本研究关注RBE矿物质,尤其是硅酸。RBE的构成(表 1)是类似于米糠灰了刘et al。 20.),这表明30<我talic> μ克/毫升的RBE包含5<我talic> μ可溶性硅的g / mL。

RBE的化学成分。

元素 如果 Ca 毫克 K Na P
毫克/公斤(解决方案) 180年 5 17 2930年 113年 300年

结果染色后阻塞性睡眠呼吸暂停综合症和RBE治疗黑素细胞。

续 MSH 阻塞性睡眠呼吸暂停综合症 RBE
调频污点 − + + + +
HMB45 + + + + + + + + + + +

SiO硅酸盐通常存在2,这表明人类细胞系细胞毒性(A431和A549) ( 4]。此外,在大鼠肝细胞系、SiO2细胞生存能力降低剂量依赖性的方式( 5]。在这项研究中,没有黑色素细胞凋亡或细胞损伤的迹象(图 10.24)<我talic> μ克/毫升阻塞性睡眠呼吸暂停综合症和30<我talic> μ克/毫升RBE。黑色素细胞显然是正常的形态。然而,表明,他们强调在LDH活性的测试。

一些研究调查了阻塞性睡眠呼吸暂停综合症的影响,这是细胞毒性低于硅酸盐。例如,东等人发现,阻塞性睡眠呼吸暂停综合症显著增加1型胶原和骨钙素osteoblast-like细胞系mg - 63和U2-OS [ 7]。同样,Reffitt等人显示1型胶原蛋白增加,碱性磷酸酶,在osteoblast-like细胞系和骨钙蛋白合成,mg - 63和HCCl [ 6]。Grotheer等人也表明OSA-releasing水凝胶减少炎症反应和辅助慢性伤口恢复通过抑制NF -<我talic> κ我表情或增强<我talic> κB, NF -<我talic> κB-inhibiting蛋白( 11]。

在这项研究中,我们调查了阻塞性睡眠呼吸暂停综合症和RBE矿物成分对黑色素细胞的影响。阻塞性睡眠呼吸暂停综合症和RBE酪氨酸酶活性和黑色素含量增加,和两个材料激活TRP-1,酪氨酸酶,MITF, P-CREB黑色素细胞。

要看更多有关憩苑黑色素合成增加,阻塞性睡眠呼吸暂停综合症和RBE组与对照组相比。因此,要看更多有关憩苑黑色素含量升高在,阻塞性睡眠呼吸暂停综合症,RBE组(图 3)和Fontana-Masson染色证实,黑色素是黑色素细胞中(图 6)。这些结果表明,阻塞性睡眠呼吸暂停综合症和RBE能够刺激黑色素细胞合成黑色素。此外,阻塞性睡眠呼吸暂停综合症和RBE组有10和酪氨酸酶活性比对照组高出20%。由多巴氧化酪氨酸,酪氨酸酶催化黑色素合成的二羟基苯丙氨酸脱氢dopaquinone [ 21]。在这项研究中,要看更多有关憩苑RBE更有效地催化黑色素合成比。

免疫印迹结果显示TRP-1,酪氨酸酶,MITF表达水平更高的阻塞性睡眠呼吸暂停综合症和RBE组与对照组相比(图 5)。TRP-1氧化5 6-dihydroxyindole-2-carboxylic酸(DHICA)羧酸盐indole-quinone [ 22),这是黑色素合成的过程。此外,MITF诱发upregulation酪氨酸酶基因家族的 23]。MITF增长与HMB45免疫染色结果。这是因为PMEL参与黑色素的沉积到黑素体的内部纤维,在黑素体HMB45染色是本地化,PMEL表达转录受MITF [ 16]。因此,HMB45可以用作杀菌作用标记在黑色素细胞( 16]。因此,积极HMB45染色在阻塞性睡眠呼吸暂停综合症和RBE团体将MITF水平的增加。此外,增加MITF表达水平可以解释为增加P-CREB水平。部等人表明,抑制磷酸化分子因此减少MITF表达式在B16-F10黑色素瘤细胞系( 24]。

 5。结论

杀菌作用是基于受多种因素的复杂机制。其中,TRP-1、酪氨酸酶和MITF melanogenic被认为是关键因素。在这项研究中,我们表明,阻塞性睡眠呼吸暂停综合症有可能促进黑素原生成RBE和阻塞性睡眠呼吸暂停综合症也有类似的细胞生存能力、蛋白质表达、和免疫染色结果,表明RBE包含特定矿物质通过MITF促进黑色素合成和分子磷酸化。因此,RBE可以作为一种新型材料,促进黑色素合成通过刺激黑色素细胞可溶性硅和矿物成分。

 相互竞争的利益

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

 确认

本研究支持格兰特朝鲜卫生技术研发项目,卫生和福利部,大韩民国(HN14C0086)。

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