文摘
部分肝切除术后肝再生(PHx)是维持体内平衡的生理反应。本研究的目的是调查的影响Elephantopus痂l . - - - - - -(ESL)诱导肝再生生长因子(HGF和igf - 1)、细胞周期调控和细胞凋亡抑制。在这项研究中,我们喂五中药材(1克/公斤/天)种植党参(CP、党参)、丹参Bunge(丹参、SMB),柴胡属kasiChaihu (BK),Elephantopus痂L。(ESL Teng-Khia-U),水飞蓟素(Sm, 25毫克/公斤)7天男性Spraue-Dawley老鼠。然后外科2/3 PHx和肝再生机制进行估计在接下来的24小时,72小时。生长因子(HGF和IGF-I)的活动和细胞周期蛋白免疫印迹和rt - pcr检测。组织学分析和细胞凋亡被)染色和TUNEL检测。结果表明,提取的Elephantopus痂L。(ESL)和水飞蓟素(Sm,积极控制)HGF和igf - 1蛋白表达水平增加导致细胞周期。这些结果表明,英语发挥着至关重要的作用在细胞周期肝再生和细胞凋亡。这些结果表明,英语发挥着至关重要的作用在细胞周期中肝再生和抑制肝细胞凋亡。
1。介绍
肝脏是一个优秀的组织接受手术切除时对增长的监管。肝细胞再生能力的补偿性增长的过程,然后回到静止状态(1- - - - - -3]。肝的调查机制的增长大部分已经完成部分肝切除术(PHx)。大多数肝癌患者有部分部分肝脏手术。手术后,肝细胞再生和细胞数量增加。本机肝细胞功能不能维持整体肝功能。因此,我们建议中国草药可以作为细胞周期进展代理。另一方面,水飞蓟素被用于保护肝脏代理为cytoprotection用于治疗肝脏疾病。cytoprotection机制几件物品已经被确认,但肝切除并没有被报道。在体外和动物研究表明,水飞蓟的活性成分,水飞蓟素,促进肝细胞再生和生存4]。在这项研究中,我们建议水飞蓟素作为一个积极的控制。几乎立即PHx之后,有重大变化在完整的肝细胞有丝分裂原表达式和一个相对大量的基因的表达。TGF beta1是一个强有力的对手终止的促有丝分裂的影响肝细胞的增殖反应在肝再生(5- - - - - -7]。
在这项研究中,我们发现传统中药,如种植党参(CP),丹参Bunge(SMB),柴胡属kasi(BK),Elephantopus痂L。(ESL),水飞蓟素(Sm)对肝再生的影响。种植党参是一个在中国广泛食用中药(TCM) (8]。一些研究评估,CP会更刺激的生存信号(9),控制细胞周期(10],antiscar形成。鼠尾草miltorrhiza Bunge根也是一种中药,这被认为是促进血液循环,消除血瘀。一些研究表明,SMB人类肾脏保护作用可能是通过抑制炎症细胞因子和长期以来一直用于治疗肝脏和心脏疾病在中国(11,12]。最近的论文表明,SMB起着辅助的作用在抑制增殖和anticarcinogenesis。柴胡属kasi是一个最重要的中国传统药材(13,14)治疗肝炎疟疾和间歇热。它舒缓的肝脏的功能。汉堡王在抗细胞因子的水平和antifibrosis [15]。Elephantopus痂L。是台湾的民间药物来源于整个植物的Elephantopus痂L。E mollis到了K和Pseudeelephantopus spicatus罗尔(爵士乐)。然而,一些研究阐明台湾民间药。英语有王亚南效果(16]。有一些研究表明,英语对多种癌细胞对抗癌作用,诱导癌细胞凋亡从细胞周期阻滞17,18]。
众所周知,部分肝细胞癌患者需要部分部分肝脏。同时,肝脏需要扩散保持原来的肝质量。我们发现可能的分子机制对这些中药通过检查外部和内在的信号机制的水平。肝脏可以精确控制其增长和质量经过手术切除的肝叶或肝细胞造成的损失。肝细胞复制而扩大肝质量是纠正了细胞凋亡。再生需要防止细胞毒性细胞因子TGF-beta1。此外,广泛的肝细胞外基质重塑发生PHx后不久。已经提出几种生长因子发挥至关重要的作用在肝脏再生治疗后中医。HGF被认为是肝再生中发挥主要作用,促进细胞增殖,生存,并通过调节DNA合成形态发生。下游的肝细胞生长因子受体激活FAK(粘着斑激酶),在信号转导过程的一个重要中介细胞周期的规定,生存和调节细胞周期进展(19,20.]。然而,我们也发现细胞凋亡表达通过检查从线粒体细胞色素c的水平和不良发现细胞丢失。
2。材料和方法
2.1。动物
男性Sprague-Dawley老鼠重180 - 220克从动物屋获得国家科学理事会在台湾,和房子五笼在一个房间的温度控制°C,约60%的相对湿度和免费获取标准的食物颗粒和tapwater。两个或三个笼子被随机分配到同一组。所有的老鼠都与会开始前1周的实验。
2.2。从中医中药制备热水提取
热水提取准备与蒸馏水通过煮干根1 h。提取是过滤、冻干、并将其保持在4°C。收益率的提取种植党参(CP,党参)21.34%21),鼠尾草miltiorrhizae Bunge(SMB,丹参)16.95%22),Buplearum kaoi(汉堡王,Chaihu) 23.24%23),Elephantopus痂L。(英语,Teng-Khia-U) 11.84%20.),而水飞蓟素(Sm) 16.73%24]。干提取溶解在蒸馏水之前使用。
2.3。实验部分肝切除术(PHx)和假(0人力资源)
三个随机选择的动物被用于每个时间点。后注射氯胺酮皮下注射的剂量30毫克/公斤,肝切除术组成的2/3肝脏质量进行部分肝切除术组。动物接受相同的手术麻醉部分肝切除术(PHx)组25]。所有的外科手术都做PHx一样,除了肝脏叶没有切除。的所有操作进行上午8:00至12:00 PM日影响降到最低。完成程序后,动物被放置在灯下防止hypotermy然后放在一个笼子里每笼动物(5)连续供应食物和水。PHx和相应的动物是牺牲在6小时,24小时,72小时,168小时后操作。未行手术的动物群体,被用作控制肝组和提到时间量化组“0”。所有的动物都是由颈椎脱位牺牲后,残余肝脏叶切除,在PBS洗,然后立即在液态氮冷冻。
2.4。组织学分析
所有组的大鼠的不同部分时间在0小时,6小时,24小时,72小时被牺牲了。肝脏部分被固定在10%福尔马林和嵌入石蜡。石蜡块切成5毫米部分和彩色Hematoxylin-eosin(圆))解决方案染色(26]。水飞蓟素(Sm, 25毫克/公斤)口服填喂法PHx后0小时,6小时,24小时,72小时也牺牲和固定染色和染色)解决方案。
2.5。Transferase-Mediated dUTP尼克结束标记(TUNEL)
左心室部分被沉浸在二甲苯deparaffinized,水化,孵化2% H2O2内生氧化物酶灭活。部分被孵化与蛋白酶K (20μg / mL),蛋白质K,工作解决方案:[10 - 20 ug /毫升10毫米三羟甲基氨基甲烷/盐酸,液pH值7.4 8]。使用蛋白酶K从罗氏应用科学,因为它是检测核酸酶的缺失可能导致假阳性结果(27,28]。用磷酸盐和孵化末端转移酶90分钟和荧光素isothiocyanate-Dutp为30分钟37°C使用细胞凋亡检测设备(29日]。水飞蓟素(S, 25毫克/公斤)Elephantopus痂L。(ESL)口服填喂法PHx后6小时、24小时,72小时也固定和染色设备。样本分析了一滴PBS荧光和紫外线显微镜下在这个状态的激发波长450 - 500纳米的范围。
2.6。免疫印迹
蛋白质12% sds - page分离,然后转移到硝基。膜被封锁在5%牛奶(稀释Tris-buffered盐水和0.1%渐变20)和适当的初级抗体(TGF孵化β1 HGF IGF-I,细胞周期蛋白D1,细胞周期素E,复审委员会,细胞色素c,坏,和E2F)一夜之间在4°c和合anti-IgG被用作辅助试剂。广泛的洗涤后,目标蛋白质被增强化学发光检测(ECL) [30.]。
2.7。逆转录酶聚合酶链反应(rt - PCR)
0.5μ克总RNA来源于肝脏加上rt - pcr引物。第一链合成装备应用PCR根据制造商的指示。用于每个基因的引物对如下。(1)细胞周期蛋白D1: F: 5′AGGAGACCATTCCCCTGACT3′R: 5′TTCTTCCTCCACTTCCCCTT3′(2)复审委员会:F: 5′AGGAGGACTGTTCTCTAAGG3′R: 5′GAGTGAGGTGTGTCTTCTGA3′(3)E2F: F: 5′AACATCCAGAACATCCAGTGGGTAGGC-AG3′R: 5′GGCTGTCAGTAGCCTCCAAG3′(4)细胞周期素E: F: 5′CACCCCTGGCATCTTCTCCTT3′R: 5′AGCGTCTTCAGAGACAGCCAG3′(5)细胞色素c: F: 5′ACAGCACGCTTGTGGAT3′R: 5′GTCTTCAAGCAAGAGGACCA3′(6)缺点:F: 5′TAAGACTCACCTGGGTACTG3R: 5′GCATGTAGTCACTCTTCACC3′(7)GAPDH: F: 5′GGGTGTGAACCACGAGAAAT3′R: 5′CCACAGTCTTCTGAGTGGCA3′
rt - pcr结果进行分析评估的基础上的产品尺寸在溴化乙锭琼脂糖凝胶电泳。对于每一个基因,我们确定的周期数目PCR反应的PCR反应是不饱和31日]。在此基础上,我们使用了PCR条件后,最初的变性步骤是在95°C,然后在退火温度和扩展在72°C。最后在72°C扩展10分钟是适用于所有反应和PCR产品1.2%琼脂糖凝胶电泳。
2.8。免疫印迹和rt - pcr的量化
个人的强度(面积×密度)乐队在西方印迹和rt - pcr是衡量微(32]。背景是减去计算区域。
2.9。统计分析
检查所有的数据被表示为均值±S.E.免疫印迹和rt - pcr分析,定量是由扫描和分析杂交信号的强度使用富士胶片想象程序。统计分析的数据是使用SigmaStat执行软件。对比组使用一维方差分析测试(32]。一个值小于0.05和0.01被认为是具有统计学意义。
3所示。结果
3.1。建立肝再生动物模型部分肝切除术
2/3肝切除术后肝再生过程中,肝细胞分裂一次或两次,回归平静。我们发现中国草药的作用在PHx后肝再生的过程。我们建议中国草药可以作为细胞发展代理,使细胞进展。cytoprotection机制几件物品已经被确认,但肝切除的机制并没有被报道。外科切除术切除肿瘤与周围肝组织,同时保留足够的肝脏剩下正常的身体机能。PHx之后,我们发现肝脏再生在24小时开始,增加肝脏质量(图1 (b)),直到72小时和168小时。然而,肝脏再生(%)增加24小时,72小时和168小时PHx(数字1(一),1 (b),1 (c))。更常见的,在肝再生肝脏是受伤,它试图修复受伤的网站称为内部尽快疤痕组织。细胞因子,TGFβ1、增加血浆不久时间动力学然后下降,但在长时间增加(图1 (f))。TGFβ1增加达到高原PHx数量在72小时。肝细胞增殖和细胞凋亡被TGF协调调控β1。TGFβ1蛋白表达增加了治疗的SMB, CP, ESL, Sm在24小时PHx。然而,在72小时TGFβ1只增加了CP、ESL和Sm(图1 (d))。水飞蓟素诱导TGFβ1在6小时PHx下降(而虚假的),但增加72小时(而虚假的;对PHx)。水飞蓟素减轻再生,使细胞正常。在长时间,我们没有发现凋亡的身体在肝脏再生(图1 (e))。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(g)
3.2。Elephantopus痂L。2/3 PHx后立即全身的生长因子增加
生长因子信号(HGF和IGF-I)扮演一个角色在启动2/3 PHx后肝细胞的再生。我们建议中国草药作为细胞周期进展特工可以启动细胞进展通过循环并接受DNA合成。然而,通过细胞周期进展超出了起始阶段需要生长因子。立即开始表达大量的生长因子在再生阶段,肝细胞能够充分应对生长因子(HGF和IGF-I)刺激细胞周期G1期S期增加DNA合成和重建失去的肝组织。ESL和Sm增加HGF和IGF-I蛋白表达(图2)(,PHx versusSham)在24小时和72小时PHx。此外,水飞蓟素(Sm)诱导胶质瘤增加与虚假的或PHx尽管6小时,24小时,72小时PHx (而虚假的;对PHx)(图3(一个))。
(一)
(b)
(c)
3.3。Elephantopus痂L。加速细胞周期在肝脏再生
细胞周期蛋白D1 /复审委员会和细胞周期素E / E2F G1-to-S阶段的关键调节细胞周期的进展。我们发现细胞周期蛋白D1增加24小时和72小时PHx ESL和Sm (,versusSham);然而,复审委员会只有在Sm处理增加(数据2(一)和2(c))。积极的控制,水飞蓟素允许增加6小时,24小时,72小时PHx而虚假的(,而虚假的)和PHx (,与PHx(图3 (b))。此外,细胞周期蛋白D1、细胞周期素E、复审委员会,E2F mRNA表达水平增加72小时PHx ESL或Sm治疗(,和虚假的)。相同的结果我们发现Sm与虚假和PHx(图相比也增加了3 (c))。
3.4。的影响Elephantopus痂L。在PHx后细胞死亡
肝损伤后肝再生过程中,肝细胞丢失。细胞死亡或凋亡是调节肝细胞的生理过程开发和维护肝脏质量。我们检测到凋亡蛋白质坏和细胞色素c在24小时和72小时(数字5(一个)和5 (b))。细胞凋亡发生快速PHx细胞分裂后,导致肝脏大小的微调和组织重构。因此,结果表明Elephantopus痂l . (ESL)和水飞蓟素(Sm)诱导坏和细胞色素c蛋白mRNA表达下调(,和虚假的)。此外,TUNEL分析显示凋亡体只有在长时间72小时PHx包括水飞蓟素治疗(图4)。在合同中,我们也观察到凋亡的身体在传统中药。我们并没有发现凋亡在ESL和Sm治疗身体长时间72小时PHx。我们没有发现任何24小时PHx凋亡的身体在中医治疗。
(一)
(b)
(c)
4所示。讨论
肝脏是最复杂的器官之一,和再生手术引起的损伤是一个精心策划的回应。为了设置最佳的质量关系到它的体型,肝脏诱导其代偿增生的机制。草药已被用于治疗肝脏疾病在东方几千年来,在国际上已经成为一种很有前途的治疗肝脏病理条件。生长因子(HGF和IGF-I)和细胞因子(TGFβ1)细胞周期进程引发G0期G1期。肝细胞生长因子,也称为散射因素,被认为是肝再生中发挥主要作用。生长因子可能发挥作用在启动后肝细胞的增殖PHx大鼠肝脏外科切除后立即进行调查。在本文中,我们假定,中国的药品包括种植党参(CP、党参)、丹参BungeTanshinone (SMB),柴胡属KasiChaihu (BK),Elephantopus痂L。(ESL Teng-Khia-U)水飞蓟素(Sm) PHx后可以促进肝脏再生的功能。
我们发现ESL (Teng-Khia-U)和水飞蓟素(Sm)有最好的对肝再生的影响。在目前的研究中,ESL的毒性研究他们发现根提取物是无毒的,没有造成死亡的剂量口服(3.2克/公斤24]。它是安全的,并用于本研究的剂量。两个已知化合物,isodeoxyelephantopin和deoxyelephantopin [33,34),从整个工厂被孤立Elephantopus痂L。(ESL Teng-Khia-U) (35]。整个工厂的ESL丰富新颖的抗肿瘤substances-sesquiterpene内酯。ESL的植物提取物有能力影响程序性细胞死亡或被捕肿瘤细胞扩散。我们发现英语和Sm刺激一些生长因子调节细胞周期、DNA合成。生长因子是paracrine-regulated肝再生反应(36]。HGF的活性形式是一种强大的刺激器的DNA合成和细胞活性(37,38]。PHx触发鼠肝细胞进入细胞周期。我们发现ESL (HGF和IGF-I)诱导growth-regulated基因表达后,持续时间更长,并联的快速增长阶段后肝脏PHx [39,40]。最大的表情后24 - 72小时最大增长周期结束时,被认为是参与重建静止。因此,我们可以发现,ESL介导生长因子(HGF和IGF-I)和细胞因子(TGFβ1)在24小时PHx改造肝,但未能在72小时PHx。然而,其他中药也增强细胞因子表达在此期间(41- - - - - -45]。因此,PHx细胞随周期变动的监管和G1发展潜在的生理作用。后肝脏增长PHx不涉及细胞死亡,是一个纯粹的增殖活动。总之,我们的数据显示肝再生可能调节细胞周期动力学级数在G1年代相变(46,47]。然而,我们发现英语诱导生长因子和细胞周期表达在24小时到72小时。因为英语也许延迟凋亡[48,49]。
总的来说,信息因此派生应该增强我们的知识对肝脏再生治疗中药的功能以及细胞周期和细胞凋亡的基本机制50,51]。
缩写
| HGF: | 肝细胞生长因子 |
| PHx: | 部分肝切除术 |
| IGF-I: | 胰岛素样生长因子I |
| CP: | 种植党参 |
| 汉堡王: | 柴胡属kasi |
| 英语: | |
| SMB: | 丹参Bunge |
| Sm: | 水飞蓟素 |
| UPA: | 尿激酶纤溶酶原激活物 |
| 中药: | 传统的中药。 |
作者的贡献
c c。蔡和j。吴同样导致了这项工作。
确认
作者曾参与本研究宣称,他们没有任何披露有关资金或利益冲突。本研究支持部分由台湾卫生部临床试验和研究卓越中心(doh101 - td - b - 111 - 004)。