效果α- 用于延迟后掺杂和异丙酚处理的小鼠心肌细胞的延迟后的延迟后的运动

摘要

客观的．研究…的效果α异丙肾上腺素(ISO)对小鼠延迟后去极化(DAD)发生率和触发活性(TA)的影响方法．鼠标心室肌细胞分离。和心室肌细胞的细胞电生理特性进行了研究。结果．我们发现，在小鼠肌细胞中的父亲和TA的发病率被ISO治疗增加。在鲜明的对比度下，在肌细胞中很少观察到触发的心律失常事件10 μ所有治疗。瞬态内向电流()在ALL治疗后显著降低，导致与父亲相关的心律失常。与iso处理组相比，l型钙电流(）密度，曝光之后降低至ALL，用较慢的活化，更快的失活​​，并从灭活动力学恢复的较长的时间常数沿。结论．ALL治疗的心室肌细胞触发的心律失常事件较少。这种效果可能与抑制和．

1.介绍

人们普遍认为，延迟后去极化(dad)和触发活动(TAs)的发生率在心力衰竭患者中显著增加[1那2]．DAD介导的TA被认为是通过促进细胞内钙发挥异常自律性具有重要作用，这将导致非缺血性心脏衰竭在多数心脏性猝死^2＋过载。dad介导的TA导致钠钙交换剂(NCX)的激活，从而挤出Ca^2＋交换Na⁺并产生净向内流(） [3.那4.]．较大的在生产中起着至关重要的作用．诱发可能达到阈值并引发早搏的父亲[5.]．目前，对触发性心律失常尚无有效的治疗策略。临床可用的抗心律失常药物的治疗指标较窄，这表明研究人员需要探索替代药物的安全性和有效性。

α- 从中​​提取四氢丙氨酸的衍生物，从中提取延胡索斜卧（Thunb。）pers。罂粟科(6.]．既往研究表明ALL在各种动物模型中具有抗心律失常作用，这可能是由于ALL在延长动作电位持续时间方面的电生理作用[7.]．然而，目前尚不清楚ALL是否能降低心室心肌dad和TAs，以抵抗触发性心律失常的发展。本研究采用全细胞膜片钳技术研究ALL对小鼠心室肌细胞dad和TAs的作用及机制。

2。材料和方法

所有实验程序和方案都是按照中国动物实验法进行的，并得到中国人民解放军总医院动物实验委员会的批准。本研究符合美国国立卫生研究院发布的《实验室动物护理和使用指南》(NIH出版物编号85-23,1996年修订)。

2．1.异隐碱的制备和治疗

Alpha-allocryptopine (ALL，公式如图所示1)由兰州大学药学系提供(分子量365)，熔点168°C，为白色结晶粉末，纯度99.0%。将ALL溶于二甲基亚砜(DMSO)中，得到1.0 M的原液。在最大浓度为0.5 mM时研究ALL的影响。根据最高使用的药物浓度，将DMSO添加到培养基中，最终浓度为0.1%。将原料药溶液加入培养基或浴液中，生成本节所述的最终浓度3.．

２.２.膜片钳实验

使用已建立的酶消化方案分离小鼠心肌细胞。重悬细胞粒料并在层粘连蛋白涂覆的35mM菜肴上涂覆并镀。只有静态，加利福尼亚州^2＋-耐受性细胞，使用杆状细胞。如前所述，使用MultiClamp 700B放大器(Axon Instruments)在全细胞结构中记录跨膜动作电位和电流[7.]．对液体连接电位(平均为−10 mV)的校正仅适用于静息电位和反转电位值。

使用MultiClamp 700B放大器(Axon Instruments)全细胞膜片钳技术记录动作电位和电流。数据在10khz取样，随后在5khz过滤用于分析(Digidata 1440A, Axon Instruments)。用P-97水平拉出器(Sutter Instruments)从硼硅酸盐玻璃上拉出贴片吸管。用2 MΩ~5.5 MΩ的电阻电极记录动作电位和电流。常规串联电阻补偿值>80%，以减少电压钳位误差。因此,无报酬的< 2 MΩ。在每个细胞上测量了膜电容，并以初始值的80%~90%进行补偿。

2.3。心肌细胞的刺激参数

用1.5 nA去极化脉冲电刺激肌细胞3ms。以1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 Hz频率的30列超阈值电流脉冲在电流钳下诱导心肌细胞产生动作电位。DAD定义为动作电位后，在舒张期(第4期)立即发生>5 mV、>10 ms的去极化。TA被定义为由dad产生的自发动作电位。

记录瞬时向内电流(), serial voltage steps were preceded by 20 conditioning pulses with each pulse lasting 150 ms from −80 mV to +50 mV at intervals of 100 ms. Following conditioning, serial voltage steps were applied for 2 s from −100 mV to +30 mV at 10 mV increments. Successive trains were 6 seconds apart.测量幅度作为瞬态电流的峰值与瞬态电流的差，第一峰进行分析。

使用0.05mm TTX的细胞外溶液抑制NA⁺电流和5.0 mM csl抑制K⁺l型钙电流() was recorded with 200 ms depolarizing pulses from a holding potential of −40 mV, with 10 mV steps from −40 mV to +60 mV. Current-voltage (-)曲线由−40 mV的保持电位在10 mV电压阶跃(−40 mV至+60 mV)下得到。

２.４.统计分析

使用SPSS 17.0进行统计分析。单因素方差分析与Bonferroni事后测试或学生的- 最低使用。Chi-Square测试（Fisher精确测试）用于比较爸爸和TAS发生的差异。数据表示为平均值±SEM。被认为是统计学意义的。

结果

3.1。DADs的和TA发生率在所有治疗小鼠的鼠心室肌细胞

在快频率起搏脉冲(5.0 Hz)下，30 nM ISO处理后20%(5/25)心肌细胞产生dad(图)2（a）和2（b））.当给予10 nM ALL时，30 nM ISO处理心肌细胞的dad发生率显著降低(9%，3/25，,数据2（a）和2（b））.只有4%未处理的肌细胞有dad(1/25，图2（a）和2（b））.在ISO处理的细胞中观察到12%的TA事件。在给予ISO的肌细胞中，然后用10μM ALL，只有4%发生TA事件(,数据2（a）和2（c））.

3.2。对DADs的和TA发生率ALL的频率特性

Action potentials were recorded from ventricular myocytes that were stimulated at 1 to 5 Hz. Figure3（a）在每一个起搏频率显示30个连续驱动动作电位，当起搏停止时，dad和TAs的发展。在较快的起搏频率后观察到dad和TAs。与对照组心肌细胞相比，30 nM ISO处理后dad和TAs的发生率呈进行性增加。接触10个DADs或TAs的数量减少μM ALL，在高频刺激时这种效果更显著(图)3（b）和3（c））.

３．３．对ALL治疗小鼠心室肌细胞的影响

众所周知，爸爸的出现是由于教唆．评价…的作用在DADs的和TA的发展，我们录其中三组。相比于对照细胞，有一个显着增加在30nm ISO曝晒下发现。平均而言，峰值电流密度从PA / pF到PA / pF和显着降低10 μ米都pA / pF (那,数据4（a）和4（b））.电流 - 电压关系曲线表示最大的向内电流密度电位为−60 mV。同时，电流密度与ISO处理的肌细胞有更多的肌细胞，与未经治疗的肌细胞相比，从-80mV到-20 mV范围内。所有治疗都减少了肌细胞中电流的ISO诱导的升高（图4（c））.

3．4．对ALL治疗小鼠心室肌细胞的影响

由于DAD事件被ISO和ALL处理增强，我们主要测量l型钙电流。的三组电流如图所示5（a）．的电流密度30 nM ISO处理的心肌细胞明显变大pA/pF在对照组和pA/pF in the ISO-treated group at 0 mV of test potential.减少到PA / pF的在ISO处理的肌细胞即进行cotreated用10 μM of ALL (那， 数字5 (b)）.ALL的浓度依赖性抑制上如图所示5 (c),集成电路₅₀：μM和希尔系数：0.84。的电流 - 电压关系证明的该电流密度在- 20 mV至+20 mV范围内，ISO处理的心肌细胞明显大于对照组心肌细胞。这种效果减轻了10μM ALL处理(图5 (d)）.

稳态活化曲线和稳态失活曲线由玻耳兹曼方程函数拟合。稳态活性的曲线was shifted to more negative potential in the presence of 30 nM ISO. Meanwhile, the steady-state inactivated curve was shifted to more positive potential by ISO treatment (Figures6(一)和6 (c)）.这表明了一个较慢的激活过程和较快的失活过程．稳态(in)活化曲线的变化被10μ购物中心。和三组间有显著差异，而和三组的值无显著差异(图6 (b)和6 (d)）.

从灭活恢复快在ISO治疗的肌细胞中逆转10点 μ所有治疗。在ISO之前和之后的灭活和所有治疗前后恢复的代表性电流被记录并显示在图中7(一)．从失活的平均恢复时间常数在对照组中，在iso处理的肌细胞中，和ms分别与ISO和ALL共同处理的肌细胞(那， 数字7 (b)）.

4.讨论

本研究的主要发现是小鼠心室肌细胞在10小时内表现出较低的iso诱导的dad和TAs发生率μ这表明ALL具有潜在的抗触发性心律失常作用。随着异丙肾上腺素和高钙的加入，心室肌细胞中的dad很容易诱导TAs [8.]．此外，在孤立的小鼠心室肌细胞中，所有在抑制爸爸和达达诱导的TA的效果在很大程度上依赖于较高脉冲频率的较强的抑制作用。

一般认为父亲是由自发的Ca发起的^2＋从肌浆网(SR)和Ca^2＋-激活瞬态、去极化的内向电流(） [9.那10]．一些钙^2＋已经提出了激活的电流参与，即NCX交换（)及钙活化氯通道(） [11那12]．最近，Asakura等人[4.]报道兰诺定受体结果的活化在一个显式的Ca^2＋由阈下Ca发起的释放^2＋积累和逐步积累，这将迅速增加DAD事件的发生率。在心力衰竭期间，有证据表明有一个增加的幅度和和NCX交换蛋白可以翻倍。加在一起，这个数字会增加并将双振幅，使细胞向TA阈值去极化。在舒张期诱发dad，可通过达到阈值电位触发早搏。在非缺血性心力衰竭期间，触发性心律失常导致大多数心源性猝死[2]．我们的数据表明所有的压制DADs的和能力DAD引起的TA，并且这种影响可以通过它的作用来解释，以减少电流。受刺激肌细胞的电流-电压关系显示细胞密度向内ALL在−80 mV ~ 0 mV范围内减小，在−60 mV处减小峰值电流最大。较低的振幅导致父亲和随后父亲诱导的助教事件减少。

心力衰竭，对于心脏的电和生化功能所必需的，因为它们是钙的主要途径^2＋将流入心脏肌细胞。我们发现了一个值得注意的人在ISO处理下心肌细胞增加。稳态活性的曲线被移至负电位，而稳态灭活曲线被ISO治疗移位为正电位。通道门控的主要机制是从ISO处理细胞中失活的恢复较短的时间常数。延长失活的恢复时间常数延长，稳态（in）活化曲线的变化通过所有治疗逆转。此外，ISO的增加效果由所有较少DAD事件的响应缓解。由于这些原因多，对所有的影响和可通过减少dad的发生来减弱异源性心律失常的发生。

由于其潜在限制，本研究中的数据应谨慎解释。首先，采用正常的小鼠心室肌细胞来确定所有爸爸和TAS的效果。如我们所知，触发的心律失常易于在心力衰竭中发展。很难在小鼠中建立心力衰竭模型，但正常的细胞不镜像疾病状态。因此，应在未来的研究中采用与心力衰竭小鼠分离的心室肌细胞。其次，爸爸和TA事件受到许多电流的管制那那那， 和[13那14]．我们只研究了和在这项研究中。ALL对其他电流的影响还有待进一步研究。

综上所述，ALL治疗小鼠心室细胞dad和TA事件降低。这些细胞表现出较低心律失常发生率的潜在机制尚不清楚。一种可能的解释是导致NCX交换剂抑制并生成．另一方面，ALL直接阻断电流。总之，这些影响将解释ALL降低小鼠dad和TAs发病率的原因。

信息披露

徐斌是第一作者。

免责声明

资助方在研究设计、数据收集和分析、决定发表或论文准备方面没有作用。

利益冲突

没有相互竞争的利益需要宣布。

作者的贡献

徐斌、傅义成、刘丽对这一工作贡献相当。

承认

这项工作是由中国国家自然科学基金（编号81170177，81030002和8147054）的支持。

参考文献

1. S. Despa和D. M.不同Bers，“纳⁺在正常和衰竭的心脏中运输——记住平衡，”分子和细胞心脏病学杂志， vol. 61, pp. 2-10, 2013。查看在：出版商的网站|谷歌学者
2. 工程学系。吴,研究。Chen, S. Higa和c - i。Lin， "健康叙利亚仓鼠心室肌细胞的瞬时振荡电流与肌病叙利亚仓鼠心室肌细胞的瞬时振荡电流"临床和实验药理学和生理学第31卷第1期10，页668-676,2004。查看在：出版商的网站|谷歌学者
3. Y.-T。赵，C. R. Valdivia, G. B. Gurrola, J. J. Hernández, H. H. Valdivia，“ryanodine受体通道病的致心律失常机制”，科学中国生命科学，卷。58，不。1，第54-58，2015年。查看在：出版商的网站|谷歌学者
4. K. Asakura, C. Y. Cha, H. Yamaoka等，“通过开发一种新的人类心室细胞模型分析EAD和DAD机制，”生物物理学与分子生物学进展，卷。116，没有。1，第11-24，2014。查看在：出版商的网站|谷歌学者
5. M. Fukuda, T. Yamamoto, S. Nishimura等，“增强钙调素与RyR2的结合可纠正cpvtt相关肌细胞中致心律失常通道障碍”生物化学和生物物理研究通信，第448卷，第2期。1, pp. 1 - 7, 2014。查看在：出版商的网站|谷歌学者
6. Y.-z.陈，G.-Z.刘，沉，B.陈和J.-G。曾，“Macleaya Cordata（Willd”）中的生物碱分析。使用高性能液相色谱法与二极管阵列检测和电喷雾电离质谱法，“色谱学报A，卷。1216，没有。11，第2104至2110年，2009年。查看在：出版商的网站|谷歌学者
7. 李勇，王磊，刘鹏，薛庆，“异隐碱对动物心律失常和豚鼠乳头肌动作电位的影响”，中国老年多器官疾病的老年，卷。4，第123-126，2005。查看在：谷歌学者
8. Y.-k.林，Y.-c。陈，J.-H.黄等人，“瘦素调节电生理特性和心房肌细胞异丙肾上腺素引起的心律失常，”生物医学科学学报，卷。20，2013年第94,201,013。查看在：出版商的网站|谷歌学者
9. D. Terentyev, J. A. Rochira, R. Terentyeva, K. Roder, G. Koren，和W. Li，“肌浆网Ca^2＋释放是必要的和足够的心室肌细胞SK信道激活，”美国生理学杂志-心脏和循环生理学，第306卷，第306号5、pp. H738-H746, 2014。查看在：出版商的网站|谷歌学者
10. A.Llach，C.莫里纳，J.Fernandes，J.Padró，J.Cinca和L. Hove-Madsen，“肌肉网和L型Ca^2＋通道活性调节钙在人心房肌细胞处理的节拍到搏动稳定”生理学杂志，卷。589，没有。13，第3247-3262，2011。查看在：出版商的网站|谷歌学者
11. MW. A. O.维科克Veldkamp和A. C. G. van Ginneken，“Cl^-目前的封锁基于延迟的后谐波减少了触发活动“荷兰心脏杂志》，第9卷，第5期。4-5页，172-176页，2001。查看在：谷歌学者
12. o.f. Köster, G. P. Szigeti, D. J. Beuckelmann， " a [Ca^2＋]_一世在缺乏钠的情况下，人心房和心室心肌细胞的-依赖电流⁺和K⁺，“心血管研究号，第41卷。1，页175-187,1999。查看在：谷歌学者
13. G. Szigeti，Z.Rusznák，L.Kovács和Z.Papp，“钙激活的瞬态膜电流主要由兔心的孤立的心房，心室和Purkinje细胞中的氯离子携带”实验心理学，第83卷，第83期2，第137-153页，1998。查看在：出版商的网站|谷歌学者
14. A. C. Zygmunt, R. J. Goodrow，和C. M. Weigel，“I Na(Ca)和ICl(Ca)有助于异丙肾上腺素诱导的心肌细胞延迟去极化后，”美国生理学杂志，卷。44，PP。H1979-H1992,1998。查看在：谷歌学者

版权

版权所有©2015年许斌等人。这是分布下的开放式访问文章创意公共归因许可证如果正确引用了原始工作，则允许在任何媒体中的不受限制使用，分发和再现。