文摘
天然产物的发现和发展具有强抗氧化,抗炎,抗凋亡特性一直是最有趣的和有前途的方法在寻找许多神经退行性疾病的治疗包括缺血性中风。血清/葡萄糖剥夺(SGD)作为一个优秀的体外模型的理解在缺血神经元损伤的分子机制,对ischemia-induced脑损伤神经保护药物的发展。最近的研究表明,石榴(石榴l .)或其有效成分发挥药理作用,如抗氧化、抗炎、神经保护属性。因此,在这项研究中我们调查可能的保护作用不同的石榴提取物对SGD-induced PC12细胞损伤。最初,这些细胞被用不同浓度的纸浆hydroalcoholic预处理提取(检),浆水提物(PAE)和石榴汁(PJ) 2 h,然后剥夺血清/葡萄糖(SGD) 6 - 12 h。SGD引起显著减少细胞生存能力(MTT试验测量)后6 - 12 h,而控制细胞()。预处理与板式换热器、PAE, PJ显著和concentration-dependently SGD侮辱后细胞生存能力增加6 - 12 h。显著增加DNA损伤(以彗星试验)是在细胞核的细胞后SGD 12 h ()。在对照组,无显著差异在板式换热器之间的DNA损伤,PAE, PJ-pretreated vehicle-pretreated PC12细胞()。板式换热器,PAE, PJ预处理导致显著降低DNA损伤后缺血性侮辱()。这种抑制DNA损伤的板式换热器,PAE和PJ被发现浓度依赖性。这些数据表明,有一个cytoprotective财产在板式换热器,PAE,和PJ SGD条件下PC12细胞,这表明石榴有可能作为治疗神经退行性疾病的新策略。
1。介绍
尽管显著促进预防和治疗脑缺血中风仍然是最重要的死亡原因之一,削弱老年人人口(1]。设计有效的神经保护药物和研究cytoprotective影响组件可以用一个有效的体外模型血清/葡萄糖剥夺(SGD)神经损伤可以描述在脑缺血脑损伤的分子机制2,3]。
石榴l,(family Punicaceae), is a fruit-bearing deciduous shrub or small tree growing between five and eight meters tall. The pomegranate is native to the region of Persia and the western Himalayan range [4),培养在伊朗,地中海地区,加州,和许多其他地区(5]。在阿育吠陀医学石榴被认为是“药店本身”,是用作治疗糖尿病药,抗剂和治疗胃肠道功能紊乱如满口烂斑、腹泻、和溃疡6]。最近,它已经表明,石榴具有一些药理活性如抗氧化剂(6- - - - - -8],抗癌的[7,8),和抗炎作用9]。记录的是食用石榴似乎与治疗和预防广泛范围的疾病,例如癌症7,8)、糖尿病(10)、心血管疾病(11,12),类风湿性关节炎,溃疡性结肠炎9]。石榴的神经保护作用已被证明在缺血脑损伤13,14),一个β全身的氧化应激和学习和记忆赤字,以及H2O2全身的PC12细胞氧化应激(15]。
因为它已被证明石榴有很多有益的影响与其抗氧化作用相关,我们决定研究其保护作用对SGD-induced PC12细胞损伤。
2。材料和方法
2.1。细胞系和试剂
PC12细胞系是来自巴斯德研究所(德黑兰,伊朗)。高葡萄糖鹰杜尔贝科的修改中(DMEM, 4.5 g / L), glucose-free DMEM (0 g / L)和胎牛血清(FCS)从Gibco购买(CA)卡尔斯巴德。Folin-Ciocalteu试剂,3 - (4 5-dimethylthiazol-2-yl) 2, 5-diphenyl四唑(MTT),和其他细胞培养材料买来σ(圣路易斯,密苏里州)。低熔点琼脂糖(LMP)和正常熔点(NMP)琼脂糖从Fermentas(格伦·伯尼MD)。其他化学物质主要是乙二胺四乙酸二钠盐(Na2EDTA),三(羟甲基)氨基甲烷(Trizma基地),t-octylphenoxy polyethoxyethanol (Triton x - 100),二甲亚砜(DMSO),钠月桂酰sarcosinate (sarkosyl SLS)和溴化乙锭从默克公司购买(达姆施塔特,德国)。
2.2。细胞培养
PC12细胞培养在高葡萄糖DMEM (4.5 g / L)补充10% FCS和100单位/毫升的青霉素和链霉素。所有细胞都保持在湿润的气氛中包含5%股份有限公司(90%)2在37°C。
2.3。诱导细胞死亡的血清/葡萄糖剥夺
为SGD-induced细胞毒性,PC12细胞在一夜之间被播种,然后受到SGD 6和12 h代替标准培养基(高葡萄糖DMEM, 4.5 g / L)与glucose-free DMEM (0 g / L),补充与100 U /毫升青霉素和链霉素100 U /毫升(16]。
2.4。制备浆Hydroalcoholic提取(检),浆水提物(PAE)和石榴汁(PJ)
石榴果实收集从Saveh地区(伊朗)中心和验证·大学植物标本的马什哈德(马什哈德,伊朗;凭证标本。311-0203-1)。
的果肉和皮石榴洗,晒干,粉碎与电动microniser粉末。果肉粉被动摇和乙醇(70%)和水2天。提取的结果就是后来被过滤和集中在减压髓hydroalcoholic提取(法)和纸浆水提物(PAE),分别。收益率约36%被发现w / w。获得石榴汁提取(PJ),种子和地面分离获得果汁。果汁被过滤和干下减压(收益率报4.1% w / w)。提取被保持在−20°C到使用。
股票的解决方案的板式换热器和PAE准备在二甲亚砜(DMSO)和所需的浓度是由股票使用完全培养基。PJ股票和工作方案,准备在完全培养基。
2.5。酚醛树脂总测量
板式换热器的总酚类物质浓度,PAE, PJ是由Folin-Ciocalteu方法如前所述17]。短暂,50毫克干提取提取100毫升的酸化甲醇:水(60:40 v / v, 0.3%盐酸)在随后的过滤。100年μL(滤液当时Folin-Ciocalteu试剂与等量混合,同时增加了2.0毫升的碳酸氢钠和彻底混合。吸光度测量在750 nm,值是来自一个标准曲线准备用鞣酸(0 - 1.0毫克/毫升酸化甲醇:水)后2小时。值表示为鞣酸等价物(TAE,毫克/克干质量)。
2.6。细胞增殖试验(MTT)
麻省理工是用来确定可行的细胞减少到紫甲瓒(18]。PC12细胞(5000 /)在96年被播种,组织文化板块,24小时后,细胞使用板式换热器,PAE PJ (6.25 -800μg / mL)同时为另一个2 h,然后孵化6或12 h血清和葡萄糖免费(SGD)条件。这些剂量选择基于IC50(抑制浓度50%)计算从早些时候的实验。空白和溶剂控制治疗相同。在6 - 12 h SGD侮辱后,MTT方法在磷酸盐(PBS、5毫克/毫升)添加到最终的浓度为0.05%。2 h后,甲瓒沉淀溶解在DMSO溶液含有10%甘氨酸缓冲(pH = 10.5)。微型板块是在黑暗中轻轻摇动了30分钟,吸光度在570和620海里(背景)是衡量使用StatFAX303板读者。
所有的实验进行了一式三份;可行的细胞的百分比计算均值±SEM与控件设置为100%。形态变形的细胞也被检查。
2.7。单细胞凝胶电泳(SCGE)彗星试验
碱性SCGE试验进行了基于先前描述的方法(19]。简而言之,PC12细胞(3×105)孵化2 h和三种不同浓度的板式换热器,PAE, PJ(6.25, 400年和800年μg / mL)和受到SGD 12 h相同的治疗应用。去除介质后,冷PBS的细胞被洗了三次,收获和离心机在3000 rpm 5分钟4°C。球被resuspended在PBS 1×10的细胞密度5。彗星试验,100年μL NMP琼脂糖很快就分层传统幻灯片,覆盖着一个盖玻片,然后幻灯片放在冰允许琼脂糖凝胶。10μL细胞悬液,如上所述,是混合了100年μL LMP琼脂糖,混合很快分层在NMP琼脂糖层后的盖玻片。最后,在上面添加了一层LMP琼脂糖。幻灯片立即沉浸在冷冻赖氨酸溶液(pH = 10)由2.5 M氯化钠,100毫米Na2EDTA、10毫米Trizma sarkosyl 1%, 10% DMSO溶液,1% triton x - 100和保持在0°C在黑暗中过夜。然后,幻灯片是放在一个水平凝胶电泳平台和覆盖着一个prechilled碱性溶液由300毫米氢氧化钠和1毫米Na2EDTA (pH > 13)。他们的解决方案在黑暗中在0°C 40分钟然后在0°C在黑暗中电泳为30分钟25 V和大约300 mA。幻灯片轻轻冲洗三次与400毫米Trizma溶液(盐酸调整pH值7.5)中和过量的碱,沾染了50μL (20μg / mL溴化乙锭和盖玻片覆盖。彗星分析,150核被随机选择从三个复制幻灯片(50核一个幻灯片),通过荧光显微镜检查和拍照(尼康、日本),在400 x放大配备一个激发过滤器520 - 550 nm和580 nm的吸收滤光片。未损坏的细胞没有尾巴,像一个完整的核和受损细胞彗星的出现。百分比的DNA彗星尾巴(尾部DNA百分比),这是一个估计的DNA损伤,分析了利用计算机图像分析软件(CASP软件)。实验进行了一式三份。
2.8。统计分析
结果的平均值±标准错误(SEM)。单向方差分析比较使用的值(方差分析)其次是图基事后考验的多重比较。的值小于0.05被认为是具有统计学意义。
3所示。结果
3.1。酚醛树脂含量的板式换热器,PAE PJ
多酚包括hydrolysable单宁和鞣花单宁占主要的石榴(已知的抗氧化性能20.]。检,PAE, PJ被发现含有,,总多酚mg / L表示为鞣酸等价物(TAE,毫克/ g (TAE),分别。
3.2。板式换热器,PAE, PJ剂量依赖性抑制SGD-Induced细胞死亡
检查可能的毒性作用的石榴提取物、PC12细胞孵化与高浓度的板式换热器,PAE, PJ (800μg / mL),生存能力是决定治疗后6 - 12 h。没有明显的毒性作用对细胞生存能力被认为与这些提取物治疗后6 - 12 h(数字1- - - - - -3)。
(一)
(b)
(一)
(b)
(一)
(b)
SGD引起显著减少细胞生存能力6 - 12 h后,与对照组相比(数字1- - - - - -3)。如数据所示2(一个)- - - - - -2 (b)、治疗与板式换热器导致显著和浓度增加细胞缺血性侮辱后6 h(可行性在100μg / mL)和12 h (在200μg / mL)。
显著和浓度增加细胞生存能力被认为与PAE缺血性侮辱后治疗后6 h (在200μg / mL)和12 h (在400μg / mL)(数据1(一)- - - - - -1 (b))。预处理和PJ也显著剂量依赖性降低SGD-induced细胞死亡后6 - 12 h (在400μ克/毫升,在800μg / mL,分别地。,数据3(一个)- - - - - -3 (b))。
3.3。板式换热器,PAE, PJ显著减少SGD-Induced DNA损伤
在这项研究中,尾部DNA百分比作为DNA损伤的指标来衡量。结果表明,接触的PC12细胞SGD显著增加DNA碎片(DF),相比之下,控制细胞(,图4)。显著降低SGD-induced DF被认为与高剂量预处理后(400年,800μ板式换热器的g / mL), PAE, PJ (,图4)。
(一)
(b)
(c)
4所示。讨论
缺血性中风是第三大死因和残疾的主要原因在工业化国家。目前,治疗方案治疗中风的有限,以及更多正尝试找出小说与凋亡神经保护药物属性(23,24]。
氧化损伤和凋亡诱导细胞死亡是许多神经退行性疾病的特征包括缺血性中风(25]。在这项研究中,的保护作用石榴(石榴)对血清/葡萄糖剥夺——(SGD)在PC12细胞中诱导细胞死亡是这里第一次调查。我们表明,石榴展品没有细胞毒性对PC12细胞在使用浓度(最高可达800μg / mL)。此外,我们发现,预处理与不同石榴提取物显著降低细胞损失和DNA损伤SGD条件下浓度的方式,这可能表明,神经活动的石榴通过衰减的DNA损伤介导的。
SGD被认为是一个可靠的模型模拟体外缺血的影响。洛伦兹等人相比SGD体外的有效性,与永久性大脑中动脉阻塞(MCAO)体内。SGD 4 h half-maximal诱导神经细胞死亡,而同期MCAO导致显著的神经损失,建议SGD的有效性作为一个合适的类似中风的体外模型(26]。在我们的研究中,约50%和65%细胞损失SGD条件下6小时和12 h,分别,这是与之前的报道相一致16,26,27]。先前的研究也符合我们发现SGD 18或24 h造成重要的DNA碎片在PC12细胞的细胞核28,29日]表明凋亡/坏死细胞死亡。
人们普遍认为,许多神经退行性疾病如缺血性中风的病理生理基础可能是介导通过谷氨酸会引起生产过剩的氧自由基(ROS),生成的氧化损伤细胞大分子,包括膜脂质、蛋白质和核酸,神经炎症,延迟细胞死亡或凋亡诱导30.]。
p . granatum有强大的抗氧化和消炎作用。根据先前的研究,石榴多酚包括酚酸的重要来源,鞣花单宁(punicalin, punicalagin gallagic,和鞣花酸),flavnoids(花色苷、儿茶素、芦丁、epigallocatechin-3-gallate),和花青素(花翠素、氰化和天竺葵色素)(31日- - - - - -33),具有强大的抗氧化和游离基清除剂性能(21,34,35]。最近的研究表明,神经保护提供石榴可以归因于这些酚类化合物的抗氧化或其他属性。因此,板式换热器的总酚浓度,PAE, PJ Folin-Ciocalteu决定的方法。结果表明,板式换热器显示最高数量的多酚化合物(353毫克/克TAE)而不是PAE(224毫克/ g)或PJ (119 mg / L)。这些结果与之前的报道相一致表明,石榴皮和果肉总酚醛物质和抗氧化活性高于果汁(36,37]。Yasoubi在人还发现了酚醛树脂在石榴皮提取物的浓度取决于溶剂的极性。结果表明,酚醛材料酒精萃取物中比在水提物(38]。它已被证明可水解的单宁(HT)约占92%的石榴抗氧化活性(39]。主要石榴HT是punicalagin负责大约一半的石榴总抗氧化能力(40,41据报道),但其水溶性很低(约0.2 - -1.0%)42]。类黄酮和单宁也最丰富的石榴果肉提取物(即板式换热器和PAE)。我们的研究表明,板式换热器对SGD最有力的保护作用比PAE PJ,这可能是由于较高的酚类含量与鞣花单宁等更少的水溶解性没食子酸和punicalagin [43]。另一方面,PJ的保护作用与SGD可以解释为花青素的结果,是水溶性色素负责明亮的石榴红色(32,44]。
如前所述,石榴有明显的抗氧化剂和自由基清除剂的性质。因此,石榴的保护活动对SGD看到这项研究可能通过衰减的氧化损伤介导的。这些发现是在协议与其他报告PC12细胞系,表明乙醇提取的p . granatum减轻H2O2全身在PC12细胞氧化应激。此外,学习和记忆提取抑制赤字和引起的神经细胞死亡β全身的氧化应激在小鼠海马,这也提高了行为和减少海马淀粉负荷在阿尔茨海默病小鼠模型(15,45]。Polyphenol-rich石榴汁也保护新生儿缺氧缺血性脑损伤小鼠大脑反对通过caspase-3抑制(14]。它已经表明,石榴花(pgf)补充减少氧化应激和改善损伤在糖尿病大鼠学习和记忆的表现(46]。
Punicalagin从PJ和石榴皮中提取抑制低密度脂蛋白氧化和小鼠动脉粥样硬化发展47]。每日补充与石榴饮食也可以控制的迹象和症状类风湿关节炎患者由于其抗氧化能力(48]。结果表明,石榴成分承受化学预防对hepatocarcinogenesis通过抗氧化性能49]。
石榴果实提取的类黄酮素丰富的分数也可以发挥antiperoxidative效应,降低丙二醛的含量和氢过氧化物和提高酶过氧化氢酶的活动,超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶,和肝脏中谷胱甘肽还原酶(50,51]。得出石榴独特的酚类化合物的抗氧化特性,punicalagin和没食子酸,可能是相关的,至少在某种程度上,他们的刺激影响巨噬细胞paraoxonase 2(彩球2)表达式,这一现象被证实与转录因子的激活有关地表铺面γ和AP-122]。的其他机制可能归因于石榴保护作用是肥大细胞稳定和抗炎的行为。的石榴力量在改善结肠炎是归因于其鞣花酸丰富的分数(21]。其他研究已经表明,prodelphinidins出现在石榴水果抑制cyclooxygenase-2 (cox - 2)和脂氧合酶活性和生产前列腺素E2(铂族元素2)在体外显示石榴的消炎52]。最近,它已经表明,石榴提取物抑制炎性细胞因子il - 1的表达β和il - 6在辅助牙周治疗(53]。NF -κB是一种重要的炎症细胞因子基因表达和转录监管机构在免疫和炎症反应中扮演着关键角色。它已经表明,预处理与石榴提取物抑制我的退化κBα和NF -核易位κ在KU812 B细胞(54]。methanolic石榴果皮提取物的抗氧化能力(PPE)及其与抗增殖和凋亡对MCF-7人类乳腺癌细胞的影响评估,结果表明,它具有显著的抗氧化和凋亡的影响55]。石榴的水杨酸成分(高卢和鞣花酸)诱导p53、p21表达,G1逮捕和细胞凋亡在膀胱癌细胞(56),以及人类前列腺癌du - 145细胞系(57]。此外,它已经表明,石榴汁代谢物,鞣花酸,urolithin协同抑制细胞增殖和诱导细胞周期阻滞和细胞凋亡在du - 145和曲泽androgen-independent前列腺癌细胞(58]。也报道,其他有效成分的石榴像原花青素,花青素有抗癌的作用通过反血管增生,抗诱变剂的活动(59,60)和抑制环氧酶活动,一氧化氮生产,表皮生长因子受体(61年]。最近的一项研究也提供了证据,石榴植物化学物质发挥对diethylnitrosamine-induced鼠肝细胞癌化学预防通过抗增殖和proapoptotic机制调节NF -κB和Wnt /β连环蛋白信号通路(62年]。
最后,我们得出结论石榴对SGD-induced有保护效应细胞毒性在PC12细胞中通过其抗氧化活性和随后的DNA损伤,建议其antiapoptogenic属性。但是还需要进一步的研究来阐明这些有利影响的可能的潜在机制(图5),以及是否在石榴中提取物质在中风应该考虑可能是有用的。
利益冲突
作者宣称没有利益冲突。
承认
作者欣然承认副校长办公室马什哈德大学医学科学研究的财政支持。