抗病毒化学部分的作用和模式成分从菘蓝根提取物对流感病毒FM1

文摘

菘蓝根已被用于预防流感数百年来在许多亚洲国家。在这项研究中,抗病毒clemastanin模式B (CB) epigoitrin, phenylpropanoid部分(PEP),和糖类、生物碱、有机酸部分(PEP +碱+ OA)从木根提取物对流感病毒FM1被调查。结果表明,CB, epigoitrin、PEP和PEP +碱+ OA发挥抗流感活动通过抑制病毒增殖,预防和阻止病毒的附件。PEP的主要作用方式和PEP +碱+ OA是抑制病毒复制。病毒附件的抑制作用和乘法是epigoitrin的主要模式。菘蓝根提取的所有化合物或化学部分测试在这个研究没有直接杀病毒的活动。我们的研究结果提供了综合分析的木根提取物抗病毒机制。

1。介绍

流感或流感是一种最重要的感染流感病毒引起的急性呼吸道疾病。季节性流感影响世界上数以百万计的人每年,导致严重威胁公共健康尤其是儿童和老人。此外,流感病毒有能力造成严重的流感大流行和经济损失1]。禽流感的爆发导致2013年在中国近65亿美元的经济损失。

目前,合成抗病毒药物或疫苗有限的发展中国家使用由于耐药菌株的出现,高成本,以及有害的副作用2,3]。然而,抗流感药物源自草本植物有很多优势,如低成本、毒性、来源广泛、易于访问(4,5]。此外,草药药物通常具有多目标效果,不仅作为抗病毒药物也刺激免疫(6]。因此,药用植物提取物和植物化学物质吸引了越来越多关注的潜在来源开发新的抗病毒药物在最近的十年。

菘蓝根(通用名:禁止局域网创)的干燥根Isatis indigotica堡垒。菘蓝根是第一次有记录的草本药物神的百姓的佳能草药的基础,一个著名的古代医学书在中国的汉朝(公元200年)。它已经被用于治疗感冒,喉咙痛,头痛几百年来在中国(7,8]。菘蓝根用于预防严重急性呼吸系统综合症(SARS)在2003年和2009年甲型h1n1流感大流行在中国,香港,台湾,日本(9,10]。

流感疫苗是主要的预防性治疗冬天来防止流感病毒。据估计,超过32亿美元每年花在流感疫苗生产的美国联邦政府(11]。因此,有必要开发廉价的药物和有效预防活动。菘蓝根的水提取物的使用,以防止冷已经记录了数百年。

最近,抗病毒效果的甲醇,水和乙酯提取菘蓝根被确认通过在体外测试(10,12]。然而,这些提取的抗病毒的行为模式仍不清楚。此外,几乎没有信息的差异之间的抗病毒作用单一纯化合物和化合物的提取分离。

糖类(PEP)、生物碱和有机酸是三大化学部分菘蓝根。Clemastanin B (CB)是属于phenylpropanoid最丰富的化合物。Epigoitrin是主要的生物碱化合物分离从菘蓝根(图1)[13,14]。之前的检查表明,CB和epigoitrin有强烈的抑制作用在流感病毒FM1 A1 (15]。本研究的目的是阐明可能抗流感CB和epigoitrin机制与糖类部分和糖类、生物碱、有机酸(PEP +碱+ OA)部分。

2。材料和方法

2.1。病毒株、细胞系和试剂

鼠标lung-adapted变异的流感病毒FM1菌株的获得了山东大学微生物学和免疫学。病毒传播两次尿囊腔的9 - 10天大的受孕的鸡蛋在35°C 48 h增强毒性。尿囊液是红血球凝聚的测量活动的收获。一旦红细胞凝集效价达到1:640年,该病毒被整除和储存在−80°C到使用。Madin-Darby狗肾细胞(MDCK)和人类宫颈癌(海拉)细胞从细胞生物学研究所、中国科学院。积极控制利巴韦林(批号:101018)购买从四川百利药业有限公司,中国。

2.2。植物提取物的制备

菘蓝根收集来自安徽,中国。草识别确认通过形态和显微分析根据中国药典(16]。纯化合物的提取和化学部分菘蓝根是由天津SunnyPeak生物技术。有限公司的混合糖类,生物碱,和有机酸部分(PEP +碱+ OA)是由混合上述每个部分的比率1:2:2 (w / w / w) [17]。冻干材料在细胞培养基和直接resuspended通过0.22过滤消毒μm膜。这些化合物不能溶解的介质,他们首先在DMSO溶液溶解,然后用新鲜的培养基稀释。最后DMSO浓度在中不到1%。CB的浓度和epigoitrin是50μg / mL和PEP的初始浓度和PEP +碱+ OA是100年μ克/毫升。

2.3。抗流感作用模式

CB的抗流感作用、epigoitrin和化学部分从菘蓝根提取了四种不同的模式:治疗作用,预防,直接病毒失活,抑制病毒附件。

2.4。预培养与病毒药物的治疗作用)

病毒的细胞被preinfected纯化合物或化学部分添加了植物提取物。药物的治疗作用是评估细胞病变效应(CPE)还原试验和细胞MTT试验。

CPE减少试验是根据以前的报告用细微的修改(18]。简单地说,一式四份MDCK单层细胞感染0.1毫升96 -孔板包含100 TCID悬挂₅₀(组织培养感染剂量50%)的病毒2 h。在肠道病毒然后用PBS冲洗掉。四倍的单层细胞随后被覆盖0.1毫升中包含不同无毒双重的连续稀释的纯化合物,化学部分菘蓝根提取物。细胞与病毒感染没有药物治疗和细胞没有病毒和药物被用作控制。板块在37°C下5%孵化有限公司₂72 h。光学显微镜下观察CPE占据相比,并行病毒控制和单元控制。

MTT还原试验根据执行标准协议(19]。简而言之,实验设置在CPE分析与程序相同。经过3天的孵化,20μL (MTT被添加到每个在37°C和孵化4 h。随后,添加DMSO和吸光度测量在570海里。细胞保护率(%)是由以下公式计算: 参见[16]。

2.5。用药物预处理(预防)

评估的影响从菘蓝提取纯化合物和化学部分细胞感染的预防,MDCK单层细胞96 -孔板覆盖不同无毒双重的连续稀释的纯化合物,化学部分菘蓝根提取物。四个复制设置为每一个治疗和控制。4 h后,测试物质从井中删除和100 TCID单层细胞被感染₅₀在37°C的流感病毒FM1 2 h允许病毒吸收。随后,在肠道病毒冲洗掉用PBS和同等数量的维护中添加到每个。板块在37°C下5%孵化有限公司₂72 h。光学显微镜下的观察CPE占据。

2.6。直接杀病毒的检测

的直接杀病毒的活动从菘蓝纯化合物和化学部分提取测试根据卡卢奇描述的方法等。20.]。一百毫升100 TCID₅₀病毒是平等对待卷的双重的稀释纯化合物或提取部分为2 h 37°C。样品被连续稀释10倍。MDCK细胞的融合性的单层形成时,幸存的病毒在CPE测定混合物决心和滴度(TCID₅₀根据Reed-Muench值)计算方法。

2.7。抑制病毒附件试验

MDCK细胞培养的单层96 -孔板。一百毫升水中不同无毒双重的连续稀释的纯化合物,化学部分菘蓝根提取物,相同体积的100 TCID₅₀病毒的同时添加到MDCK细胞(21]。孵化2 h后37°C,病毒/提取混合后从井中删除维护中添加。板块在37°C下5%孵化有限公司₂72 h。光学显微镜下的观察CPE占据。

2.8。统计分析

所有的实验都重复三次,每个国家都有五倍的决定。数据被表示为平均数±标准差。学生的以及进行控制和治疗之间的比较。的值被认为是显著差异(),被认为是非常重要的()。

3所示。结果与讨论

3.1。纯化合物的治疗作用和化学部分从菘蓝根提取物

为了研究治疗效果在流感病毒,病毒的细胞被preinfected 2 h紧随其后的抗病毒化合物和化学部分从菘蓝根提取物。溶剂空白,CB, epigoitrin和菘蓝根提取物的化学部分没有明显的细胞毒性(数据没有显示)。治疗行动被CPE化验和MTT试验评估。明显的细胞病变效应观察MDCK细胞FM1感染后72小时,如增加细胞之间的缝隙,破裂的细胞核,细胞(图的部分或完全崩溃2(一个)、病毒控制)。在病毒对照组,观察50%−75%的CPE(见表S1在网上补充材料http://dx.doi.org/10.1155/2016/2537294)。然而,MDCK细胞生长在药物治疗组(图2(一个)、利巴韦林、PEP +碱+ OA组)和CPE形成部分完全被抑制的稀释(表S1)。

MTT还原试验表明,CB, epigoitrin, PEP, PEP +碱+电脑耗材部分从菘蓝根提取物显著增加MDCK细胞的生存能力preinfected病毒与病毒对照组的所有稀释()(图2 (b))。clemastanin B的分子机制和epigoitrin抗病毒活动尚未完全了解。最近的一份报告显示,clemastanin B可能目标病毒内吞作用和保留核糖核蛋白(RNP)流感病毒的核(22]。有趣的是,四个治疗组的保护率显著高于在积极控制利巴韦林组相同的稀释()。这表明,化合物和从菘蓝根中提取部分有更好的治疗作用抗甲型流感病毒FM1比当前商业合成抗病毒药物病毒唑。此外,CB的保护作用,epigoitrin, PEP, PEP +碱+电脑耗材部分不存在剂量依赖的相关性。率最高的保护中观察到1:4稀释的CB, epigoitrin,或PEP的混合物+碱+办公部分,而PEP稀释1:8细胞生存能力都是最高的,次高(图2 (c))。不同的治疗组相比,PEP的混合物+碱+ OA部分(1:4)细胞保护率最高。

3.2。预防行动的纯化合物和化学部分从菘蓝根提取物

为了评估纯化合物和化学部分的影响从菘蓝根提取物预防甲型流感病毒,MDCK细胞治疗与CB系列稀释epigoitrin, PEP,分别和PEP +碱+办公自动化部分。4 h后,药物从井和删除100 TCID细胞被感染₅₀。观察CPE的形成和细胞生存能力是通过MTT试验来衡量的。CPE试验表明,没有形成明显的CPE MDCK细胞使用CB, epigoitrin, PEP, PEP +碱+电脑耗材部分所有的稀释(表S2)。

如表所示1预处理与纯化合物或化学部分菘蓝根提取所有的稀释显著提高的可行性MDCK细胞()。此外,与利巴韦林相比,天然化合物或有较高的木根提取物预防活动对流感病毒FM1 ()。细胞的生存能力是剂量依赖性增加了活力和PEP +碱+ OA(表部分1)。相比之下,保护率和细胞生存能力没有显著改变了CB的稀释和epigoitrin(从1:2比1:16)。在这项研究中使用的四种不同的天然产品,PEP部分显示最重要的保护作用与细胞保护率为263.467%。

3.3。直接杀病毒的纯化合物和化学部分的行动从菘蓝根提取物

接下来,我们研究了CB的影响,epigoitrin, PEP, PEP +碱+办公自动化部分的失活流感病毒FM1 37°C。在图所示的细胞没有治疗3(一个)和病毒控制图3 (b)。MDCK细胞感染流感病毒和CB cocultured, epigoitrin, PEP、PEP +碱+ OA显示固缩凝结甚至溶解(数字3 (c)- - - - - -3 (f))。幸存的病毒效价为0.01 TCID₅₀在所有的实验小组。然而,积极控制利巴韦林抑制CPE形成完全稀释水平(图3 (g))。这些观察表明,CB, epigoitrin、PEP和PEP +碱+ OA不能直接灭活流感病毒FM1即使在浓度1:2稀释。在先前的研究中,玄奘等人也发现假狂犬病病毒的抑制菘蓝叶甲醇提取物的提取并不是由于直接病毒失活(12]。

3.4。纯化合物的抑制活性和化学部分从菘蓝根提取物对流感病毒FM1附件

甲型流感病毒的附件主要是由两种类型的糖蛋白叫做血凝素和神经氨酸酶(23]。在这项研究中,我们调查是否天然化合物和化学部分从菘蓝提取物抑制病毒对宿主细胞。CPE化验的结果列在表。没有CPE形成所有的药物治疗组即使在最低浓度稀释(1:16)。结果表明,CB, epigoitrin PEP, PEP +碱+ OA部分有强烈抑制作用对甲型流感病毒结合MDCK细胞。

MDCK细胞的生存能力在72 h后感染的病毒和MTT比色与天然化合物同时治疗是减少化验。如表所示2,MDCK细胞的生存能力显著增加药物治疗的结果与病毒控制()。抑制病毒吸附到宿主细胞CB, epigoitrin, PEP是剂量依赖性的方式。CB的最大抑制作用、epigoitrin和PEP是观察1:2稀释,导致3.53,3.99,4.43倍的分别提高细胞生存能力。相比之下,PEP的细胞保护最高率+碱+ OA和积极控制利巴韦林组中发现1:4稀释。此外,结果表明,CB, epigoitrin PEP, PEP +碱+比利巴韦林OA更有效的抑制甲型流感病毒FM1附件(表2)。当比较四种天然化合物和化学部分,这是观察到PEP部分稀释1:2拥有的最大病毒抑制作用吸收,导致最高273.218%的保护。

定义的传统药用植物抗病毒机制包括抑制病毒复制,阻止病毒附件,直接灭活病毒,防止病毒感染(24]。在这项研究中,清楚地表明,CB, epigoitrin,鼓舞士气,或PEP +碱+ OA显示抗流感活动的治疗作用(抑制病毒增殖),预防和抑制病毒的附件。然而,差异观察在不同化合物抗病毒作用的主要模式和化学部分(图4)。例如,PEP的细胞保护最高率或PEP +碱+ OA的治疗作用(图4、PEP A1;PEP +碱+ OA, A1)。的主要抗流感模式epigoitrin是病毒增殖的抑制和病毒附件(图4epigoitrin A1, epigoitrin A3)。相比之下,三种模式的抗病毒CB贡献同样细胞保护作用。

CB是主要phenylpropanoid化合物菘蓝根和epigoitrin丰富的生物碱和菘蓝根的质量控制指标16]。以前的研究报道,绿茶的整体病毒抑制作用更强的植物提取总比单一纯化合物的提取由于可能的协同提取的成分之间的相互作用(18,25]。然而,我们的研究结果表明,抗病毒活性的变化之间的抗病毒机制的差异可能是因为提取的单一化合物和混合物。

4所示。结论

在目前的研究中,化学部分的抗流感作用模式和选民从菘蓝根提取研究。PEP,我们的研究结果表明,CB, epigoitrin或PEP +碱+ OA证明其抗流感活动的治疗作用,预防细胞,抑制病毒的附件。所有的化合物或化学测试部分没有直接杀病毒的活动。主要抗病毒模式PEP和PEP +碱+ OA是治疗作用,而epigoitrin主要抑制病毒增殖和附件。据我们所知,这是第一次报告的抗病毒机制的化合物和化学部分从菘蓝根提取物。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

Jia-Hang苏和Rui-Gang刁了同样的工作。

补充材料

引用

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