文摘

Platycodin D Platycodi基数的主要药理成分,通过氧化应激防御机制来显示不同的药理活性。这里,可能的抗肿瘤、anticachexia和免疫调节活动platycodin D H520上观察肿瘤cell-bearing无胸腺的裸体小鼠后确认在体外细胞毒性。Platycodin D剂量水平的口头管理200年,100年和50毫克/公斤,一天一次的35天植入后15天。结果与吉西他滨160毫克/公斤腹腔内治疗小鼠(每隔7天)。Platycodin D显示良好的细胞毒性影响H520细胞,也存在剂量依赖的相关性减少凋亡细胞的肿瘤体积和重量增加(caspase-3和PARP immunopositive细胞),伊诺和TNF -α免疫反应性,减少群众的cox - 2在肿瘤免疫反应性。Platycodin D还显示存在剂量依赖的相关性免疫刺激性和anticachexia效果。吉西他滨显示有利cytotoxity H520肿瘤细胞和相关在活的有机体内抗肿瘤作用但在H520加重癌症恶病质和抑制免疫反应相关肿瘤cell-bearing无胸腺的裸小鼠。综上所述,认为口服治疗platycodin D的强有力的抗肿瘤活动H520细胞通过直接细胞毒性效应,增加肿瘤细胞的凋亡和免疫刺激性影响,可以控制癌症恶病质有关。

1。介绍

肺癌目前是全世界癌症死亡的主要原因(1),手术切除治疗通常只适用于早期疾病。所有阶段的肺癌5年生存率仅为15% (2]。大约有85%的肺癌患者属于非小细胞肺癌(NSCLC)组织与预后不良(3]。目前先进的肺癌治疗策略包括手术切除、辐射、细胞毒性化疗,,最近,光动力治疗(4]。虽然结合化疗和放疗可以提高生存,大多数病人死于疾病进展,经常造成收购或内在抗化疗药物(5]。此外,在几乎三分之二的情况下,癌细胞已经扩散超出局部疾病诊断的时候(6,7),限制治疗的选择。恶病质的特点是主要的代谢异常和不适应。通常食物/减少能量的摄入,静息能量消耗增加,分解代谢加速(8]。恶病质是厌食症,脂肪和肌肉组织浪费,逐步恶化的生活质量(9]。多达80%的病人与癌症恶病质死亡之前,发展,在这些患者中,超过20%的恶病质是死亡的主要原因10,11]。t细胞介导的抑制免疫反应直接相关癌症出现或癌症患者显著的免疫抑制也观察到(12,13),最近,刺激或增加身体的免疫系统作为癌症治疗的新治疗方案的突出显示(14,15]。

天然草本植物含有多种酚类化合物、维生素、类胡萝卜素和黄酮类化合物,他们显示不同的药理作用包括ant-oxidative,抗过敏药,和抗癌效果16]。Platycodi基数的根源桔梗(Jacq),使用传统的祛痰剂和治疗支气管炎、扁桃体炎、喉炎、化脓性皮炎在中国,韩国,日本。在中国和韩国,新鲜的根源p .羊藿对预防肥胖一直吃泡菜(17]。Platycodin D的主要药理成分Platycodi基数(18),显示良好的抗氧化作用介导的抗糖尿病的(19,抗炎20.],antinociceptive [21),和免疫调节22)活动。特别是,platycodin D显示良好的抗肿瘤作用对A549细胞和adenocarcinomic人类肺泡基底上皮细胞(23,24),但H520细胞的抗癌效果,非小细胞肺癌细胞株platycodin D代表,并没有显示在我们的知识。在这项研究中,platycodin D的细胞毒性的评价在体外实验,然后,潜在的抗肿瘤活动观察使用H520肿瘤细胞轴承无胸腺的裸小鼠后35天连续口服治疗。由对H520 MTT测定细胞的细胞毒性测试,抗肿瘤,anticachexia和免疫调节效果观察H520细胞异种移植Balb / cν- - - - - -ν裸小鼠。结果与吉西他滨160毫克/公斤,7天的间隔,腹腔内处理老鼠,作为参考药物(25,26在这个实验中。

2。材料和方法

2.1。测试材料的准备工作

platycodin D,礼物葡聚糖Corp .)有限公司(韩国釜山),由先前的方法(从Platycodi基数19]。原始样本(100千克)的Platycodi基数与正己烷提取甲醇和分区的顺序,氯仿,乙酸乙酯,正丁醇。正丁醇分数就受到Diaion HP-20树脂(三菱、东京、日本),和分数筛选了60 - 80%的甲醇收集获得90克粗皂甙。粗皂苷进一步纯化的反复硅胶(默克公司,达姆施塔特,德国)色谱法获得纯化platycodin D .纯化platycodin D的收益率是2%的原油皂素。这个过程重复了几次,直到足够数量的platycodin D。纯化platycodin D的基础上确定射频,FAB-MS(= 1225.38)和核磁共振(13 c)光谱与真实platycodin D(图1)。淡黄色粉末platycodin D作为试验材料,和白色晶体粉末的吉西他滨(Sigma-Aldrich、圣路易丝,密苏里州,美国)被用作药物控制参考。

2.2。在体外MTT试验

H520(人类非小细胞肺癌、非小细胞肺鳞状细胞癌;美式文化中心集合,美国弗吉尼亚州)细胞保持RPMI 1640媒体(美国纽约生活技术,大岛屿)含10%胎牛血清(的边后卫;美国纽约生活技术,大岛),100 U /毫升青霉素(Sigma-Aldrich、圣路易丝,密苏里州,美国),和100年μg / mL链霉素(Sigma-Aldrich圣路易丝,密苏里州,美国)在37°C和5%的公司₂条件。MTT (Sigma-Aldrich、圣路易丝,密苏里州,美国)试验进行确定细胞增殖,细胞毒性试验材料的影响。短暂,H520细胞被镀在96 -孔板的密度1×10⁴细胞/。孵化24小时后,细胞处理七个不同浓度的platycodin D(0, 1.56, 3.13, 6.25, 12.5, 25岁和50岁μ克/毫升在DMSO)或吉西他滨(0,100,200,400,800,和1600年μg / mL)为72小时。麻省理工0.5毫克/毫升溶液培养基被添加到井中。进一步4小时孵化后,介质被和DMSO溶液添加到盘子。光密度测量在570 nm使用标(Tecan;瑞士Mannedorf),然后相对消极的控制(0μg / mL)计算和集成电路₅₀。六个独立MTT检测重复进行这个实验。

2.3。在活的有机体内H520细胞异种移植小鼠

2.3.1。动物和畜牧业

共有60个处女,特定的无菌雌性Balb / c Slc -ν/ν老鼠(5-wk老收到;日本静冈县实验动物中心,静冈县)用驯化后42天。动物被分配了4到5 /聚碳酸酯笼在一个温度(20 - 25°C)和湿度(45 - 55%)控制房间。光明:黑暗周期是12人力资源:12人力资源和食品(Samyang,首尔,韩国)和水提供免费访问。五十个老鼠作为肿瘤小鼠和剩余十老鼠作为完整的控制在这个实验中。肿瘤接种后14天,八个老鼠每组显示常规肿瘤卷(平均约130毫米³;个人,101.79162.78毫米³)和身体重量(平均大约21 g;个人,17.9024.80 g)选择包括八个完整控制老鼠定期身体重量(平均约22 g;个人,20.7024.20 g),在本研究进一步的实验使用。动物实验根据国家规定使用和福利机构批准的实验室动物和动物保健和使用委员会在大邱Haany大学(Gyeongsan,韩国庆北韩)(批准号2013 - 023)。

2.3.2。肿瘤细胞异种移植和药物管理局

维护H520细胞悬浮在生理盐水1×10⁸cell /毫升浓度和0.2毫升的细胞悬浮液(2×10⁷细胞/鼠标)皮下接种右侧背臀部皮肤的鼠标,等体积的生理盐水也完整控制小鼠皮下注射,而不是肿瘤细胞悬浮液。三种不同剂量的Platycodin D(200、100和50毫克/公斤)是口头管理,每天一次在肿瘤细胞接种后15天的35天(达到肿瘤体积为100毫米³,至少)的体积10毫升/公斤(体重)。吉西他滨在生理盐水溶解,腹腔内接种肿瘤细胞接种后从15天,7天的时间间隔在一卷10毫升/公斤。在完整和车辆控制,只有蒸馏水10毫升/公斤是口头管理,而不是Platycodin D或吉西他滨。platycodin d - 200的用量,选择100年或50毫克/公斤是基于前面的动物有效性测试(27,28]。此外,吉西他滨的剂量160毫克/公斤,7天的间隔,选择和腹腔内治疗也是基于以前的功效测试H520细胞异种移植裸鼠[25,26]。

2.3.3。体重的测量

体重的变化测量在1天前政府(肿瘤细胞接种后14天),启动管理,1、7、14、21、28岁和34天后开始政府牺牲使用一个自动电子天平(Precisa乐器,Dietikon Switzland),分别。在开始管理和终止,一夜之间,所有的动物都被禁食(水没有;约18小时)减少喂养的差异。

2.3.4。肿瘤体积测量

肿瘤长度(长轴)和肿瘤宽度(短轴)每个肿瘤的老鼠,不完整的控制老鼠以1天前政府(肿瘤细胞接种后14天),启动管理,1、3、7、14、21、28日,34岁,35天后最初政府使用电子数显卡尺(Mytutoyo、东京、日本)和肿瘤体积计算1/2×长×宽²(毫米³)根据先前的方法(29日]。

2.3.5。肿瘤重量测量

在牺牲,肿块在每个鼠标取消后收集周围的皮肤,结缔组织、肌肉,和任何碎片。肿瘤的重量测量关于绝对wet-weights在g的水平。减少个人体重差异,相对重量(%)计算使用体重在牺牲和绝对的肿瘤重量(在牺牲绝对肿瘤重量/体重)×100。

2.3.6。淋巴和Periovarian脂肪垫重量测量

在牺牲,脾脏,颌下淋巴结,和左periovarian脂肪垫在每个老鼠收集周围的结缔组织,取消后的肌肉,和任何碎片。器官的重量测量关于绝对wet-weights在g的水平。减少个人体重差异,相对重量(%)也计算体重在牺牲和绝对的器官重量(在牺牲绝对器官重量/体重)×100。

2.3.7。血清白介素(IL) 6和干扰素(IFN)γ水平测量

血清生化,1毫升的全血收集从腔静脉牺牲Zoletile混合物(Zoletile 50;Virbac实验室,法国巴黎)麻醉和分离血清。血清样本都冻结在−150°C,直到他们化验。血清il - 6水平werosteocalcin水平检测到酶联免疫吸附试验(ELISA)工具包(研发系统公司,明尼阿波利斯,美国)pg / mL根据先前建立的方法(30.),而血清干扰素-γ使用鼠标IFN -水平也被计算γ酶联免疫试剂盒(BD生物科学/ Pharmingen、圣地亚哥、钙、美国)根据制造商的推荐协议pg / mL的水平。

2.3.8。自然杀伤(NK)细胞活性测量

脾和腹膜NK细胞活动是通过使用一个标准来衡量⁵¹Cr释放试验(31日]。简而言之,所有老鼠死于牺牲,和脾细胞和腹膜巨噬细胞收集从每个鼠标。脾脏1020毫克被RPMI - 1640中分离和洗涤(生活技术,大岛,纽约,美国),两次在4°C和匀浆准备,和腹膜巨噬细胞收集的重复腹腔内洗RPMI介质然后resuspended。准备脾和腹膜NK细胞破坏机械通过浸渍金属丝网(Sigma-Aldrich网格数100年,圣路易丝,密苏里州,美国)湿rpmi - 1640中。网格被rpmi - 1640中收集尽可能多的细胞。碎片被允许定居和细胞悬液被离心分离颗粒状。红细胞被resuspending细胞溶解的颗粒在寒冷的1%草酸铵和孵化冰10分钟。这些细胞被颗粒状,洗两次与哈佛商学院(汉克斯平衡盐溶液;美国纽约生活技术,大岛屿)。腹膜巨噬细胞(1×10⁵细胞/毫升2×10⁵细胞/毫升)在完全培养基培养过夜(Sigma-Aldrich、圣路易丝,密苏里州,美国)。一夜之间,脾细胞被培养在杜尔贝科修改鹰介质(美国纽约英杰公司)没有或存在重组- 2(1000国际单位/毫升;美国CA Proleukin凯龙星,维尔)。htla - 230目标神经母细胞瘤细胞被标记为2小时Na₂⁵¹阴极射线示波器₄(100μCi / 1×10⁶细胞)(ICN生物医学、美国卫生工程师协会(Asse)、比利时)。靶细胞在培养6小时37°C与脾细胞或腹膜巨噬细胞为效应细胞。效应:靶细胞的比例是100:1对脾细胞和10:1为巨噬细胞。上层清液收集,大量的放射性物质释放到上清液与γ计数器计数(眼镜蛇5002;堪培拉帕卡德,梅里登,CT,美国)。特定的目标细胞溶菌作用的百分比计算%(实验是观察到的释放⁵¹Cr值,是自发释放⁵¹Cr值,是最大的释放⁵¹Cr值)。

2.3.9。脾细胞因子含量测量

脾肿瘤坏死因子(TNF)的浓度α,il - 1β,用ELISA检测il - 10使用商用包、鼠标TNF -α酶联免疫试剂盒(BD生物科学/ Pharmingen、圣地亚哥、钙、美国),鼠标il - 1β酶联免疫试剂盒(Genzyme、剑桥、马、美国)和小鼠il - 10酶联免疫试剂盒(Genzyme、剑桥、马、美国),分别,如前所述32]。大约10 - 15毫克的组织样本中均质组织磨床包含1毫升的裂解缓冲(PBS包含2毫米PMSF和1毫克/毫升的抑肽酶,亮抑酶肽,而抑肽素)所描述的克拉克et al。33]。分析100毫升的标准(在溶解稀释缓冲)或10,50或100毫升的组织匀浆。每个样本都是在重复运行,部分蛋白质的样品进行了分析。数据表示为pg /毫克的蛋白质。对于每个测定标准曲线生成,基于复制的测量吸光度,平均变异系数小于10%。

2.3.10。组织病理学

在牺牲重量测量后,部分肿瘤质量,脾脏,颌下淋巴结,左边periovarian脂肪垫分离和中性缓冲福尔马林固定在10%,至少24小时。然后石蜡包埋和3μ米厚的部分做好准备的话。每个幻灯片被苏木精和伊红染色的组织病理学。组织学评价进行中央区域的每个器官或肿瘤质量,只要有可能。histopathologist百叶窗是集团分布在这一分析。观察更多的细节变化,肿瘤细胞卷,完整的肿瘤细胞被占领的地区(% /毫米²肿瘤的质量),计算在每一个准备肿瘤组织学标本使用自动图像分析仪(iSolution FL版本9.1,IMT i-solution Inc .,魁北克,加拿大)在显微镜下(尼康,东京,日本)。总厚度的中央交叉削减脾(从顶前边境后缘的中心;毫米/脾),白髓数量(/毫米²脾)和直径(μ米/白色果肉),颌下淋巴结总厚度(μ米/中部地区),皮质淋巴滤泡数量(数量/毫米²大脑皮质)和皮层厚度(μ米/淋巴结)也被计算根据以前的报告32]。此外,总厚度(μ米/中部地区),意思是白色脂肪细胞直径(μm /白色脂肪细胞)被自动图像分析仪测量根据先前建立的方法(34]。

2.3.11。免疫组织化学

deparraffinized后准备肿瘤组织学切片质量,柠檬酸缓冲抗原(表位)进行了检索预处理之前(35]。短暂,预热水浴染色盘包含10毫米柠檬酸缓冲(pH值6.0)直到温度达到95 - 100°C。浸泡幻灯片染色皿和染色皿上的盖子松的地方。孵化20分钟,关掉水洗澡。将染色皿在室温和允许幻灯片冷却20分钟。抗原决定基的检索后,部分应用使用avidin-biotin复杂caspase-3 (ABC)方法——裂解聚(ADP-ribose)聚合酶(PARP) cyclooxygenase-2 (cox - 2),诱导一氧化氮合成酶(间接宾语)和肿瘤坏死因子-α(36,37]。短暂,内源性过氧化物酶活性被孵化在甲醇和0.3% H₂O₂30分钟,与普通马血清非特异性结合的免疫球蛋白被阻塞的解决方案(向量实验室。,伯林盖姆,CA,美国。稀释1:100)在湿度室1小时。主要抗血清(表1在4°C)治疗在一夜之间湿度室,然后用生物素化的通用二次抗体(孵化向量实验室。,伯林盖姆,CA,美国。稀释1:50)和ABC试剂(Vectastain精英ABC工具包,矢量实验室。伯林盖姆,CA,美国;稀释1:50)为1小时在室温湿度室。最后,与过氧化物酶反应底物的部分亲属(美国向量实验室。,伯林盖姆,CA)在室温下为3分钟。所有的部分都在0.01米PBS冲洗3次,步骤之间。细胞表现出更强的免疫反应性在细胞质中,超过20%,密度,对每个抗血清被认为是积极的。百分比地区被caspase-3, PARP - cox - 2,伊诺和TNF -α阳性细胞位于肿瘤质量被自动图像分析仪测量(% /毫米²分别为肿瘤质量)。

2.4。统计分析

数值数据提出了的意思SDs和多个不同剂量组进行了对比测试。方差齐性检验使用列文测试。如果列文测试表明没有明显偏离方差的同质性,分析的数据是单向方差分析其次是矫正人员的测试来确定组比较,有显著不同。观察的重大偏离方差同质性在列文测试、非参数比较测试,克鲁斯卡尔-沃利斯H进行了测试。当一个显著差异是克鲁斯卡尔-沃利斯H测试,观察Mann-Whitney(MW)进行测试来确定具体的双组比较,明显不同。使用SPSS统计分析进行了Windows (Release 14.0 K, IBM SPSS Inc .,阿蒙克,纽约,美国),和值< 0.05被认为是明显不同的。

3所示。结果

3.1。结果MTT试验

重要的()减少H520肿瘤细胞的生存能力在platycodin从3.13 D治疗μ50 g / mLμ克/毫升浓度,因此,IC₅₀platycodin D对H520肿瘤细胞被计算为15.86μ研究(图g / mL2)。此外,重要的()降低H520肿瘤细胞的生存能力也注意到从200年μ克/毫升到1600μ吉西他滨的g / mL,因此,IC₅₀吉西他滨对H520肿瘤细胞被计算为456.75μ克/毫升(1.74μ米)在这个实验中(图2)。

3.2。结果H520细胞异种移植裸鼠

3.2.1之上。对身体的影响权重

重要的()减少身体的重量证明在所有肿瘤小鼠与完整的最初7天后政府的控制。吉西他滨160毫克/公斤,7天的间隔,腹腔内治疗小鼠显示显著减少身体重量与肿瘤的老鼠从后28天的初始管理控制。然而,platycodin D 200和100毫克/公斤治疗显著(或)增加了身体的重量与肿瘤控制后28天政府的老鼠,但是platycodin D 50毫克/公斤体重没有产生任何有意义的变化(图3)。

3.2.2。对肿瘤体积的影响

重要的()减少肿瘤体积的吉西他滨治疗小鼠中发现与肿瘤控制从14天的政府在这个实验中。Platycodin D 200和100毫克/公斤治疗小鼠还显示显著(或)减少肿瘤体积的14天之后最初的政府,和platycodin D 50毫克/公斤接种小鼠还显示显著(或)减少肿瘤体积的21天的管理,分别为(数字4和5)。

3.2.3。对肿瘤的影响权重

重要的(或)降低肿瘤的绝对和相对体重(%)权重观察药物注射小鼠包括platycodin D 50毫克/公斤治疗小鼠与肿瘤控制牺牲。Platycodin D显示明显的剂量依赖性降低肿瘤重量在牺牲与肿瘤控制老鼠相比,分别(表2,图4)。

3.2.4。对脾脏重量的影响

重要的(或)降低脾的绝对和相对权重中观察到肿瘤控制老鼠与完整控制老鼠相比,分别。然而,所有三种不同剂量的platycodin D接种小鼠显示显著(或)增加脾脏重量与肿瘤的控制,存在剂量依赖的相关性。吉西他滨160毫克/公斤治疗小鼠显示显著(绝对重量的减少,但很类似相对脾脏重量与肿瘤控制老鼠相比,分别(表2)。

3.2.5。对颌下淋巴结重量的影响

重要的()降低颌下淋巴结绝对和相对权重中观察到肿瘤控制老鼠与完整控制老鼠相比,分别。然而,所有三种不同剂量的platycodin D接种小鼠显示显著()增加颌下淋巴结重量与肿瘤的控制,存在剂量依赖的相关性。吉西他滨160毫克/公斤治疗小鼠显示显著减少的绝对颌下淋巴结重量但是非常相似相对颌下淋巴结重量与肿瘤控制小鼠,分别(表2)。

3.2.6。对Periovarian脂肪垫重量的影响

重要的()降低periovarian脂肪垫的绝对和相对权重中观察到肿瘤控制老鼠与完整控制老鼠相比,分别。然而,所有三种不同剂量的platycodin D接种小鼠显示显著()增加periovarian脂肪垫的重量与肿瘤控制,存在剂量依赖的相关性。吉西他滨160毫克/公斤治疗小鼠显示显著(或)减少的绝对和相对权重periovarian脂肪垫与肿瘤控制老鼠相比,分别(表2)。

3.2.7。对血清il - 6和干扰素-的影响γ水平

重要的()增加的血清il - 6水平,降低干扰素-γ水平观察肿瘤控制老鼠而完整的小鼠,分别。然而,platycodin D 200、100和50毫克/公斤接种小鼠显示显著(或)降低血清il - 6水平,并增加干扰素-γ水平与肿瘤控制相比,存在剂量依赖的相关性。吉西他滨160毫克/公斤治疗小鼠显示显著(),而血清il - 6和干扰素-γH520肿瘤引起的水平变化,在这项研究中(图6)。

3.2.8。对NK细胞活性的影响

重要的()降低脾和腹膜NK细胞活动中观察到肿瘤控制老鼠而完整的小鼠,分别。然而,所有三种不同剂量的platycodin D接种小鼠显示显著()提高NK细胞的活动与肿瘤控制相比,存在剂量依赖的相关性。吉西他滨接种小鼠显示显著降低的脾脏NK细胞活动和重要()减少腹膜NK细胞活动与肿瘤控制老鼠相比,分别(图7)。

3.2.9。对脾细胞因子含量的影响

重要的()降低脾肿瘤坏死因子-α,il - 1β和il - 10的内容被观察到肿瘤控制老鼠而完整的小鼠,分别。然而,platycodin D 200、100和50毫克/公斤接种小鼠显示显著(或)增加脾细胞因子的内容与肿瘤的控制,存在剂量依赖的相关性。相反,吉西他滨接种小鼠显示显著()降低脾肿瘤坏死因子-α和il - 1β,无意义的但是戏剧性的减少小鼠脾il - 10的内容与肿瘤的控制,分别(表3)。

3.2.10。对肿瘤组织病理学和免疫组织化学的影响

相对高分化肿瘤细胞,在鳞状细胞癌中存在肿瘤小鼠肿瘤控制的质量。然而,肿瘤的肿瘤细胞体积质量显著()减少所有接种小鼠肿瘤控制老鼠相比,分别。尤其是platycodin D 200、100和50毫克/公斤治疗小鼠表现出明显的剂量依赖性降低肿瘤细胞的数量(表4,图8)。此外,所有药物治疗小鼠包括platycodin D 50毫克/公斤显示显著(或)增加caspase-3和PARP肿瘤免疫反应性的质量和减少COX-2-immunolabeled细胞与肿瘤的控制小鼠,分别(表4,图8)。标记和伊诺和TNF -剂量依赖性增加α免疫反应性被证明在所有platycodin D治疗小鼠与肿瘤的老鼠相比,但吉西他滨160毫克/公斤伊诺和TNF -没有影响α群众在肿瘤免疫反应性(表4,图8)。

3.2.11。对脾脏的组织病理学的影响

萎缩性变化相关的降低脾白髓淋巴细胞在肿瘤中发现控制与完整的控制;因此总脾厚度,白髓数量和直径显著()减少肿瘤小鼠与完整的控制,分别。然而,这些脾萎缩性变化显著(或)抑制治疗platycodin D 200、100和50毫克/公斤,分别存在剂量依赖的相关性与肿瘤控制。吉西他滨治疗小鼠并没有显示任何重大变化对总脾厚度,白髓数量和直径与肿瘤控制老鼠相比,分别(表5,图9)。

3.2.12。对颌下淋巴结组织病理学的影响

标志着萎缩性变化相关的减少淋巴细胞被发现在颌下淋巴结的肿瘤控制较完整的控制;因此总、皮层厚度和卵泡数量明显(减少肿瘤控制与完整的控制,分别。然而,这些颌下淋巴结萎缩性变化显著(或)抑制治疗platycodin D 200、100和50毫克/公斤,分别存在剂量依赖的相关性与肿瘤控制。吉西他滨治疗小鼠并没有显示任何重大变化对颌下淋巴结皮质厚度和卵泡总数与肿瘤控制小鼠,分别(表5,图9)。

3.2.13。对Periovarian脂肪垫组织病理学的影响

明显萎缩性变化相关的减少白色脂肪细胞的大小periovarian脂肪组织中发现的带有控制与完整的控制;因此总脂肪沉积厚度和平均直径的白色脂肪细胞显著(减少肿瘤控制与完整的控制,分别。然而,这些萎缩性变化对白色periovarian脂肪组织明显()抑制治疗的三种不同剂量的platycodin D摄入量有关,而肿瘤控制在这个研究。吉西他滨接种小鼠显示显著(或)降低总periovarian脂肪沉积的厚度和平均直径的白色带有控制老鼠相比,分别(表5,图9)。

4所示。讨论

肺癌发展超过200000人,每年导致超过160000人死亡;非小细胞肺癌是最常见的一种肺癌(38]。许多病人接受化疗或放疗前手术切除缩小肿瘤,手术后可能继续接受治疗,这取决于肿瘤的病理。有几种化疗药物被用于治疗肺癌,包括铂类代理、紫杉烷和拓扑异构酶抑制剂(39,40]。最近,吉西他滨,表皮生长因子受体信号的抑制剂,用于治疗肺癌患者(41]。因为化疗降低了患者的生活质量,经常负责非常严重的、有时可以致命性并发症,合理设计特定的肿瘤药物尤其需要(26]。天然草本植物含有多种酚类化合物、维生素、类胡萝卜素和黄酮类化合物,和他们显示不同的药理作用,包括抗氧化,抗过敏药和抗癌效果16]。尽管抗癌活动platycodin D的评估包括A549细胞,adenocarcinomic人类肺泡基底上皮细胞(23,24],H520细胞的抗癌效果,代表非小细胞肺癌细胞系platycodin D没有显示在我们的知识。在这里,可以使用H520 platycodin D观察抗肿瘤活性肿瘤cell-bearing无胸腺的裸小鼠后连续口服治疗,一天一次确认后35天在体外细胞毒性。由对H520 MTT测定细胞的细胞毒性测试,抗肿瘤,anticachexia和免疫调节效果观察H520细胞异种移植Balb / cν- - - - - -ν裸小鼠。为了研究platycodin D是否有强有力的抗肿瘤和免疫调节活动效果,200年,100年和50毫克/公斤platycodin D口头管理,每天一次35天的后15天H520在无胸腺的裸体小鼠肿瘤细胞植入,和身体的重量变化,肿瘤体积和重量、淋巴器官(脾和颌下淋巴结),血清干扰素-γ水平,脾细胞和腹膜巨噬细胞活动,脾肿瘤坏死因子-α,il - 1β和il - 10的内容与质量和肿瘤淋巴器官组织病理学观察。此外,改变periovarian脂肪重量和血清il - 6水平也发现与沉积的厚度periovarian脂肪组织和他们的平均直径监控肿瘤anticachexic效果。免疫反应性的肿块,caspase-3和PARP -凋亡标记,cox - 2,伊诺和TNF -α此外,通过免疫组织化学方法观察了。结果与吉西他滨160毫克/公斤,7天的间隔,腹腔内处理老鼠,作为参考药物(25,26]。

Platycodin D显示良好的细胞毒性影响H520细胞,吉西他滨也显示良好的细胞毒性效应;集成电路₅₀platycodin D和吉西他滨对H520细胞被计算为15.86μ和456.75克/毫升μ克/毫升(1.74μ这个实验M)。作为肿瘤细胞接种的结果,显著降低的脾脏和颌下淋巴结重量、血清干扰素-γ脾肿瘤坏死因子-α,il - 1β和il - 10含量、脾细胞和腹膜NK细胞活动与组织病理学观察脾萎缩性变化,颌下淋巴结。此外,死亡对身体的重量也在肿瘤控制增加的血清il - 6水平,减少periovarian脂肪垫的重量、白色脂肪组织的萎缩性变化,表明肿瘤抑制免疫反应和恶病质。显著减少肿瘤体积和重量证明吉西他滨治疗小鼠160毫克/公斤降低肿瘤细胞体积的肿块被注意到,而且显著提高肿瘤的大规模caspase-3和PARP免疫反应性和降低cox - 2在吉西他滨治疗小鼠的免疫反应性与肿瘤控制。然而,吉西他滨治疗加重癌症恶病质(实际身体重量,periovarian脂肪口供和血清il - 6水平)和抑制免疫反应(淋巴器官重量、血清干扰素-γ水平,NK细胞活动,脾肿瘤坏死因子-α,il - 1β和il - 10的内容,组织病理学萎缩性变化的淋巴器官,伊诺和TNF -α免疫反应性肿块)与肿瘤控制老鼠。Platycodin D 200、100和50毫克/公斤治疗小鼠显示明显与强有力的抗肿瘤免疫刺激性和anticachexia影响活动与肿瘤的老鼠相比,存在剂量依赖的相关性,在这个实验中。这些结果表明,platycodin D有强有力的抗肿瘤活动通过直接细胞毒性效应,增加细胞凋亡的肿瘤细胞,免疫刺激性影响,并且可以控制癌症恶病质有关。

细胞生长抑制试验使用MTT普遍使用在体外试验来检测可能的细胞毒性测试材料的活动化疗,并已广泛用于筛选抗肿瘤活动(42]。在目前的研究中,对H520 platycodin D显示良好的细胞毒性影响细胞,IC₅₀对H520 platycodin D细胞被计算为15.86μ克/毫升在这个实验中,类似于之前的实验对A549细胞,adenocarcinomic人类肺泡基底上皮细胞;platycodin D显示有效对A549细胞的细胞毒性,IC₅₀10 - 18的μ克/毫升(23,24]。一般来说,吉西他滨显示1.54μ的集成电路₅₀针对H520 [43),和吉西他滨显示有效的细胞毒性H520细胞用于这项研究为456.75μ克/毫升(1.74μ米)的集成电路₅₀在这个实验中。

裸小鼠T淋巴细胞相关免疫缺陷和先天无胸腺的有作为一个有用的模型用于评估肿瘤异种移植开发(44,45]。有趣的是,裸体小鼠发展年龄相关性extrathymic T细胞的成熟,那个是更大的程度比CD4 + CD8 +细胞毒性辅助T细胞(46,47]。因此,它也被认为是可以显示一些免疫调节药物抗肿瘤作用本身或协同效应与细胞毒性药物介导的免疫刺激作用,因为肿瘤直接相关免疫缺陷(46,48]。抗肿瘤的活动在肿瘤细胞异种移植裸鼠评估基于大规模植入肿瘤生长的肿瘤体积和重量29日,49]。在目前的研究中,platycodin D 200年、100年或50毫克/公斤有利抑制了肿瘤的生长,植入,存在剂量依赖的相关性和显著降低肿瘤的体积和重量检测三种不同剂量的platycodin D管理小鼠肿瘤控制老鼠相比,和吉西他滨160毫克/公斤老鼠直接证据,超过50毫克/公斤platycodin D政府诱导良好的抗肿瘤作用。在这个实验中,platycodin D 100毫克/公斤治疗小鼠表现出抗肿瘤效应,抑制了H520肿瘤生长与吉西他滨160毫克/公斤,7天的间隔,腹腔内治疗。这些platycodin D被认为是抗肿瘤活性的结果直接细胞毒性对H520细胞,诱导细胞凋亡的肿瘤细胞或细胞毒性免疫刺激性影响因为platycodin D显示直接有利对H520肿瘤细胞和他们表现出良好的间接免疫刺激性影响淋巴器官和直接增加各种炎症介质和肿瘤细胞凋亡在肿瘤这个实验质量。

t细胞介导的抑制免疫反应直接相关癌症出现或癌症患者显著的免疫抑制也观察到(12,13,最近,刺激或增加身体免疫系统的突出作为癌症治疗的新治疗方案(14,15]。此外,抗氧化剂也有利身体的免疫系统,激活和释放的抗肿瘤细胞因子,诱导抗肿瘤效应50,51]。标记免疫缺陷也诱导在这项研究H520细胞植入后,淋巴器官重量明显减少肿瘤控制小鼠明显萎缩性变化有关减少淋巴细胞在脾脏和颌下淋巴结组织病理学观察。虽然吉西他滨治疗略引起H520细胞植入相关抑制免疫小鼠胸腺裸体好与先前的报道(52,53),所有三种不同剂量的platycodin D管理老鼠标志和剂量依赖性增加身体的免疫系统。再次,在H520 platycodin D细胞异种移植小鼠抗肿瘤活性可能是介导的,至少部分,通过免疫刺激性platycodin D在当下研究的影响。免疫调节的影响platycodin D已经透露通过动物实验22]。

细胞因子肿瘤坏死因子-α由多种细胞类型,包括脾细胞,被发现与关键事件导致T-lineage承诺和分化54]。肿瘤坏死因子-α可以提高在活的有机体内免疫反应在剂量远低于那些导致减肥或组织的毒性。它能增强B和T细胞的增殖,促进细胞毒性T细胞的生成。此外,它能增强IL-2-induced免疫球蛋白生产和增加自然杀伤细胞活性和刺激单核细胞扩散- 2 (55]。il - 1是另一个细胞因子释放的各种类型的细胞如巨噬细胞、树突细胞,淋巴细胞,内皮细胞,成纤维细胞,可见,两种形式的il - 1、il - 1α和il - 1β。他们都是17 kDa的糖蛋白,il - 1β由细胞和il - 1秘密吗α是膜的形式。il - 1是必要的成功启动某些形式的免疫反应(56]。il - 10月19 - 21日KDa的免疫抑制糖蛋白是由Th2细胞分泌,一些B细胞,激活巨噬细胞。现在清楚的是,il - 10主要作用于激活的巨噬细胞抑制il - 1的分泌,白介素、肿瘤坏死因子-α和活性氧自由基55]。干扰素-γ是20到25 kDa的糖蛋白产生的CD8 + T细胞,Th1细胞,NK细胞响应- 2。它复杂影响B和T细胞功能,提高NK细胞和巨噬细胞的活动55]。我们观察到显著的降低刺激细胞因子,脾肿瘤坏死因子-α和il - 1β内容,以及血液IFN -γlevels-splenic水平,抑制细胞因子il - 10含量也下降的结果减少H520细胞异种移植后淋巴细胞),以及与以前的研究(12,13),分别。然而,这些脾和血液细胞因子减少,有效地抑制治疗platycodin D 200年,100年或50毫克/公斤,与淋巴器官重量和组织病理学检查,但吉西他滨治疗略加剧肿瘤抑制免疫的小鼠胸腺裸体像先前的报道(类似52,53]。

作为一个癌症相关抑制免疫反应,各种免疫细胞的功能障碍包括NK细胞和巨噬细胞已经观察到,这些免疫细胞和激活都强调作为一个新的癌症治疗方案(14,15]。在这项研究中,显著降低NK细胞的活动也证实肿瘤细胞接种后,但所有platycodin D治疗脾和腹膜NK细胞活动,增加剂量依赖性。吉西他滨管理老鼠显示显著降低的脾脏和腹膜NK细胞活动与肿瘤控制老鼠在这个实验中。

细胞凋亡发生通过两个途径,一个外在途径涉及死亡的交互与各自的细胞表面受体和配体的内在途径由侮辱损害DNA,例如紫外线照射和化疗药物。两个途径最终导致线粒体损伤与细胞色素的释放还存在和下游的激活,如caspase-3。激活其他下游还导致分裂的细胞蛋白质,如PARP、细胞角蛋白18日和其他还存在,导致细胞凋亡的形态学和生物化学变化57,58]。PARP核DNA结合蛋白质的DNA碱基切除修复功能(59]。PARP乳沟导致减少酶修复功能和导致细胞凋亡的进展,尽管PARP乳沟不是绝对必要的细胞凋亡进行(60]。半胱天冬酶3、下游效应半胱天冬酶负责乳沟的几个关键的核目标凋亡级联。这些包括抑制剂caspase-activated deoxynuclease,导致核分裂,PARP,结果在一个有缺陷的DNA修复功能(61年]。检测肿瘤激活半胱天冬酶3和PARP的大规模起诉凋亡的肿瘤细胞(62年,63年]。在我们的研究中,增加caspase-3和PARP免疫反应性也在肿瘤群众吉西他滨和platycodin D政府相关的肿瘤细胞凋亡。Platycodin D 200年、100年或50毫克/公斤管理老鼠肿瘤的重要和剂量依赖性增加大规模caspase-3和PARP immunolabeled细胞与肿瘤控制老鼠相比,Platycodin D良好的直接证据,政府会加强肿瘤细胞的凋亡,类似于吉西他滨。Platycodin D 100毫克/公斤显示相似的肿瘤细胞凋亡与吉西他滨的160毫克/公斤腹腔内处理老鼠,7天的间隔。此外,显著降低cox - 2的合成的关键酶prostaglandins-chemical中介的炎症,还参与血管生成和发展64年),免疫反应性也在所有测试物质管理老鼠包括吉西他滨和platycodin D 50毫克/公斤在目前的研究中,直接证据,他们抑制H520细胞轴承相关的血管生成和发展。Platycodin D 50毫克/公斤显示类似的抑制对肿瘤细胞cox - 2表达的影响。

一般来说,进气阀打开活动的增加相关的促炎的特工——内毒素,il - 1β肿瘤坏死因子-α和干扰素-γ可以诱导震惊和在体内的炎症反应(65年),在伊诺的表情也诱导肿瘤新血管形成(66年]。然而,伊诺由激活的巨噬细胞可以诱导肿瘤细胞凋亡及相关肿瘤回归(67年]。在目前的研究中,标记和剂量依赖性增加伊诺的免疫反应性肿瘤中发现了大规模的platycodin D小鼠接种。这些增加的肿瘤质量伊诺免疫反应性是继发性变化从免疫刺激platycodin D与NK细胞活性的影响。此外,显著增加肿瘤的肿瘤坏死因子-质量α,一位代表参与肿瘤坏死因子(68年)免疫反应性也被证明在所有三个不同剂量platycodin D与肿瘤的控制小鼠,分别。吉西他滨肿瘤伊诺和TNF -质量没有影响α这个实验免疫反应性。

癌症恶病质是一个恶化的副肿瘤综合征患者的生活质量的各种恶性肿瘤(69年,70年]。众多研究表明,il - 6分泌循环肿瘤细胞起着重要的作用在癌症恶病质71年- - - - - -73年]。这些发现支持临床数据,il - 6可能与食道癌患者的营养状况74年]。在目前的研究中,血清il - 6水平的显著增加和恶病质体重减少,减少和萎缩性改变沉积periovarian脂肪垫H520细胞移植后观察,但这些恶病质相关变化极大地抑制了治疗的三种不同剂量的platycodin D,存在剂量依赖的相关性,分别与小鼠肿瘤控制相比。这些被认为是作为直接证据管理platycodin D, 50毫克/公斤,至少,可以控制癌症恶病质。

5。结论

这一研究获得的结果表明,口服治疗platycodin D 200年,100年和50毫克/公斤强有力的抗肿瘤活动H520细胞,代表非小细胞肺癌细胞系,通过直接细胞毒性效应,增加肿瘤细胞的凋亡和免疫刺激性效果和可以控制癌症恶病质有关。Platycodin D 100毫克/公斤显示强大的抗肿瘤作用与吉西他滨可比160毫克/公斤腹腔内处理老鼠,7天的间隔。吉西他滨加重癌症相关免疫排除这个实验恶病质。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关。

作者的贡献

Jae陈公园和年轻俊李同样贡献了这项工作。

确认

这项研究是由韩国国家研究基金会(NRF)由韩国政府(MSIP)(批准号韩国2013 - 067053年)和由格兰特的健康和福利项目。20-11-0-090-091-3000-3033-320)。