效果Dendrobium Officinale.提取对大鼠胃癌发生的作用

摘要

Dendrobium Officinale.（中文领带Pi Shi Hu）已被广泛用于治疗中国的不同疾病。抗癌效果是重要效果之一Dendrobium Officinale.．然而，其抗癌作用的分子机制尚不清楚。本研究以大鼠胃癌发生为研究对象Dendrobium Officinale.并对其药理作用机制进行了探讨。Dendrobium Officinale.摘录（4.8和2.4 给胃癌模型大鼠灌胃给药（g/kg），与模型组相比，高剂量给药组大鼠的胃粘膜上皮细胞数量明显减少Dendrobium Officinale.提取物显著抑制了癌变率。进一步的分析表明Dendrobium Officinale.通过调控DNA损伤、氧化应激和与癌变有关的细胞因子，诱导细胞凋亡，从而达到预防胃癌的目的。

1.介绍

胃癌是世界上第四大最常见的癌症原因，也是第二大癌症致死原因[1.]虽然胃癌的发病率在过去十年中有所下降，但它仍然是发病率和死亡率的主要原因[2.].每个致癌阶段的抑制、逆转或延长将有助于预防胃癌侵袭性恶性肿瘤的发展。

化学预防是一种重要的方法，用于降低癌症发病率和死亡率。中医（TCM）治疗或预防癌症的潜在理论是通过改变多种癌症事件来使患者恢复健康状态[3.］.许多中药产品都有化学预防作用[4.),如银杏叶提取(5.，茶多酚[6.]、表没食子儿茶素-3没食子酸酯(EGCG) [7.]，姜黄素[8.]，郁金[9和番茄红素[10对胃癌前病变的进展有介入作用。

Dendrobium Officinale.属于兰科的家庭，在中国使用超过一千年[11］.生的和加工过的Dendrobium Officinale.用于医疗保健产品[12].主要组成部分Dendrobium Officinale.包括水溶性多糖、菲和许多氨基酸[13］.Erianin和Chrysotoxene的高含量抑制了肝癌和腹水癌细胞的生长[14］.d . officinale显示体外对HeLa S3人宫颈癌细胞、HCT-116癌细胞和HepG2肝癌细胞的抗癌作用[15,16］.近年来，研究人员发现d . officinale对肺转移和结肠癌的形成也有预防作用[17,18］.先前的一项研究表明，口头管理局Dendrobium Officinale.提取(DOE)可降低mnng诱发大鼠的发病率。结果表明，DOE能抑制胃癌细胞异常增殖，诱导细胞凋亡，上调促凋亡基因Bax。可下调胃癌中抗凋亡基因Bcl-2和增殖基因，如EGF和EGFR [19］.然而，mnng诱导的胃癌发生过程中，其抗增殖和诱导凋亡的机制尚不清楚。本研究将解释其中的分子机制Dendrobium Officinale.介导抗氧化、凋亡和DNA氧化损伤的表达，以及一些与肿瘤发生相关的细胞因子。

2.材料和方法

2．1．材料和化学物质

Dendrobium Officinale.（批号：SXG13208）购自浙江寿西安谷药业有限公司，经中华人民共和国药典（2010）柯中盾副教授（江西中医药大学鉴定部）认证。标准品沙夫糖苷（批号：140402）、异沙夫糖苷（批号：141025）和维京宁3（150122）由威克奇生物技术有限公司（中国成都）提供。N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍（MNNG）（批号：MV340RC）购自东京化学工业公司。用于测定谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）（批号：20141124）、丙二醛（MDA）（批号：20141107）和超氧化物歧化酶（SOD）（批号：20141115）的检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所（中国南京）。8-羟基-2-脱氧鸟苷Elisa试剂盒（8-OHdG）（批号：20141008）和白细胞介素2（IL-2）（批号：20141108）从新生物科学公司（中国深圳）获得。细胞因子抗体微阵列（大鼠细胞因子阵列C2）（批号：115167103）由RayBiotech（美国）提供。抗Bcl-2（批号：G1315）和Caspase-3（批号：D2315）的抗体购自Santa Cruz Technology（美国德克萨斯州达拉斯）。Bax抗体（批号：GR151406-13）购自美国德克萨斯州达拉斯市Abcam技术公司。GAPDH（批号：D16H11）和二级抗体购自细胞信号技术公司。BCA蛋白分析试剂盒（批号：00121506）购自Cwbiotech Technology。蛋白质梯架（批号：00275697）由赛默飞世尔科技公司提供。

2．2.动物

我们试验中使用的大鼠由北京伟通利华实验动物研究中心提供。48只雄性Wistar大鼠，8-10周龄，体重110-120克。在试验前，大鼠在室温（22°C）下在实验室中分组饲养.这些动物是按照用于护理和使用动物的指导原则．

2.3。植物提取物的制备及质量控制

新鲜Dendrobium Officinale.加入20倍的水体积，通过搅拌2小时萃取三次。使用旋转蒸发器蒸发萃取，通过喷雾干燥制造功率。Dendrobium Officinale.将萃取粉末（0.1g）溶于15％乙腈，并萃取30分钟的超声声。将溶液通过0.45过滤 μm微孔膜和滤液收集为样品溶液。标准沙夫糖苷、异沙夫糖苷、维京宁3和柚皮素溶解在30%甲醇中。最终浓度为100 μg / mL, 100μg / mL, 100μ克/毫升和200μ分别g / mL。采用C18色谱柱(250 mm × 4.6 mm, 5μm)的高效液相色谱(Shimadzu LC-20AT)。流动相为乙腈(A)和0.1%冰醋酸溶液(B)，流速为0.8 mL/min。柱温保持在30°C。梯度洗脱为0 ~ 25 min 14% B, 25 ~ 35 min 14% - 18% B, 35 ~ 76 min 18%-45% B。schaftoside、isoschaftoside、vicenin 3检测波长为335 nm，柚皮素检测波长为270 nm。注射量为10μL表示每个分析。

２.４.抑制作用的影响Dendrobium Officinale.关于大鼠N-甲基-N'-硝基 - 硝基壬磺酸胍诱导的大鼠胃癌的进展

48只Wistar大鼠随机分为4组()：正常对照组（正常）、GC模型但未治疗组（模型）和Dendrobium Officinale.提取(DOE)组(2.4 g/kg和4.8 g/kg)。对照组大鼠给予蒸馏水作对照。各组大鼠灌胃1小时后，经导管灌胃MNNG 200 mg/kg。每10天给药一次，连续给药3个月(20-21)。d . officinale如前所述，连续三个月每天服用。每周记录大鼠体重。3个月后，夜间禁食后腹腔注射硫喷妥钠处死所有动物。取下腔静脉血清，于2000年离心十年 将胃分为两部分，一部分用于HE染色，另一部分保存在室温下−80°C用于Western blot分析，实验方案经江西中医学院动物伦理委员会批准。

2.5.血清中8-OHdG和IL-2的分析

使用大鼠8-OHdG和IL-2 Elisa试剂盒测量血清中8-OHdG和IL-2的浓度。简单地说，将生物素化抗体试剂添加到96孔培养皿中，然后添加均质血清的上清液，并将培养皿在37°C下培养2小时 h、 在用磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤后，添加链霉亲和素-辣根过氧化物酶（HRP）溶液，并将平板培养1小时 在室温下测定吸光度 纳米使用微板阅读器。

2.6.血浆中SOD、MDA和GSH-PX的分析

用黄嘌呤氧化酶测量SOD活性;MDA含量通过存在硫酰比尿酸反应性物质（TBAR）来测量，通过DTNB测量GSH-PX活性。所有通过使用相应的试剂盒通过比色方法确定。

2.7。细胞因子的微阵列分析

根据制造商的指南，使用细胞因子抗体微阵列分析血清中的细胞因子水平[20.］.对每个样品进行显影和扫描后，拍摄图像质量最佳的薄膜照片，并通过凝胶成像系统和图像分析进行分析。最后，将每个膜记录的结果归一化。细胞因子的信号密度分析采用多变量方差分析和事后检验。值小于0.05被认为是显著的。

2.8。胃组织蛋白提取及Western Blot分析

使用RIPA缓冲液获得胃组织总蛋白，并使用BCA蛋白分析试剂盒（Cwbiotech，中国）测定蛋白质浓度。对于Western blot分析，50 μ通过SDS-PAGE分离g蛋白并转移到硝化纤维素膜上，然后用5%脱脂乳封闭，并用Bax、Bcl-2和Caspase-3一级抗体染色（稀释1 : 膜进一步与辣根过氧化物酶结合的二级抗体（稀释1 : 10000）一次 用PBS吐温洗涤印迹三次，然后使用Prolight HRP western印迹检测试剂（Cwbiotech，中国）通过ECL开发。

2.9.统计分析

数据以平均值±SEM表示。统计差异采用单因素重复测量方差分析(ANOVA)，然后邓肯多重范围作为事后检验。组间的差异被认为有显著差异值小于0.05。

3.结果

3.1.通过HPLC控制DOE的数量

如图所示1.结果表明，schaftoside、isoschaftoside、vicenin 3的浓度在5 ~ 100之间呈良好的线性关系μg / ml，柚皮蛋白是10-200 μ四组分的方法学研究结果表明，该方法符合测定要求，样品中山莨菪碱、异山莨菪碱、山莨菪碱3和柚皮素的含量为6.862 μ7.5858 g / mL,μ217.7355 g / mL,μg/mL和12.7902 μ分别为g/mL（图1.）.

3.2。胃癌发病率和身体变化

整个研究期间，阳性组4只，高剂量组2只，喂养7 ~ 10周后误吸死亡。尸检显示双肺充血、出血点，前胃黏膜角化过度，组织学检查未见癌前病变或肿瘤形成。42只大鼠存活至第12周。组织病理学检查在以前的研究中有报道[19]，提示模型组胃癌发生率为41%。DCE可降低肿瘤发生率，促进肿瘤生长。在此期间，所有组的体重没有显著变化(图)2.）.

3.3。DOE减毒发育与8-OHDG和IL-2表达相关的致癌物

如图所示3.，IL-2和8-OHDG的表达在正常和现代组之间显着差异。有发现两剂DOE可以抑制8-OHDG（,)，高剂量DOE可使IL-2较模型组显著升高(）.

3．4．血浆SOD、MDA、GSH-PX分析

如图所示4.与正常组相比，胃癌组GSH-PX和SOD活性降低(）MDA活性显着增加（)治疗12周后，DOE组GSH-PX活性显著升高(;）和SOD（;）.DOE组MDA活性显著降低(;）.

3.5。来自Mnng诱导的模型组和DOE治疗组测量的血清中细胞因子的相对表达水平

RayBio大鼠细胞因子阵列C2微阵列可以同时检测34种炎症相关细胞因子。与正常组相比，mnng诱导胃癌组细胞因子的信号密度上调，包括激活素A、Agrin、IL-1α（两个都), ICAM-1 ()，和TIMP-1(）.但是，IL-10的表达水平降低（）.LIX、MCP-1、MMP-8、CXCL7等细胞因子升高，但无显著差异。在DOE治疗组，大多数炎性细胞因子信号密度下调，包括激活素A、Agrin、TIMP-1(两者均下调))和ICAM-1 ()，但IL-10升高(）.

3.6。大鼠胃中Bax，Bcl-2和Caspase-3的蛋白质表达

由于Bax、Bcl-2和caspase-3是参与细胞凋亡的关键蛋白，因此对细胞凋亡的影响d . officinale检测Bax、Bcl-2和caspase-3的表达。与模型组比较，大鼠给药后Bcl-2蛋白含量迅速恢复d . officinale在4.8和2.4 g/kg，持续12周(;)此外，模型组Bax和Caspase-3的表达降低d . officinale在4.8和2.4 g/kg时，Bax蛋白(,)及Caspase-3 ()显著增加。

4.讨论

Dendrobium Officinale.Kimura et Migo排名为“九个中国童话草本中的第一个”。d . officinale具有一些重要的药用价值，可以维持胃的滋补，促进体液的产生，减少周围血管的阻塞，增强免疫系统。广泛应用于抗肿瘤、抗衰老、调节血糖、治疗胃病等方面[21,22].一些质量控制方法已被报告用于d . officinale．Zhou et al. [23HPLC-DAD-ESI-MS鉴定了8种黄酮二c苷d . officinale其中芹菜素和单糖与C-6和C-8相连。Chen等[24]中联苯类化合物、菲类化合物和黄酮类化合物的含量，用于植物的鉴定芽筋Chu等人[25]通过结合正常和荧光显微镜来确定快速而简单的方法d . officinale．建立了同时测定柚皮苷、异柚皮苷、柚皮苷3和柚皮苷含量的方法d . officinale通过HPLC-UV。疏皂甙，isoschaftoside和vicenin 3显示出5-100之间的良好线性关系 μg / ml，柚皮蛋白是10-200 μ克/毫升。样品中schaftoside、isoschaftoside、vicenin 3和柚皮素的浓度均为6.862μ7.5858 g / mL,μ217.7355 g / mL,μg/mL和12.7902 μ分别为g/mL（图2.）.

ROS的产生和增加以及DNA氧化损伤与胃粘膜的损伤和恶性转化有关[26］.天然物质的抗氧化特性会显示出对癌变过程的治疗和预防作用，如天然抗氧化剂人参皂苷和姜黄素[27,28］.我们最近的工作报告说d . candidum可以预防mnng诱发的胃癌[19］.一些研究人员报道了它对其他癌症的预防作用。例如，Wang等人[18)报道,d . candidum墙采用交货。通过增加Bax、Caspase-3、Caspase-9和减少Bcl-2，对小鼠结肠癌发生具有预防作用。

细胞因子在炎症细胞的生长和分化中起着重要的作用，它参与了大多数疾病的过程，包括癌症。细胞因子芯片可以检测血清和尿液中的蛋白表达。在我们的结果中，激活素A, Agrin, IL-1的表达α、ICAM-1、TIMP-1表达上调，IL-10表达降低。口服DOE后，大多数炎性细胞因子信号密度下调，包括激活素A、Agrin、TIMP-1和ICAM-1 ()(图5.）.IL-10也增加。有研究报道激活素信号通过smad依赖途径诱导生长抑制和细胞凋亡[29,30.］.相反，有几篇文章报道INHBA表达上调可能促进几种癌症的癌细胞增殖，血浆中激活素A水平可能与临床癌症进展有关[31–34此外，细胞间粘附分子1 (ICAM-1)在胃癌和肿瘤进展中上调，与预后不良相关[35,36］.基质金属蛋白酶-1（TIMP-1）的组织抑制剂在胃癌中过表达，血清中的TIMP-1水平被认为是胃癌患者预后的标志物[37]因此，降低TIMP活性是调节肿瘤发展和转移的有效方法[38］.在我们的研究中，mnng诱导的胃癌患者血清ICAM-1和TIMP-1水平高于正常组．d . officinale激活素A、Agrin、TIMP-1(两者)降低)和ICAM-1 (），IL-10增加（）.其他细胞因子LIX、MCP-1、MMP-8、CXCL7在胃癌模型中升高;然而,d . officinale没有显示出对这些细胞因子的显著影响(图5.）.

诱导细胞凋亡似乎与它们在调节致癌过程中的有效性相关[39,40]Bcl-2家族包括启动子（Bax和Bid）和抑制剂（Bcl-2和Bcl-xL），是线粒体介导凋亡的关键调节因子。在我们之前的研究中，我们已经报道模型组中Bax基因水平降低，而Bcl 2基因水平升高。治疗后使用d . officinale， Bax升高，Bcl 2降低。本文通过western blot检测Bax、Bcl 2和Caspase-3蛋白的表达，进一步证实了这一点d . officinale在4.8和2.4 g/kg对Bax的表达有较强的促进作用(,)及Caspase-3 (）.也降低了Bcl-2 (,)，从而促进细胞凋亡，预防胃癌的发生(图6.）.

总之，这项研究表明d . officinale可下调mnng诱导大鼠胃癌发生过程中MDA和8-OHdG的表达，上调GSH-PX和IL-2的活性。和d . officinale还降低了激活素A、Agrin、IL-1的水平α、ICAM-1、TIMP-1，上调IL-10水平。另外, officinale增加了Bax和Caspase-3的蛋白质水平，并降低了Bcl-2的表达。目前研究的结果与我们之前的研究结果相结合，表明d . officinale具有抗氧化作用，可调节与肿瘤发生有关的细胞因子，并诱导细胞凋亡。这些实验结果表明d . officinale可以作为一种化学预防药物来降低胃癌的风险。

相互竞争的利益

提交人声明他们没有利益冲突。

作者的贡献

赵毅和刘艳对这一工作的贡献是相同的。赵毅构思了设计，进行了微阵列分析，并起草了手稿。刘洪宁负责研究工作，并对研究设计提出建议。Yan Liu参与并完成了植物提取物、Western blot、RT-PCR的质量控制。兰希明参与动物饲养、给药、HE分析。徐国良对质量控制提出了建议。孙友志参与手稿撰写。李飞在研究设计和提交过程中给出了专家意见。所有作者阅读并批准了最终的手稿。

致谢

本项目得到了江西省罗迪工程（KJLD120）、江西省省自然基金重点项目（20152ACB200 21）、国家自然科学基金（81360509和81360513）、中国千禧中国青年人才计划等项目的支持。

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